羧基化聚苯乙烯的制备和应用研究_百度文库
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羧基化聚苯乙烯的制备和应用研究
聚​苯​乙​烯​ ​羧​基​化
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于上海地区不同动物源隐孢子虫种型鉴定及微小隐孢子虫CP15和P23基因的克隆和表达的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：上海地区不同动物源隐孢子虫种型鉴定及微小隐孢子虫CP15和P23基因的克隆和表达 新疆农业大学硕士学位论文上海地区不同动物源隐孢子虫种型鉴定及微小隐孢子虫CP15和P23基因的克隆和表达姓名:米荣升申请学位级别:硕士专业:预防兽医学指导教师:岳城;陈兆国摘要隐孢子虫是一种严重危害人和动物健康的寄生原虫,广泛寄生于人、哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的消化道和呼吸道中,引起腹泻等症状。对免疫功能正常的动物,腹泻可自限,但免疫功能缺陷时,常表现水泻不止甚至死亡。隐孢予虫不同种性状有别。寄生宿主的对象不一。本研究利用PcR-RFLP技术成功鉴定了本实验室收集的上海地区分离的鼠源、兔源、鸡源、猪源、牛源隐孢子虫虫种和基因型,共有3个虫种和3个基因型,其中鼠源隐孢子虫虫种为微小隐孢子虫鼠基因型(C硼r嘲Mou∞gc∞typc);兔源隐孢子虫虫种为微小隐孢子虫兔基因型(C卵rMRabbitgenoIypc);猪源隐孢子虫虫种为微小隐孢子虫猪基因型Ⅱ(c≯口rM Pig g%otype lI);鸡源隐孢子虫虫种为贝氏隐孢子虫(C妇岫f);牛源隐孢子虫虫种为安氏隐孢子虫(c:∞如Mf)。成(来源：淘豆网[/p-4233786.html])功克隆了上海地区分离的微小隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ和安氏隐孢子虫的子孢子表面抗原a,15基因,其编码基因为大小为357bp,编码119个氨基酸残基,不同来源的CPl5基因序列高度一致。其中安氏隐孢子虫的CPl5基因成功克隆为本研究首次报道。成功克隆了上海地区分离的微小隐孢子虫鼠基因型、兔基因型和猪基因型Ⅱ的子孢子表面抗原P23基因,大小为342bp,编码113个氨基酸,不同来源的P23基因序列高度一致。成功构建了微小隐孢子虫鼠基因型的原核重组表达质粒pEI:28a(+)-cPl5和pEl:28a(+)—P23,实现了CPl5和P23基因在大肠杆菌中的表达。EusA初步分析表明CPl5和P23基因具有良好的抗原性。上述工作的进展,为逐步查明上海地区目前流行的隐孢子虫病原种类、掌握隐孢子虫病流行状况和特点提供了基础,具有重要的公共卫生学意义。隐孢子虫子孢子表面抗原(T15和P23基因的成功克隆和表达,为进一步利用基因的表达产物进行免疫预防和诊断研究提供了条件。关键词;隐孢子虫,虫种和(来源：淘豆网[/p-4233786.html])基因型,CPl5和P23,克隆和表达ⅡAbstractD辫哺D印D,谢h肼spp.isapmt啪柚p缸船沁柚ditis ham删scv盯elytomen柚d柚ilnals.Itgraws in印itbelial∞lls粕d a∞of蚴,卸inlakbirds,cr∞pe地s or五sh黜粕d it强us船dia仃hea.o弦细舻蒯豇肼spp is hawn to bc llbiquit0璐柚d tobave m柚y hos忸.nedi柚ea c蛆be cll佗by themseIV嚣about n把∞瑚丑1 i枷une peopk,but when pc叩lc who hdimmunc de石ciency,the dia曲ea瑚ybe∞rious eVen啦to deam.11lc砖werc diffemnt cha豫cIcristics柚d hosIes about c,印fD妒D,趔埘l spp.The species柚dgenoty】pes of(幻p旭妒讲谢赴删spp.i∞lated (来源：淘豆网[/p-4233786.html])from Inou∞,mbbiL chjcken,pig如d da_iIy calVes inShanghai distrid靴埠id印ti矗ed by北stcd polymen∞chain∞action linkcd f豁岫dion劬gmentlengIh polymorphism口cR-RFLP).Thc北sults sh蝴cd mat mem ics and衄∞genotyp岱,c,)p坳—拙肼spp.、曲ich∞mesf曲m Inou辩w祜o.):础鸲印r￡执mp4mV埘l Inou∞genoty】昨,m1咖nw私。卯f掣砌iMmP4my删ralDbhgenatype,ehickenw抟。唰讲p俐{啪蚰啦吵,刚inew硒o)5f呦警研刮l堋lpaM似mpiggenotypeⅡ柚ddaif)r calVesw勰。卯舰￡pD一一d“m口眺rsDni.1k sporo∞iIe蛐rfa∞柚ngen a’15 gcne which涨nDm C册mV啪mDu辩gc∞type,C,4,口嗍瑚由bn (来源：淘豆网[/p-4233786.html])genotype,C p4r口V聊l p唔gc∞ty】pc II柚d C口耐e坤n耐were跚。ce豁llIl锄plifiedand en∞ded 119卸1ino acids.oyptospofidium spp.伽e蕾巾m di矗e姗t∞urc髓had ahighlyhom∞Iy柚d C 4,l‘把噶钾f w髂痂僦&pon in this expriment.1色e s岬oites曲∞蛐Ⅱgen P23 gc的啊rhich c锄e hDm C p4阳vl删啪u∞ge∞tylx,Cp4,m硼l功bbn ge∞lyI圮柚d C即r口v堋pig ge∞type Il骶佗sucoessfIIl a唧lificd柚d en∞ded113 alnino解ids.Cryplosporidi岫spp.can璩丘Dm difce砖nt∞ur∞s had ahigMy hom∞ly.ne prol【aryo虹c tor pEl:28a(+)一CPl5柚d pⅢ二28a(+).P23 we砖c0螂衄c(来源：淘豆网[/p-4233786.html])tcd粕d e珥鹏豁酣in ssfuliy.B0th ofth锄had aweu知Ⅱgenic时which柚alyzed byEUSA.Tk develop咖t of o叫exl崩蛔ts we had do∞w叫1d much helpful to blaw仙呛disea辩∞ufces柚d印idclnic∞nditio璐about o弹胁妒甜诚聊l spp.in sh柚ghai districI'柚d had柚inlportant辩n∞about pub№hy画e0109y..Ihe spo∞zo沁辄ffa∞ CPl5粕d P23 g∞ewhichwe∞豁fIIld衄ed nligllt bemuch helpfIll蠡ofthe next哪k of惦ingthe辩ge啷todeveJop aiIllⅢunoprophyI脚s or detedion technique.1时words:o”觚妒r触沁小,sped船柚d ge∞typcs,CPl5柚d P23,d伽_ing柚d e印佗豁(来源：淘豆网[/p-4233786.html])ion.m英文缩略表Ⅵ独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名: 时间:印年易月—切日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文,允许论文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以公布(包括刊登)论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名:毕辱彳翩幽魂“导师签名: ”扩.。k\,时间:印年g月如日f、时问: 9 7年莎月z汐日赣疆农业大学硕士学位论文第一章文献综述隐孢子虫病(来源：淘豆网[/p-4233786.html])研究概况隐孢子虫病(crypI稍删diosis)是一种人畜共患、广泛存在的寄生原虫病,是仅次于轮状病毒的主要肠道疾病。隐孢子虫广泛寄生于哺乳动物、禽类、两栖类,鱼类及人的消化道及呼吸道中,引起动物腹泻和隐性感染。对免疫功能正常的动物来讲,腹泻可自限,但免疫功能缺损时,常表现水泻不止甚至死亡。该病已被列入世界最常见的六种腹泻病之一,由于隐孢子虫机会性感染引起的腹泻是加速艾滋病患者死亡的重要原因之一。目前国外已把隐孢子虫列为艾滋病患者的常规检查项目之一【1】.’过去,由于隐孢子虫感染引起的病症有时不太明显或与其他病症混淆,特别对宿主免疫功能低下时感染隐孢子虫造成的严重危害认识不够,故相当长时间内关注不足,防治措施不力。随着研究的发展,特别是美国1993年威斯康辛州Mnmuk∞爆发的40.3万人感染隐孢子虫的重大公共卫生事件的出现”,深刻警示人们:积极加强隐孢子虫病的研究具有重要的社会和经济意义。1.1隐孢子虫的分类1907年,T)嘞首先在小鼠的胃腺上皮细胞内发现了一种细胞内寄生的原虫,并命名为隐孢(来源：淘豆网[/p-4233786.html])子虫(D印衄弘耐托Ⅲ)f,J.目前,隐孢子虫分类学地位基本明确,为原生动物亚界(SubldngdⅫP∞妇m),顶复合器门(Apico唧lcxa),孢子虫纲(Spo∞∞asida),球虫亚纲(idia),真球虫目(idiofida),艾美球虫亚目忸ime曲rina),隐孢子虫科(C呻lospofidndae),隐孢子虫属(c,弦幻卵r勰“m).隐孢子虫属内尚没有统一的分类标准,主要原因是隐孢子虫种间在形态学方面非常相似,且没有严格的宿主特异性,造成分类的混乱。传统分类方法是利用形态学差异、宿主特异性作为依据,但在无明显上述差异时,这些标准就会随着宿主变化而变化,而且还与专家的解释有关。目前,至少有13个隐孢子虫虫种得到公认,其中寄生于哺乳动物的有7个虫种,它们是:c卅球廊毗掰,190r7【1I: c彤,’似m聊zef,1912【4l;c啪耐Vctlerling’Jcrvis,卜海地屏不商动物潺聪孢于虫种塑鉴定及微小聪孢}虫cPl5和P23摹魄的克降和表达Mefrill柚d sprint,1971(来源：淘豆网[/p-4233786.html])嘲;C归如lse“,1979【q;C 4m蛔喁伽“jnd姐y,upIon,Owens,Morgan,Mcad柚d Blagb啪,20000,J.c叩H西Fhyer,T如ut,xiao,Morg柚,I且l and Dubcy,2001柳;C^硎加豇Mo唱柚.R”n,FaⅡ,ward,Hijja丽,SIllai删m,Fayer,n伽ps∞,Olson,Lal柚dⅪao,2002【9】;寄生于鸟类的有3个虫种,它们是:c me触咿诚s shvin,;c幻i姆f olrr∞t,up“∞and mynes,1986【11】;c弘埘Pavla∞k,1999【12】;寄生于爬行动物的有2个虫种,分别为:cMp∞如mi∞,;C∞“仰^f妇n l(‘mdeh∞d M嘶,1998【14】;寄生于鱼类的有1个虫种,为cmD妇一AIva&z-PemtcroⅫdsj“a_Bobadma,。上述13个有效虫种的形态学特征及主要宿主见表1.1。随着分子生物学技术在隐(来源：淘豆网[/p-4233786.html])孢子虫分类中的应用,又提出了基因型的概念,但目前隐孢子虫基因型的命名在很大程度上还是依赖于宿主,即当发现与现有种型的基因存在显著且稳定的差异时,就会根据所分离的隐孢子虫的宿主来命名一个新的基因型,如c册nmⅢmou∞g%o‘ypc(鼠基因型)、c.p口n,Ⅲfemtg∞o够pc(雪貂基因型)等。在公认的13种隐孢子虫中,c小“廊,c5P伊删凼,C删印而f如期,ck脚f,Cme如廿g谢担和C4硷九御l在分类学上是十分明确的,它们彼此的卵囊形态、感染部位以及宿主在脊椎动物中的分类均不同。其他种,如CH,r口衍、C和船、C∞”妇、C^Ⅲ加缸,均先被认为是C即rM的不同基因型,而后最终被确认为新种的【…。2衰卜1隐孢子虫形态学特征及主要宿主TaMe.1·1·tk morpholo嚣吐anc把r姐d恤e埘ofo埘D妒D,谢f删l spm新疆农业大学硕+学位论文1.2隐孢子虫的流行病学隐孢子虫可以感染从热带到温带的170多种动物【ll,呈世界性分布,除南极洲外,各大洲均有报道,美国、英国、加拿大、澳大利亚、丹麦、荷兰、德国等已证明在犊牛,羔羊、仔猪中广泛流行n71.宿主之间直接接触或因环境,食物、饮水的间接污染而造成卵囊的传播。我国最早报道是陈义民等(1986)在兰州地区发现犊牛隐孢子虫病【18l,之后诸多学者先后在我国的台湾、广东,黑龙江、吉林、甘肃、陕西、北京、青海、四川、云南、安徽、上海、福建等省市均有报道,该病在我国各地普遍流行【1例。牛感染隐孢子虫感染一般多集中在34日龄至34周龄犊牛,个别见于8月龄小牛.法国Nadfi等(1999)调查一牛场,平均6日龄犊牛313头,其中50%排微小隐孢子虫卵囊,3州后此比例上升到84%埔6%p”。国内继陈义民等(1986)年在兰州的犊牛中首先发现隐孢子虫后fl町。相继在陕西.湖南、黑龙江、吉林、北京、云南、河南和上海等地发现牛隐孢子虫感染。李培英等(1999)报道安徽阜阳地区黄牛隐孢子虫的感染率为58.26%,奶牛为6.39%瞄捌。猪对此病的感染在世界范围内呈散发趋势,但由于大量研究都只牵涉少量的动物,故其流行性仍不明晰。不像那些通过实验诱发的感染表现出明显的临床症状,猪的自然感染绝大部分无症状.wiele∞tal等(2001)对德国南部的24个猪场有腹泻症状的205头乳猪和82头断奶仔猪进行了调查,结果在2个猪场中发现4头小猪感染了隐孢子虫,感染率1.4%【卅;刘毅等(1993)报道不同品种猪都可感染隐孢子虫嗍;张龙现等(1999)对河南郑州郊区8个猪场作了调查,其中有7个猪场隐孢子虫阳性,2月龄以内仔猪感染率为19.4%,而12月龄以上猪为12.5%,显示猪隐孢子虫感染与年龄有一定的相关性嘲。鸡可通过摄入或吸入环境中卵囊而感染(垫料、粪便、水、再生材料,灰尘),低至100个卵囊即可导致肠道和呼吸道感染,45日龄以下的雏鸡感染隐孢子虫较为严重,随着日龄增加,感染减轻。Gclodwin等(1粥9)报道,英格兰雏鸡血清隐孢子虫抗体阳性率达88%唧。国内鸡隐孢子虫的感染情况为9.8%一1∞%,各地感染率差别较大。陈兆国等(1993)对上海地区鸡鸭隐孢子虫流行病学调查结果显示:阳性率鸡为27%,鸭为58%嗍;刘毅等(1994)、周望平等(2000)调查湖南部分地区鸡隐孢子虫的感染率分别为12.1%和4.59%【8删。人隐孢子虫病爆发多见于夏末秋初,8-9月份比较集中,潜伏期一般为2.28天,平均7天.国外发展中国家和发达国家腹泻病人中隐孢子虫感染率分别为4%珈%和O.6%一20%,我国腹泻病人中感染率为1.4%一13.3%p“。韩范等(1987)在南京首次发现了人体隐孢子虫病例Ⅲ,此后徐州、福州、云南、湖南,浙江、河南、山东,黑龙江、甘肃、台北等省市均有病例报3t海地区币丽动物嚣轮孢子虫种型鐾定及微,j、砖孢予虫cPl5翻P23幕再的竟降和表达道,感染率在0.23%一13.3%之间。资料显示,1%.2%的艾滋病患者的死亡是由隐孢子虫感染造成的,高危人群如婴幼儿、免疫功能抑制者、免疫功能缺陷者的感染率高达15%49%【3≈。崔巍等(2001)p3】对潍坊南部山区儿童隐孢子虫病感染的流行病学调查发现,以夏秋季粪便中隐孢子虫卵囊检出率为最高,表明沂蒙山区隐孢子虫病的流行有季节性消长,可见,隐孢子虫病的爆发流行多见于气候温暖与多雨季节。陈永忠等(2001)对青海湟中县长毛兔隐孢子虫感染情况的调查,结果表明,仅在2.3月龄的兔发现有感染,感染率为5.1%M。李海峰等(2005)对延边地区兔隐孢子虫调查结果表明感染率为65.83%,而且隐性感染率也比较高p”。但迄今关于隐孢子虫流行病学研究报道尚少,缺乏广泛系统深入的调查观察,加强隐孢子虫流行病学研究,是搞好隐孢子虫病防制的基础。1.3隐孢子虫病的诊断目前常用的隐孢子虫病诊断方法主要有病原学诊断方法、免疫学诊断方法和分子生物学方法,其中病原学检查方法主要以浓集法和染色法为主,现仍被广泛应用,但特异性和敏感性不高,且操作步骤复杂。近年来研究表明免疫学和分子生物学技术可以用于诊断隐孢子虫感染,而且分子生物学技术如Pat和基因探针具有很高的敏感性和特异性。1.3.1病原学诊断方法1.3.1.1组织学诊断1980年以前,诊断隐孢子虫病的唯一方法是消化道粘膜活检pq。由于多数隐孢子虫在体内的发育阶段呈碱性,因此用苏木精、伊红或姬姆萨染色等方法效果较好。组织学检查虽可确诊,但有组织损伤、操作费时、敏感性低,以及价格昂贵等缺点。1.3.I.2粪便集卵法诊断主要有漂浮法和沉淀法2种9””。漂浮法包括Sheamcrk蔗糖漂浮法、33%饱和硫酸锌漂浮法、36%饱和盐水漂浮法、硫酸钾漂浮法、硫酸镁漂浮法等。沉淀法包括福尔马林一***法和福尔马林一乙酸乙酯法,但多数认为蔗糖漂浮法比沉淀法更好。Sheatlle,s蔗糖漂浮法收集的卵囊在高倍镜下观察,呈微红色,相差显微镜观察较清晰。但蔗糖黏性较大限制了卵囊与粪便杂质的有效分离,卵囊纯度不高,而且必须在15min内观察结果,否则过长时间漂浮可导致卵囊崩解,故此法不适合大批量标本检查,根据报道用一种改良福尔马林一乙酸乙酯法可以得到较高密度的卵囊。4新疆农业大学硕士学位论文lal.3染色法诊断染色方法主要有姬姆萨染色法、抗酸染色法、金***一酚染色法、齐一尼氏染色法、番红~美蓝染色法等【删。姬姆萨染色法染色对比度差,不易辨别;H锄rich∞等(1981)报道用改良zcihl-N∞ls∞抗酸染色法涂片染色后,显微镜下观察呈粉红色,背景为蓝绿色,对比性强,易于观察pq,这一方法已经被广泛应用;韩范等(1989)介绍利用金***酚一改良抗酸复染法,检出率和准确性有很大的提高M。13.2免疫学诊断近年来,国内外正在发展对隐孢子虫病的多种免疫学诊断方法。免疫学方法常有特异性强,灵敏度高、稳定性好、操作简单易于掌握等特点,故而收到人们的青睐。免疫学方法主要有免疫荧光试验(IE~)、酶联免疫吸附实验(EuSA)、免疫组织化学技术、免疫印迹技术和流式细胞术(Fc)等。Ru∞ak等(1989)报道,用m~和改良zeihl-N∞抗酸染色法对照检查了119份隐孢子虫病人的粪便,n队均为阳性,在63份染色阴性的粪便中,lFA检查61分为阴性,特异性97%【4”。UⅡgar等(1990)用羊与兔的免疫血清的双抗EusA检测人粪滤液中隐孢子虫卵囊抗原,敏感性为82.3%,特异性为96.7%,且不受8种肠道寄生虫的干扰,适用于大规模流行病学调查与诊断【42l。0ftcga等(1994)用wes衄n BIo砸ng技术,判定用自然感染和人工感染微小隐孢子虫羔羊血清识别隐孢子虫卵囊抗原,将两者比较发现一些低分子量蛋白质和一些高分子量蛋白质抗原在整个感染过程中出现的时间不周,所以该法可以推测动物感染时间阳】。Dag∞等(1994)将标记有绵阳红细胞的抗隐孢子虫卵囊的单克哮抗体检查卵囊抗原,建立了反向被动血凝试验(Rw∞甜P0%盹He衄gglu血aⅡ∞RPHA)㈣;Farrin罟细n等(1995)进一步做了IuPlIA与改良Zeihl-N∞Isen显微镜比较,RPHA敏感性92.7%特异性85.6%,阳性预测值78.4%,阴性预测值95.4%悯。AlIowood等(1995)首先把流式细胞术(Fc)应用到对隐孢子虫卵囊的检测中,他用荧光标记的抗隐孢子虫卵囊单克隆抗体与卵囊发生反应,然后用流式细胞仪计数,其敏感性要比直接荧光免疫高1¨15倍M;Valdcz等(1997)对棚ood的方法进行了改进,第1次成功进行了对人粪便样品检测M.La娜血等(1997)以可溶性卵囊为抗原和过氧化酶标记抗猫IgG为二抗建立间接EusA检测猫血清中的IgG【删;黄克和等(1999)建立了用间接EusA检测动物血清中抗体的方法【49】;尹继刚等应用双夹心.EusA对60份牛粪便样本检查,并与抗酸染色法比较发现,抗酸染S播放器加载中，请稍候...
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