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配制培养基的原则
核心提示： 配制培养基的原则
1、选择适宜的营养物质
总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的元机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成。例如，培养化能自养型的氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxdans)的培养基组成见表3.9。在该培养基配制过程中并末专门加入其他碳源物质，而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源。
就微生物主要类型而言，有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分，培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基)培养细菌，用高氏I号合成培养基培养放线菌，培养酵母菌一般用麦芽汁培养基，培养霉菌则一般用查氏合成培养基。
2、营养物质浓度及配比合适
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/l时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/l时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。再如，在抗
生素发酵生产过程中，可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。
3、控制pH条件
培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，一般来讲，细菌与放线菌适于在pH7～7.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范围内生长。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性，KH2PO4溶液呈酸性，两种物质的等量混合溶液的pH为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时，H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物，培养基pH不会过度降低；如果培养基中OH-浓度增加，OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物，培养基pH也不会过度升高。
但KH2PO4 和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH范围(pH6.4～7.2)内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，上述缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节，CaCO3难溶于水，不会使培养基pH过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出CO2，将培养基pH控制在一定范围内。
在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质，也可起到缓冲剂的作用。
4、控制氧化还原电位(redox　potential)
不同类型微生物生长对氧化还原电位(F)的要求不一样，一般好氧性微生物在F值为+0.1V以上时可正常生长，一般以+0.3一+0.4V为宜，厌氧性微生物只能在F值低于+0.1V条件下生长，兼性厌氧微生物在F值为+0.1V以上时进行好氧呼吸，在+0.1V以下时进行发酵。F值与氧分压和pH有关，也受某些微生物代谢产物的影响。在pH相对稳定的条件下，可通过增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加F值；在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低F值。
5、原料来源的选择
在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如，在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中，常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。再如，工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料，而在我国农村，已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外，大量的农副产品或制品，如鼓皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
6、灭菌处理
要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃条件下维持15～30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在0.56kg/ cm2，112.6℃15～30min进行灭菌，某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀，常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变(一般使pH降低)，可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。
在配制培养基过程中，泡沫的存在对灭菌处理极不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使泡沫中微生物难以被杀死。因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生，或适当提高灭。
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配制培养基的原则
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简述配制培养基应遵循的几个原则？
1.目的明确
培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
根据不同的工作目的，微生物不同的营养需要，运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基。2.营养协调
微生物细胞组成元素的调查或分析，是设计培养基时的重要参考依据。
微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例。
在大多数化能异养菌的培养基中，各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：
要素：H2O＞C源+能源 ＞N 源 ＞P、S＞K、Mg＞生长因子
含量：(～10-1) (～10-2) (～10-3) (～10-4) (～10-5)
(～10-6)A.选择适宜的营养物质,实验室的常用培养基：
细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；
放线菌：高氏1号合成培养基培养；
酵母菌：麦芽汁培养基；
霉菌：查氏合成培养基；
实验室一般培养：普通常用培养基；
遗传研究：成分清楚的合成培养基；
生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；B.营养物质浓度及配比合适
营养物质的浓度适宜, 营养物质之间的配比适宜；
高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。
培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累，其中碳氮比（C／N）的影响较大。真菌需C／N比较高的培养基；（素食）细菌（动物病原菌）需C／N比较低的培养基；（荤食）
发酵生产谷氨酸时：
碳氮比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；
碳氮比为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。
NH3 ＞ CO(NH2)2 ＞ NH4NO3 ＞ (NH4)2CO3 ＞ (NH4)2SO4
含氮量（82％）（46％）
（29.2％）
这说明在同样重量时，在以上各氮源中含氮量以氨为最高，尿素次之，硝酸铵和碳酸铵更次之，而硫酸铵则最低。3.理化适宜指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜。包括：pH、渗透压和水活度、氧化还原电位(1) pH
各大类微生物都有其生长适宜的pH范围，培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。
通常培养条件：（初始pH ）
细菌： pH 7.0~8.0
放线菌：pH 7.5~8.5
酵母菌： pH 3.8~6.0
霉菌：pH 4.0~5.8
藻类： pH 6.0~7.0
原生动物： pH 6.0~8.0
嗜极菌（extremophiles）
在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，为了维持培养基pH的相对恒定，通常要进行pH的调节。
pH的调节包括pH的内源调节和pH的外源调节。a.pH的内源调节:通过培养基内在成分所起的调节作用，就是pH的内源调节。 第一种是采用磷酸缓冲液进行调节。
［K2HPO4］/［KH2PO4］＝1时，溶液的pH稳定在6.8。调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH 6.0～7.6间的一系列稳定的pH。反应原理：K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KCl KH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节。CaCO3（不溶于水又是沉淀性的，在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH。b.pH的外源调节:
这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液，以调整培养液的方法。 (2) 渗透压和水活度
渗透压（osmotic pressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标。
它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时，稀溶液中的水分子会因水势（water potentiality）的推动而透过隔膜流向浓溶液，直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止，这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力，即为它的渗透压值。
与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长；
高渗溶液会使细胞发生质壁分离；
低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，形成很高的膨压，这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞，例如原生质体、球状体或支原体来说，则是致命的。
水活度即aw（wateractivity）是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标。它表示在天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量。各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998～0.6之间：（3）氧化还原电势（redox potential）
又称氧化还原电位，是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。
一般以Eh表示，它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值，单位是V（伏）或mV（毫伏）。不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同:
好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长，以+0.3～+0.4伏为宜；
厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；
兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸，+0.1伏以下时进行发酵。氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响:
增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加Eh值在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸（Vc，0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（&0.05%）、谷胱甘肽、铁屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可降低Eh值。
测定氧化还原电势除用电位计外，还可在培养基中加入化学指示剂刃天青（resazurin）进行间接测定。
刃天青在无氧条件下呈无色（Eh＝-40 mV）；在有氧条件下，其颜色与溶液的pH相关；（中性——紫色；碱性——蓝色；酸性——红色）；在微量氧时，它呈粉红色。4.经济节约
配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低
生产成本。
(1)以粗代精：对微生物来说，各种粗原料营养更加完全，效果更好。而且在经济上也节约。大量的农副产品或制品，如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
(2)以“野”代“家”： 以野生植物原料代替栽培植物原料，如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物，可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源。
(3)以废代好：以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料。例如，糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、 豆制品工业废液、黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等。
工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村，已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。
(4)以简代繁：某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方，设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵，结果反而提高了产量。
(5)以氮代朊：以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料，让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用。
(6)以纤代糖：开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源。将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料。
(7)以“国”代“进”： 以国产原料代替进口原料，尽量减少工业成本。国内青霉素发酵工业的迅速发展，依赖于找到了富有中国特色的培养基配方，即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖。
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1）目的明确；2）营养协调；3）理化条件适宜；4)经济节约
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