除了抑制β剪切酶的功能以外，理论上，由于β-CTF减少，Aβ的表达应该也受到抑制，结果不出所料，28天的大鼠各种Aβ显著降低，值得注意的是，这里的研究还对大鼠进行了雌性区分，结果基本类似。WB对CTF的检测得到的结果也与N端产物类似，这说明A673T突变能抑制Aβ的产生。比较有意思的是在Aβ38的检测中，该Aβ只在雌性小鼠中存在。

Aβ人源化＋swe突变大鼠

反过来，如果是APPswe大鼠，则会有明显的β剪切和Aβ表达的增加，同时由于β剪切的加剧，成熟APP的含量也降低。因此该大鼠模型在APP剪切方面对AD进行了有效的模拟。

总结起来就是保护性的A673T突变会降低β剪切，而swe突变会增加β剪切。前者最终降低Aβ，而后者则增加Aβ。

Aβ人源化＋PS1突变大鼠

图1中γ剪切酶由4种蛋白共同组成，其中最重要的组成元素就是早老素蛋白1（Presenlin1,PS1）了。Luciano D’Adamio实验室制作了PS1突变敲入的大鼠。

该大鼠可以表达L435F突变，这与小鼠不同，如果小鼠含有这种PS1上的纯合突变是致死的，无法进行后续的实验。而纯合L435F大鼠虽然也会造成27天时体重的下降以及1月龄时40%的死亡率，但挺过一个月的大鼠活到2月龄基本没有问题，所以L435F纯合大鼠是可以进行实验的。此外438位点的突变是同义突变，对氨基酸序列没有影响。

图7 . PS1纯合突变降低大鼠体重和生存率

有意思的是，大鼠出生4天后就会造成Aβ38、Aβ40和Aβ42的降低，但却会造成Aβ43的增加。同时高分子量Aβ与低分子量Aβ之比也会随着突变的影响而增大，因此这个结果说明PS1-L435F KI降低了γ剪切酶的整体剪切能力，但提升了对Aβ43的剪切。Aβ的毒性不仅与Aβ的丰度有关，也与不同Aβ之间的比值相关，因此这个结论究竟对Aβ的毒性有怎样的影响，还有待于进一步研究；另一方面，由于使用的大鼠刚出生4天，所以随着年龄的增加γ剪切酶的功能会不会发生改变还犹未可知。

综上，其实我们已经有了具有AD病理特征的大鼠KI模型，而且随着基因编辑技术在大鼠中的应用愈发成熟，我们也可以将人的更多突变引入到大鼠中，从而模拟人的AD病理表型。目前AD大鼠模型的数量相对而言还很少，但大鼠在AD研究甚至神经生物学研究中的优势让人不得不重新对其重视起来。

不过稍微让人感到遗憾的是，由于上面提到的AD大鼠模型在进行病理实验时年龄还太小（最大的实验年龄也才28天，最小才4天），因此很多分子层面的改变可能需要时间的积累才能发生。此外，神经生物学中最重要的行为表型也需要在一定年龄后进行检测，这将是模型优劣的关键。因此十分期待后续的行为研究能有不错的结果。

由于大鼠相对小鼠更为聪明，行为实验中的分辨率会进一步提高，我们已有的分子和病理层面的改变更容易反应到行为上来。

此外在已经构建了不同基因编辑模型的情况下，如果将这些大鼠进行杂交，也可以获得如Tg小鼠的多基因编辑大鼠，从而有利于我们获得更明显的病理表型。因此大鼠模型的建立，开发和优化将为AD的研究，尤其是药物开发研究提供有力的武器。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种由多因素引起的神经退行性疾病, 其发病机制较为复杂, 包括: β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein, Aβ)的异常沉积、tau蛋白的过度磷酸化和线粒体异常等^{[, ]}。据国际阿尔茨海默病协会统计, 全球AD患者约4 600万, 预计到2030年, 将达到7 470万^[]。然而, 目前临床使用的药物仅有乙酰胆碱抑制剂和N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂, 且治疗效果都不尽如人意^[]。因此, 对于AD这种多因素疾病, 单一靶标的干预很难得到理想的效果。治疗多因素疾病时, 研究者逐渐改变单靶点药物治疗的思路, 并向多靶点、多通路的思路转变, 中药作为天然药物的重要组成部分, 有多成分-多靶点的治疗机制, 且越来越多的天然药物通过FDA认证^[]。因此, 阐明中药治疗多基因类疾病的物质基础及分子机制, 受到了研究者广泛的关注和重视。

远志, 始载于《神农本草经》, 性辛、温, 味苦, 归心、肾、脾经, 具有安神益智、交通心肾等功效^[];现代药理学研究证明^[], 远志具有改善学习记忆、抗氧化、保护神经元和保护心脑血管等作用; 临床应用与实验研究表明^[], 远志具有明确改善阿尔茨海默病病理表现的作用。然而, 由于阿尔茨海默病发病的病因和病机比较复杂, 且远志中化学成分多样, 通过实验进行研究存在一定的困难。虽然有实验研究表明, 远志中化学成分具有保护脑活性和抗AD的作用, 但是其治疗AD的主要活性成分和分子机制尚未完全阐明。因此, 本研究运用系统药理学的思路和方法, 从分子角度及系统水平分析远志防治阿尔茨海默病的药效活性成分和可能的分子网络机制, 挖掘远志的潜在治疗作用, 以期为临床使用提供科学依据。

小分子数据库的构建  收集TCMID数据库^[] ()中远志化学成分结合已报道的远志化学成分相关文献^{[, -]}, 共得到远志中的化学成分111个。由ChemSpider^[] ()、PubChem ()数据库中下载上述化学成分的2D分子结构文件, 截止数据分析时, 暂未被数据库收录, 但已有文献报道的成分通过Chemdraw软件进行2D分子结构的绘制。将上述所有2D分子结构文件转化为3D结构, 构建小分子数据库。

C-T-D)网络模型。运用软件中Network analyer功能, 进一步对网络模型中的相互关系进行分析。

结果 1 主要活性成分与潜在靶蛋白分析

level≥3^[]为标准, 对111个化学成分进行筛选, 得到符合条件的成分共10个, 分别为:皂苷类化合物1个、远志口山酮类化合物3个、寡糖脂类化合物3个和其他类3个。将上述10个化学成分, 通过Pharmmapper服务器与TTD、CTD数据库验证后, 其血脑屏障通透性最高, 且实验研究表明, 其可与大鼠齿状回突触的相互作用, 能改善大鼠学习记忆的活性^[]。分析结果显示:在10个活性成分中, 10.00%的成分对应4个靶点, 40.00%的成分对应5个靶点, 30.00%的成分对应6个靶点, 20.00%的成分对应7个靶点。这些成分与靶点的对应数量关系验证了中药通过多成分-多靶点发挥作用的机制, 同时验证了中药中化学成分间的协同作用, 显示中药治疗多因素多基因类疾病的优势。

运用Cytoscape软件构建的C-T-D网络模型中(), 共包含10个化学成分, 13个靶点及1种疾病, 其中中心透明的大脑图形代表AD疾病, 粉红色三角形代表靶蛋白, 蓝色圆形代表远志中的化学成分。利用Network analyer功能对网络模型进行分析发现, 在C-T-D网络模型中包含24个节点, 74个边, 其网络半径为2, 网络直径为3, 最短路径为552, 网络的特征路径长度为1.982, 表明经过1.982步即可互相转化。从C-T-D图可以发现, 远志中10个化学成分与多个靶点间产生相互作用, 此现象符合中药多成分-多靶点的治疗机制。从化合物的网络特征分析来看,

经过文献挖掘并对上述数据研究发现, 远志可能通过多种途径治疗AD:其一, 研究表明^{[, ]}, BACE1在Aβ生成中起着关键的作用, 而PPARγ^[]的活化能够降低Aβ的沉积、增强海马区认知功能和逆转记忆力下降, 因此, 远志中的化学成分可能通过对这两个蛋白的调控而发挥治疗AD效果; 其二, 靶点GSK3β^[]负责Tau蛋白的过度磷酸化, 在Tau蛋白过度磷酸化的假说中, 被认为是其中的关键分子, 并且GSK3β与细胞凋亡相关, 远志中19个活性成分均与此靶点存在相互作用, 因此推测远志可能通过调控Tau蛋白的磷酸化, 达到治疗AD的效果; 第三, 靶点NOS3与靶点SOD2均与氧化作用相关^{[, ]}, 而过度的氧化标志物在AD患者脑中的改变非常明显, 该结果预示远志可能通过抗氧化作用, 达到治疗AD的作用; 最后, 靶点ESR、IGF和IGF1R均与细胞的增殖分化、生长存活相关^{[, ]}, 这3个靶点在治疗AD的过程中可能起到协同或辅助的治疗作用。综上所述, 远志治疗AD可能通过对Aβ异常沉积与Tau蛋白过度磷酸化进行调控、抗氧化, 参与细胞增殖分化等多个途径发挥其治疗效果, 这可能与远志改善学习记忆、抗氧化和神经元保护等药理作用相关。

将上述13个靶点, 全部映射到KEGG数据库中, 并对结果进行分析整理(), 图中橘色长方形为靶点所映射的位点, 灰色长方形为未映射但与通路有关的位点。通过对通路图的分析发现:首先, Tau蛋白磷酸化水平受到细胞内CASP3和GSK3β的共同调节, CASP3和GSK3β表达平衡对Tau蛋白是否能够磷酸化具有重要的意义。结合发现, 远志中这10个活性成分均与GSK3β存在潜在的结合关系, 5个活性成分(onjisaponin E、1, 使Tau蛋白的磷酸化水平处在正常的生理状态, 从而控制神经纤维缠结(NFTs), 达到直接治疗AD的作用; 第三, 化合物onjisaponin E与靶点CALM1相互作用, 间接参与线粒体介导的细胞凋亡。通过对通路图分析发现, 化合物onjisaponin E可能通过控制线粒体过多分裂, 从而调节细胞损伤和神经元的死亡, 达到干预AD发病的作用。上述两条直接与AD相关的作用途径均与细胞凋亡通路相关。除细胞凋亡通路外, 还发现远志中的活性成分可能参与其他通路的调节, 进而对AD起到辅助治疗的作用:其一, 化合物onjisaponin E、1, 3, 6, 7-tetramethoxy xanthone、polygalacic acid与IGF1结合后, PPARγ的活化能够降低Aβ的沉积、增强海马区认知功能、逆转记忆力下降; 其二, 远志中的活性成分3-hydroxy-2, 8-dimeth oxyxanthone可直接与NOS3相互作用来调控心肌细胞的存活或使血管平滑肌松弛。综上所述, 远志中的化学成分通过对多靶点、多通路的调节, 从而达到干预或治疗AD的作用。

4 潜在靶点的GO富集及MeSH疾病分类

运用MAS 3.0生物分子注释系统对远志化学成分预测出的13个作用靶点进行GO富集分析, 将其中富集的疾病部分进行MeSH分类。结果如所示, 发现Alzheimer's disease所对应的靶点数目最多, 为10个; 除AD外, 有6个靶点对应了如帕金森病(Parkinson 远志除具有治疗AD的作用, 可能还有治疗其他神经退行性疾病乃至神经系统类疾病的潜在作用, 这与远志安神益智、解郁的功效, 促进神经干细胞增殖、抗氧化、清除自由基和保护神经胆碱能系统等药理作用有关。

本研究通过ADMT评估、反向药效团匹配、构建C-T-D网络模型、KRGG分析、GO富集分析及MeSH分类, 明确了远志中10个活性分子, 其中包含口山酮类化合物3个、皂苷类化合物1个、寡糖酯类化合物3个和其他类3个。通过对网络模型的分析发现, BACE1与GSK3β为C-T-D网络模型中网络度最好(核心)的靶点, 而远志可能作用于BACE1、PPARγ靶点调控Aβ, 作用于靶点GSK3β调控Tau蛋白的磷酸化, 作用于靶点NOS3与SOD2调节氧化作用, 作用于靶点ESR、IGF和IGF1R调节细胞的增殖分化和生长存活等多途径防治AD。通过多途径治疗AD, 充分发挥了中药治疗疾病的多成分-多靶点机制, 但成分间存在的是协同作用还是拮抗作用暂不明确, 需要进一步的实验验证。通过KEGG分析, 发现远志治疗阿尔茨海默病主要通过调控细胞凋亡通路直接发挥疗效, 而调节细胞凋亡通路的途径可能包含两种: ① 活性成分与靶点GSK3β作用, 控制Tau蛋白的过度磷酸化; 与CASP3相互作用, 调节Tau蛋白的正常磷酸化。这两种途径共同发挥作用, 使Tau蛋白的磷酸化水平处在正常的生理状态, 从而控制神经纤维缠结, 达到直接治疗AD的作用; ② 化合物onjisaponin E可能通过控制线粒体过多分裂, 从而调节细胞损伤和神经元的死亡, 达到治疗AD的作用。KEGG结果显示, 远志中化学成分可能通过激活PPARγ, 调控心肌细胞的存活或使血管平滑肌松弛达到辅助的治疗效果, 但远志中的成分对通路是上调还是下调的具体机制还不明确, 需要进一步阐述。GO分析及MeSH分类的结果显示, 远志对神经系统类疾病存在着潜在的治疗作用。

本研究采用系统药理学的方法对远志中化学成分进行综合性分析, 阐释了远志中潜在活性成分群的分子作用机制, 进一步揭示了中药多成分-多靶点-多通路的治疗机制, 为中药防治由多基因引起的复杂疾病的治疗机制研究提供了思路。