红花桑寄生多糖的提取方法
专利名称红花桑寄生多糖的提取方法
技术领域本发明涉及一种植物多糖的提取方法，具体地说，涉及一种红花桑寄生(Scuirula parasitica L.)多糖的提取方法。
背景技术红花桑寄生5"cMmz/" parawWca L.是桑寄生科桑寄生亚科梨果寄生属半寄生 性植物，为我国特有的植物，主要分布于我国广东、广西、云南及福建等南方 地区。传统上红花桑寄生常作为桑寄生Ku/〃w c/z/we"w、 (DC.) Danser的代用品 入药，具补肝肾、祛风湿、降血压、安血养胎等功效，主治风湿、关节痛、高 血压、坐骨神经痛、腰痛、产后乳少等症。桑寄生科植物一般含大量的黄酮类成分，我们在前期的研究中发现红花桑 寄生总黄酮提取物对急性髓系白血病有较好的抑瘤效果，并可增敏临床重要抗 肿瘤化疗药物多柔比星的疗效，机制研究表明其可能是一种良好的NF- k B抑 制剂。然而，尚未见对红花桑寄生多糖及其功用的研究。植物多糖具有多方面的生物活性，能够调节机体免疫机能，具有抗病毒、 抗菌、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等功能，因而越来越受重视。近年 来，大量的研究表明，中药多糖具有抗肿瘤作用，且毒副作用小，因而越来越 成为抗肿瘤研究的热点。香菇多糖、当归多糖、猪茶多糖、云芝多糖等一批质 量稳定、疗效确切、毒性和不良反应小的多糖类药物已作为抗肿瘤药物广泛用 于临床。红花桑寄生的同科植物槲寄生在国外是一种研究较多的具有抗肿瘤作用 的植物，在欧洲，自1920年就对槲寄生的抗肿瘤作用开始研究，其提取物具有多种抗癌效果，对乳腺癌、胃癌与结肠癌等常见肿瘤有一定治疗作用。英国和澳人利亚已分别开发出商品名为Iscador和Isord的槲寄生标准植物提取物用 于癌症的临床治疗。已有的研究表明槲寄生提取物中的有效抗肿瘤成分可能主 要是多糖、凝集素、毒肽、生物碱以及多酚类物质。棺物多糖的提取过程大多采用传统的先沉淀再去蛋白的方法。我们在研究 中发现采用传统的方法来提取红花桑寄生多糖，需多次使用沉淀剂从溶液中沉 淀多糖，耗费大暈的溶剂，且得率低，提取出的多醣类物质水溶性很差，不利 于应用。本发明采用先去蛋白再沉淀多糖的提取方法，则只需使用一次沉淀剂 来沉淀多糖，节省了大量溶剂；得率高，同时提高了多糖的水溶性，便于药物 研究和实际应用。 发明内容本发明的目的在于提供一种先去蛋白再沉淀多糖的红花桑寄生多糖的提取方法。为实现本发明的目的采用的技术方案是将红花桑寄生枝叶粉碎后，用乙 醇回流提取，过滤取滤渣，滤渣用热水浸提，经沉淀、干燥后得到红花桑寄生 多糖提取物，其特征是经热水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、 TCA法或酶法，或者是他们之间的任意两种方法，或者是三种方法联用去除蛋 白，再使用透析袋进行透析除去小分子成分。采用本发明所述的红花桑寄生多糖提取方法，只需使用一次沉淀剂来沉淀 多糖，节省了大量溶剂；提高了多糖的得率，同时提高了多糖的水溶性，便于 药物研究和实际应用。所得到红花桑寄生多糖提取物，对小鼠肉瘤S180有较 好的抑制效果，并与临床重要抗肿瘤化疗药物有显著的协同效果；该提取物也 可显著延长荷肝癌腹水瘤H22小鼠的寿命。研究表明该提取物的抑瘤效果并没 有剂量依赖性，而是有一最佳剂量，过高或过低的剂量均使得抑瘤效果下降。具体的提取方法包括以下步骤(1) 采集红花桑寄生嫩枝和叶，水洗、晾干、6(TC烘干，粉碎机成粉末；(2) 取粉末，加入乙醇回流提取，以去除其中的脂溶性成分，过滤取滤渣， 挥干溶剂；(3) 取挥干溶剂后的滤渣，进行热水浸泡提取，滤渣水二i : 5 15，热水温度为80 95 'C浸泡提取，2小时后离心或抽滤去渣；取上清液，并于 6(TC下减压浓縮处理；(4) 重复步骤(3)三遍；合并3次上清液。(5) 采用sevage法、TCA法、酶法或者这几种方法联用，重复三次，将上清 液中的蛋白去除；(6) 去蛋白后的上清液装入透析袋进行透析，流水透析2天，蒸馏水透析l 天，去除小分子成分，得到多糖溶液；(7) 在多糖溶液中加入沉淀剂，在低温下沉淀多糖，使沉淀剂在溶液中的浓 度为65% 85% (v/v)，离心收集沉淀，该沉淀物经醇类、酮类和乙醚依次 洗涤后冷冻干燥即得本发明所说的红花桑寄生多糖。本发明所述的透析袋进行透析时，流水透析2天，蒸馏水透析l天；所说 的透析袋的透析分子量为 D。本发明所述的沉淀剂，是指含有1 4个碳链的醇类溶剂，最优选的是乙醇。本发明所述的洗涤步骤中采用的洗涤剂依次为无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤。
具体实施方式
以下实施例用于对本发明作进一步阐述，但并不因此而限制本发明的范围。实施例1:取粉碎好的药材粉末180 g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽 滤取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1: 10， 95"C热水中提取，每次2 h,共 提取3次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液于6(TC下减压浓缩至约1000ml 体积，加入1/3体积的sevage (氯仿正丁醇=4: 1)，振荡20min后，8000 rpm离心15min，去除蛋白沉淀，取上清重复多次直到无蛋白为止。将去蛋白 后的溶液装入透析袋透析，流水透析2天，蒸馏水透析l天。减压浓縮至1/2 体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置24 h进行沉淀，离心收集沉淀， 依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻真空干燥得红花桑寄生多糖提取 物3.67 g。 实施例2:取粉碎好的药材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤 取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1: 10， 95"C热水中提取，每次2h，提取3 次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液加入0.5%木瓜蛋白酶(w/v)， 4(TC酶 解5 h后，加热到10(TC 10 min灭酶活，于6(TC下减压浓縮至约1000 ml体 积，加入1/3体积的sevage (氯仿正丁醇=4: 1)，振荡20min后，8000rpm 离心15 min，重复3次。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2天， 蒸馏水透析1天。浓缩至1/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置24 h 进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻真空 T燥得红花桑寄生多糖提取物4. 87 g。 实施例3:取粉碎好的药材粉末180g,加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤 取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1: 10， 95"C热水中提取，每次2 h，共提 取3次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液于60'C下减压浓縮至约1000 ml体积，加入等体积30%三氯乙酸，振荡20min后，4。C下静置2 h， 8000 rpm 离心15min，去除蛋白沉淀。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2 天，蒸馏水透析l天。浓縮至l/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置 24h进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻 真空干燥得红花桑寄生多糖提取物3.42 g。 实施例4:取粉碎好的药材粉末180g，加入80%乙醇回流提取3次，每次2h，抽滤 取滤渣，挥干溶剂后加水按料液比1: 10， 95。C热水中提取，每次2h，提取3 次，合并3次提取液，抽滤去渣，滤液加入0.2%木瓜蛋白酶(w/v)， 6(TC酶 解2 h后，加热到IO(TC 10 min火酶活，于60。C下减压浓缩至约1000 ml体 积，加入等体积30%三氯乙酸，振荡20 min后，4'C下静置2 h， 8000rpm离 心15 min，去除蛋白沉淀。将去蛋白后的溶液装入透析袋透析，流水透析2 天，蒸馏水透析l天。浓縮至l/2体积，加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置 24h进行沉淀，离心收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，再经冷冻 真空干燥得红花桑寄生多糖提取物4.32 g。 实施例5:按实施例4所述方法提取的红花桑寄生多糖提取物(以下简称SPS)腹腔注 射对小鼠肉瘤S180的抑制作用。昆明种小鼠50只(雌雄各半，体重18士2g，由福建医科大学实验动物中 心提供),S180腹水瘤株由福建医科大学药学院提供。取腹腔内传代7d的S180 肉瘤小鼠，脱臼处死，在无菌条件下抽取腹腔内瘤细胞，并以生理盐水洗涤3 次，2500 rpm离心3 min,用灭菌生理盐水调整瘤细胞浓度为5X 107ml ，接 种于小鼠右腋皮下，每只小鼠接种0.2ml。于接种24 h后随机分组，每组10只，分成生理盐水组、环磷酰胺组(CTX，20 mg/kg
d)、 SPS低剂量组(50 mg/kg . d)、 SPS中剂量组100 mg/kg . d)、 SPS高剂量组(150 mg/kg .d)。以上各组均每天腹腔注射给药0.01 ml/g，连 续给药10天，末次给药24h后，脱臼处死荷瘤小鼠，取肿瘤组织、脾脏、胸 腺，去血污称重，计算抑瘤率、脾指数(mg脾重/10 g体重)和胸腺指数(mg 胸腺重/10 g体重)。结果见表l。抑瘤率=(对照组平均瘤重一实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重X10(F。表l红花桑寄生多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(x士s, n =10)&table&table see original document page 8&/column&&/row&&table&由表1可看出，三种剂量的红花桑寄生多糖提取物对小鼠S180均有较好 的抑瘤效果，与生理盐水组比较，差异显著，抑瘤效果以100 mg/kg. d的剂量 最好，过高剂量反而导致抑瘤效果下降，这与文献中报道的植物多糖的免疫调 节作用大多有最适剂量相符。三个剂量的SPS组与生理盐水组相比均能增加小 鼠脾重量，只有SPSIOO mg/kg .d组差异显著(尸〈0.001)，红花桑寄生多糖 对胸腺重量的增加影响不大，而阳性对照药CTX极显著地降低了脾指数和胸腺 指数。 实施例6按实施例4所述方法提取的红花桑寄生多糖提取物对环磷酰胺(CTX)的 增效作用。材料及接种方法同实施例5，于接种24 h隨机分组给药，分成生理_盐水组、 CTX低剂量组(10 mg/kg .d)、 CTX中剂量组(20 mg/kg . d)、 CTX高剂量组 (30 mg/kg .d)、 SPS (100 mg/kg . d) + CTX低剂量组(10 mg/kg
d)、 SPS (100 mg/kg . d) + CTX中剂量组(20 mg/kg
d)、 SPS (100 mg/kg . d) + CTX 高剂量组(30 mg/kg. d)，以上各组均每天ip给药0.01ml/g,连续给药10 d， 末次给药后24 h脱臼处死荷瘤小鼠，取瘤称质量，计算抑瘤率。比较单纯用 CTX治疗组与加用多糖组间抑瘤率的差异，结果见表2。表2红花桑寄生多糖对CTX的增效作用(义士s， n =10)&table&table see original document page 9&/column&&/row&&table&与生理盐水组比较*尸&0. 001; 与CTX比较at° &0. 05;^尸&0. 01由表2可看出，红花桑寄生多糖提取物显著地增强了环磷酰胺的抑瘤效果。 实施例7按实施例2所述方法提取的红花桑寄生多糖提取物显著延长了荷H22肝癌 腹水瘤小鼠的寿命。材料及来源同实施例5。无菌条件下抽取小鼠腹腔内传代7 d的H22腹水细胞，计数后用生理盐水稀释，每只小鼠腹腔接种5X106个细胞，次曰开始尾静脉注射给药，连续7天。停止给药后计算小鼠生存天数。阴性对照药为生理盐水，阳性对照药为环磷酰胺，SPS分为高、中、低三个剂量组，结果见表3。生命延长率的计算公式为生命延长率=(给药组平均存活天数—对照组平均存活天数)/对照组平均存活天数X 红花桑寄生多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用(x土a n =10)&table&table see original document page 10&/column&&/row&&table&与对照组比较*尸〈0.01从表3可看出，红花桑寄生多糖提取物显著地延长了荷瘤小鼠的生命，与 对肉瘤S180的抑制结果相似，中剂量组100 mg/kg. d这一剂量对荷H22肝癌 腹水瘤的小鼠延寿效果最好，表明红花桑寄生多糖提取物的抗肿瘤效果有一最 佳剂量，而不呈线性的量效关系。这一点与香菇多糖的抗肿瘤效应相似，表明 红花桑寄生多糖提取物可能与香菇多糖有相似的抗肿瘤作用机制。
1、红花桑寄生多糖的提取方法，是红花桑寄生枝叶经粉碎后，用乙醇回流萃取，过滤去处脂溶性成分，滤渣经热水浸提法，经沉淀、干燥后得到红花桑寄生多糖提取物，其特征是经热水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法、酶法或者这三种方法联用去除蛋白，再利用透析袋进行透析。
2、 根据权利要求1所述的红花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的透 析袋进行透析时，流水透析2天，蒸馏水透析1天；所说的透析袋的透析分子 量为 D。
3、 根据权利要求1所述的红花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的沉 淀剂，是指含有1 4个碳链的醇类溶剂，最优选的是乙醇。
4、 根据权利要求1所述的红花桑寄生多糖的提取方法，其特征是所述的洗 涤歩骤中采用的洗涤剂依次为无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤。
本发明涉及一种植物多糖的提取方法，具体地说，涉及一种红花桑寄生多糖的提取方法。为实现本发明目的采用的技术方案是将红花桑寄生枝叶粉碎后，用乙醇提取后过滤取滤渣，滤渣用热水浸提，经去蛋白和小分子成分后得到红花桑寄生多糖，其特征是经热水浸提法提取后的上清液，首先采用sevage法、TCA法、酶法或者这三种方法联用去除蛋白，再透析去除小分子成分。采用本发明所述的多糖提取方法，只需使用一次沉淀剂来沉淀多糖，节省了大量溶剂；同时提高了多糖的得率和水溶性。所得到红花桑寄生多糖提取物，对小鼠肉瘤S180有较好的抑制效果，并可显著延长荷肝癌腹水瘤H22小鼠的寿命，其抑瘤效果没有剂量依赖性。
文档编号B01D61/00GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者肖义军, 范延丽, 陈元仲 申请人:福建师范大学丁香客App是丁香园社区的官方应用，聚合了丁香园论坛和丁香客的精彩内容。医生可通过丁香客App浏览论坛，也可以在这个医生群集的关系网络中分享和互动，建立更广泛的学术圈子。
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【求助】水提醇沉法提取多糖时，用丙酮和乙醚洗涤，但是用量怎么确定？
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水提醇沉法提取多糖时，需要用丙酮和乙醚洗涤，但是丙酮和乙醚的用量怎么确定呢？请各位老师指点
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一般加了乙醇之后就可以见到有沉淀物此时可以离心分离。。
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您的意思是不用丙酮和乙醚洗了
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我做的没用那些试剂你可以看一下相关的文献。。
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用丙酮和乙醚可以洗掉一些小分子杂质，并且能够让样品干的速度快些。所以，用量取决于多糖样品干净的程度。
关于丁香园影响金耳多糖提取率因素的正交试验金耳通,金耳铃,金耳扣,香港金耳通,木耳 金耳
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影响金耳多糖提取率因素的正交试验
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& 正文　　　　
植物多糖的提取和纯化
& & & & & 多糖的提取和纯化
& & & & & 目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。稀碱法适合于提取碱溶性糖。然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。第四步是沉淀多糖。大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。最后是除去蛋白质。除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。
&&& 多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。
纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。因此，测得的分子量一般为平均分子量。过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。
&&& 1.2.1发酵、
&&& 取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通
气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。
&&& 上述菌丝体经水洗涤后，用3倍量热水(90一100℃)浸取3h，浸取液经浓缩加3倍量95肠乙
醇，离心得乙醇沉淀物一Le[&&。
&&& 1.2。2分离、纯化
&&& 取Le上样于DEAE一纤维素柱上，用O。Olmol/L pH 6.95 Tris-HCI缓冲液洗脱，洗脱液分
部收集，分别用UV(280nm)和酚硫酸法测定其吸收值(A值)，合并吸收峰重叠的洗脱液，经浓
缩、透析、冻干得淡黄色絮状物Le一2&
&&& Le一2进一步用DEAE一纤维素(DE52型)分离，先用pH7.8的0.oosmol/L硼酸缓冲液洗脱，
后用含lmol/L NaCI的o.Zmol/L硼酸缓冲液洗脱.各洗脱液按上法用UV230nm和酚硫酸法
检测，分别收集既含肤又含糖的洗脱液.用o.005mol/L硼酸缓冲液洗脱的组分为Le一2一1，用含
lmol/L NaCI的硼酸缓冲液洗脱的组分称Le一2一2o
&&& 1.2.3鉴定
&&& 1.2.3.1纯度
&&& (l)HPLC法 将样品配成1%浓度后进样.进样量20召L。流动相:0.002mol/L NaAc;流
速:0.6ml/min。记录色谱曲线和样品保留时间(Tr)。
&&& (2)醋酸纤维薄膜电泳 缓冲液:pH8.6巴比妥缓冲液.电压12OV，25min.阿利新蓝法
1&2&3.2分子量测定
&&& 用T系列标准葡聚糖(T-40:44，400 Da；T-70：85，000 Da；T-110:110，000 Da;T-500:450，000
Da)上HPLC柱，测出保留时间后对分子量对数作出标准曲线.然后根据样品的保留时间，从标
准曲线上求出样品分子量。
&&& 1.2。3.3单糖组成
&&& (l)薄层层析将Le一2一1及Le-2一2分别用三氟醋酸在110℃下水解4h.蒸去三氟醋酸并蒸
干，用3ml水溶解后点样。层析板:醋酸纤维素层析板(DC一Aufolien CelluloseF。);展开剂:正
丁醇(BuOH):毗唆(Py):水(HZO)二6:4&3;显色剂:苯胺一邻苯二甲酸.
&&& (2)气相色谱取上述水解液加IOmg NaBH。在室温下还原Zh，用冰醋酸调pH至5，减压蒸
干后加lml乙酸配，100℃水浴lh，进行乙酞化处理，将乙酸化产物的氯仿抽提液作气相色谱分
析，柱温205℃，气化温度250℃。
1&3.1多糖的分离、纯化将长裙竹荪子实体干品洗净、剪碎，用5倍的3%三氯乙酸溶液于
5℃提取8h，离心，收集上清液，用4N NaOH溶液中和上清液至pH7，浓缩、离心，上清液加3倍
体积的95%乙醇沉淀，收集沉淀物，冷冻干燥得粗多糖，得率约为8%.粗多糖含蛋白质较多，采
用蛋白酶法脱蛋白一次，Sevag法脱蛋白5次，去蛋白液经透析，加3倍体积95%乙醇沉淀，
水溶解，再醇析，反复三次得脱蛋白多糖。脱蛋白后的多糖(2 .0g)溶于水(1Oml)中，用DEAE一纤维素(Cl-)型柱(3.3X53cm)层析，用水作洗脱剂，分部收集，每管10ml，用硫酸一苯酚法测定
多糖的分布。合并多糖单一峰位部分，减压浓缩至5ml，再进行一次DEAE一纤维素(B4O7 2-型)
柱(1.8x50cm)层析，用水作洗脱剂.分部收集，用硫酸一苯酚法测定多糖分布.合并单峰洗脱
液，浓缩至小体积，用SephadexG一200柱(2.OX5ocm)进一步纯化用o.05mol/1 NaCI溶液作
洗脱剂，用硫酸一苯酚法测定多糖分布，合并单峰洗脱液，透析去盐，浓缩，再加3倍体积的95师
乙醇沉淀，沉淀物经冷冻干燥得到多糖，命名为DIA。
1.3.2纯度鉴定聚丙烯酞胺凝胶电泳按文献方法进行.阿利新蓝染色。
&&& 醋酸纤维薄膜电泳按文献方法进行，缓冲液为o.025mol/l pHg.0的硼砂缓冲液，纸长
scm，电压160V，电泳50min，阿利新蓝染色。
&&& 凝胶过滤法采用Sepharosc 4B柱(79 X 1 .6cm)进行凝胶层析，用蒸馏水洗脱，硫酸一苯酚
法隔管测定多糖的分布。
&&& 紫外分光光度法采)JI UV一300进行扫描(200一400nm)。观察260nm、280nm处是否有吸收
&&& 根据上述测定结果，鉴定多糖的纯化。
1.3.3分子量测定采用Sepharose 4B凝胶柱(79x l.6cm)层析，洗脱剂为蒸馏水，洗脱
速度为3ml/8min，分部收集，用硫酸一苯酚法测定多糖的分布。再以标准葡聚糖T一40
(44 .4Kd)、T一70(85Kd)、T一110(110Kd)和T一500(45Kd)分别重复上柱，测得各自的洗脱体积
Ve，以Log M.W.对洗脱体积VO作图得标准l山线。山多糖DIA的洗脱体积，查标准曲线图，求得
该多糖的分子量。
1.3.5纸层析分析多糖DiA用2N H2SO4封管，100 水解6h，水解液用BaC03中和、过滤、
浓缩后点样分析。采川新华中速层析滤纸，下行法。溶剂系统为醋酸乙酯:吡啶，水
=10，4，3;显色剂为苯胺一邻苯二甲酸。
干品洗净剪碎&&5倍蒸馏水，98-100 提取5h纱布粗滤，离心3000转/分&&上清液适当浓缩，加3倍95乙醇沉淀，离心3000转/分&&沉淀冻干&&粗多糖蛋白酶法和sevag法脱蛋白&&脱蛋白多糖&&Sephadex A-25柱层析，先用0.1mol/LNaCl洗至无糖检出，再用0.1-3.9mol/LNaCl梯度洗脱&&含糖部分Sephadex G-200柱层析0.1mol/LNaCl洗脱&&多糖纯品
Sevag法(即氯仿与正丁醇的比例为3:1)脱蛋白,振摇0.5h左右,使样品中蛋白质与混合液形成凝胶,再反复多次用离心法除去。
1 多糖研究概述
1.1 多糖提取：多糖多为水溶性多糖，组分不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。多糖的提取一般分三步进行。浸提：一般采用冷水或温水浸提。浸提一段时间后，加乙醇或丙酮深淀，离心分离沉淀。用乙醇或乙醚脱水，最后真空干燥或冷冻干燥后得粗多糖。
脱蛋白：用丧Sevag法 (即氯仿与正丁醇的比例为3:1)脱蛋白，振摇0.5h左右，使样品中蛋白质与混合液形成凝胶，再反复多次用离心法除去。也可用三氯醋酸法，三氟三氯乙烷脱蛋白。纯化：多糖纯化多采用柱层所。脱蛋白后的多糖用水溶解后，用DEVE纤维素柱层析，然后依次用不同浓度的Na&SUB&2&/SUB&CO&SUB&3&/SUB&，NaOH洗脱。此外，纯化还可采取凝胶柱层析法，超滤法等。
1.2 多糖分子量的测定：所谓多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组分，因此测定的多糖分子量为平均值。以前多采用蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差很大。目前常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于一百万的多糖，用高压液相法为最好。
1.3 多糖结构的确定：多糖的活性与其结构有关，但确定多糖的细微结构是很难的，原因是分级纯化难关，从自然界分离的粗多糖是非常复杂的大混合物，包括生物大分子混合；不同多糖(中性多糖、酸性多糖或杂多糖)的混合；同种多糖大小分子的混合，必须采取适合特点的方法分离分级纯化，否则不易确定其结构。
从同一样品采用不同分级方法，常有不同结果。植物的不同部位，因功能不同，其中的多糖也是各色各样的，必须分开来研究。比如人参的根、茎、叶、果中的多糖，虽都含有中性杂多糖、酸性杂多糖组分，其组成与结构都是不同的。在人参茎、叶、果的中性杂多糖、酸性杂多糖组成中都有葡萄糖，而根的中性杂多糖、酸性杂多糖组成中都没有葡萄糖，而只有以葡萄糖为主链的类淀粉多糖储存在根部。
多糖结构确定有化学降解法、酶降解法、免疫化学法、放射化学法、红外光谱法、核磁共振法、气相层析法、质谱法、质谱与气相层联用、高效液相色谱法等，要完成对多糖整体结构的分析，必须将各种方法结合起来。
多糖的结构研究，还不能忽视金属离子的贡献，多糖链中含烃基、乙酰基、氨基、硫酸基等易与多种金属离子形成络合物。多糖在自然环境中是否与金属离子有关系，如何才会是其最佳状态，也是应考虑的。金属离子的加入或可能是多糖的活性中心的成员，金属离子的存在因络合多糖链而会影响构象变化。多糖的结构确定与生物活性测试后，研究者的进一步是研究其构象、大分子间相互影响、活性中心、金属离子影响以及化学修饰的研究，从不则角度来阐明结构与功能的关系。
2.1 工艺流程 银耳孢子发酵粉&热水煮提&冷却离心&沉淀加一定浓度NaOH液搅拌，离心&上清液&3V乙醇沉析&多糖沉淀&多糖粗品&蒸馏水加热溶解&冷却离心&上清液&Sevag法除蛋白&离心取上清液&减压浓缩&蒸馏水透析&透析袋内容液&3V乙醇沉析多糖&沉淀&真空干燥&精制多糖&离子交换层析（DEAE-32-Cellu-lose）&洗脱液&减压浓缩&3V乙醇沉析多糖&沉淀&银耳碱提取多糖&离子交换层析纯化（DEAE-32-Cellulose）&洗脱液&减压浓缩&3V乙醇沉析多糖&沉淀干燥&均一体银耳碱提取多糖。
2.2.1 水提取 取300g银耳孢子发酵粉（中国医学科学院生物扶研究所药厂提供），加入10倍量的水，煮提约4h。煮后放冷，将提取液离心（15min，4000r/min）。提取后的残渣加入约10倍的水，以相同的方法煮提2次并离心分离，收集沉淀。合并3次所得的上清液，浓缩至小体积后放置，另作它用。取少许沉淀，加入水搅拌溶解后离心（15min，4000r/min），用苯酚-硫酸法检测上清液反应阴性。将所得沉淀于50℃烘箱中烘干，粗多糖重量为188.8g。
　　2.2.2 碱液提取 取140g粗多糖，加入0.5mol/L NaOH1000ml，搅拦提取6h，离心15min，沉淀以相同的方法再提取2次，合并3次所得的提取液，沉淀另置。将提取液减压浓缩至约原体积的1/3，以1mol/L的HCl中和至pH=7，中和液减压浓缩至小体积。浓缩后的中和液用流动水透析3天。透析后的溶液用3V85%乙醇沉析，离心15min。收集沉淀，得到0.5mol/L NaOH提取的碱溶性多糖（62g）。0.5mol/L NaOH提取后的粗多糖，继用1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH、5mol/L NaOH分别进行提取，得到1mol/L NaOH（48g）、2.5mol/L NaOH（33g）、5mol/L NaOH（10g）。将0.5mol/L NaOH提取物用约700ml水搅拌溶解，加入175ml Sevag试剂（氯仿:正丁醇=4:1），机械搅拌0.5h，离心（15min，4000r/min）。反复用此法除蛋白，直至无蛋白质反应为止。将所得上清液减压浓缩至小体积，流动水透析3天，透析袋内溶液用3V85%乙醇沉析。抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得0.5mol/L NaOH提取精制多糖，称重为4.470g。以相同的方法对上述1mol/L NaOH、2.5mol/L NaOH、5mol/L NaOH提取物除蛋白。除蛋白后的各提取物重量分别为3.908g、0.929g、0.399g。
　　2.2.3 分离、纯化 （1）分离 ［7～10］ :取600mg0.5mol/L NaOH提取所得精制多糖加入10ml蒸馏水，使之充分溶解，抽滤，取滤液。将滤液加于已经预处理的DEAE-32-纤维素层析柱，用0.1M NaCl溶液洗脱，流速为0.5ml/min，每10ml为1个单位分部收集，苯酚-硫酸法检测。合并单一洗脱峰浓缩至小体积，以流动水透析。透析液加入3V85%乙醇沉析。抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，多糖重量为148mg。以相同的方法分别对1mol/L NaOH（348mg）、2.5mol/L NaOH（558mg）、5mol/L NaOH提取物（399mg）进行DEAE-32-纤维素柱层析，分别得到单一洗脱峰。1M，2.5M，5M提取物分别得多糖113mg，180mg，157mg。
　　（2）纯化:用（1）相同的方法分别对0.5M、1M、2.5M、5M提取物所得多糖用DEAE-32-cellulose柱层析纯化，洗脱液为0.1MNaCl，苯酚-硫酸法检测。所得多糖纯品重量分别为TFFB-A112mg、TFFB-B82mg、TFFB-C98mg、TFFB-D121mg。
　　2.4 纯度检查（醋酸纤维素薄膜电泳法） 取醋酸纤维素 薄膜（2cm&10cm），置于缓冲液中浸泡10min后取出，吸去 多余的水分，在薄膜中央点样，电压为240V，电泳约40min。电泳完毕后，取出薄膜，置于染色液中染色15min后脱色。结果TFFB-A、TFFB-B、TFFB-C、TFFB-D四个样品于薄膜负极方向均有一个斑点。
　　2.5 单糖组成分析
　　2.5.1 纸层析 分别取各个多糖纯品10mg溶于2ml2mol/L三氟乙酸中，封管，沸水中水解6h。冷却后点样于What-man No.1层析滤纸上，用乙酸乙酯-吡啶-水-冰醋酸（5:5:3:1）展开剂饱和后展开，展开后用苯胺-邻苯二甲酸显色，用相应的标准品做对照。结果如图1。
　　图1 银耳碱提取多糖水解物纸层析结果（略）1D-葡萄糖 2D-半乳糖 3D-甘露糖4D-木糖& 5TFFB-A& 6TFFB-B7TFFB-C& 8TFFB-D& 9葡萄糖醛酸10D-阿拉伯糖 11鼠李糖 12D-果糖
　　从图1中可以看出，TFFB-A单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-B单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-C单糖组成为:鼠李糖、葡萄糖或甘露糖;TFFB-D单糖组成为:木糖、葡萄糖或甘露糖或半乳糖。各糖的Rf值之比为:D-葡萄糖;D-半乳糖;D-甘露糖;D-木糖:葡萄糖醛酸:D-阿拉伯糖:L-鼠李糖:D-果糖=1:0.9:1:1.2:0.8:1:1.5:0.8。
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