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节旋藻二类内含子GII+intron基因特性分析
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[讨论]有没有病毒的基因组ORF内存在内含子的
是不是某些病毒复制转录,需要一些启动子元件:增强子,TATA,GC......?
内含子的发现
1977年美国的Sharp和Roberts两组科学家分别同时发现了断裂基因(split gene)，Crick称此为分子遗传学上的一次微型革命，这项发现与1993年荣获了诺贝尔奖。
就在Sharp和Roberts发现内含子之前，法国的科学家Chambon也率领一个小组进行了有关实验。他们在思考一个问题，鸡的输卵管分泌卵清蛋白、卵粘蛋白和伴清蛋白，而其红细胞（鸟类的红细胞上有核的）只合成血红蛋白，那么两种组织之间DNA有什么不同呢？于是他们提取两种组织的DNA，分别用酶（EcoR1和HindIII）切成几段，走电泳，再用卵清蛋白mRNA来制备cDNA探针和以上两片进行southern杂交，结果两种组织中的DNA不论用哪一种酶来切，都出现了相同的多条阳性杂交带。实验表明不论是红细胞还是输卵管的细胞，虽基因表达不同，但DNA的结构没有差异。但令它们不解的是cDNA序列内并没有EcoRI和HindIII的切点，为什么会出现多条阳性带。
几个月以后Berget，Sharp小组和Roberts小组同时发现了腺病毒外壳蛋白六聚体基因（Hexon gene）前导区有断裂现象。他们用限制性内切酶EcoRI和HindIII分别消解腺病毒的DNA，得到了大小不同的很多片段，分别选择两种酶切片段中的最大的A片段DNA和Hexon的mRNA进行杂交，在电镜下可以观察到EcoRI酶切的A片段的3'段可以和上述mRNA形成杂合双链，但在杂合双链的5'端逸出3个单链DNA环，说明它们不能和mDNA完全互补。他们的解释是Hexon基因5'端出现了断裂，即有些区域在mRNA中已被删除了，所以出现了不配对的单链环，而HindIII酶切的A片段是Hexon的3'段区域，不含有这一断裂区域，故不出现单链环。
Berget在冷泉港作了有关发现断裂基因的学术报告，提出在Hexon基因内近5'端有不编码的部分。Chambon听了报告后便意识到，他们的实验结果也是可以用断裂基因来解释的。即卵清蛋白的基因上可能有多个断裂区（内含子）。在这些断裂区上有酶切位点的存在，可将卵清蛋白基因切成大小不同的片段，但它们都可以和mRNA进行杂交。事后Chambon()等用Berget的实验方法进行了分子杂交，果然出现了7个单链DNA的环，表面有个断裂区的存在，虽然错过良机，但证实了自己的推测仍然是很值得称赞的事。 噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的，具有内含子，除了正链RNA病毒之外，真核细胞病毒的基因都是先转录成mRNA前体，再经加工才能切除内含子成为成熟的mRNA。更为有趣的是，有些真核病毒的内含子或其中的一部分，对某一个基因来说是内含子，而对另一个基因却是外显子。如SV40和多瘤病毒（polyomavirus）的早期基因就是这样。SV40的早期基因即大T和小t抗原的基因都是从5146开始反时针方向进行，大T抗原基因到2676位终止，而小t抗原到4624位即终止了，但是，从之间一段346bp的片段是大T抗原基因的内含子，而该内含子中从之间的DNA序列则是小t抗原的编码基因。同样，在多瘤病毒中，大T抗原基因中的内含子则是中T和t抗原的编码基因。 病毒编码的启动子和增强子研究进展
上海医科大学卫生部分病毒学重点实验室武力 综述 闻玉梅 审校
　　摘要　本文介绍病毒编码的启动子和增强子的结构和功能特点。综述人类免疫缺陷病毒（HIV）、人单纯疱疹病毒（HSV）、巨细胞病毒（CMV）、人乳头瘤病毒（HPV）、Epstein-Barr病毒（EBV）和乙型肝炎病毒（HBV）启动子和增强子研究的主要进展，单阐述这些启动子、增强子在病毒转录及调控中的作用及其机制和目前研究中有待解决的问题。
　　病毒的复制是病毒致病机制的重要环节，病毒基因的表达与调控又是病毒复制研究的核心问题。研究病毒基因转录调控不仅可揭示宿主细胞的某些基因调节机制，对阐明真核细胞基因表达调控有重要理论意义，而且为阐明病毒的致病机制、防治相关疾病及病毒载体的高效应用提供依据。
　　动物和人类病毒的基因转录调控机制与高等真核细胞的基因转录调控机制类同，基本有两类具有基因转录调控作用的顺式作用元件：①启动子基本元件（basal promoter element），是对有效转录起始所必需的，但只能维持低水平的基础转录；②启动子调控元件（modulator promoter element），包括增强子和起负调节作用的沉默子（silencer,或译作用抑制子）可分别增强或减弱基础转录的效率。
　　一、病毒编码的启动子和增强子概况 　　启动子是指位于转录起始上游确保转录精确而有效地起始的DNA序列，是分子上结合RNA聚合酶并形成转录起始复合物的区域，通常还包括促进这一过程的调节蛋白质结合位点。最常见的启动子基本元件为TATA框（TATA box）。典型的病毒及真核生物启动子序列长约100bp，由两部分组成：①位于转录起始点近侧的启动子基本元件，即起始子（INR），位于基因转录起始处。HIV、腺病毒（AdV）主要晚期基因和某些真核INR的共有序列的YAYTCYYY（Y为嘧啶）。②位于转录起始位点侧的启动子上游元件（UPE），或称启动子上游激活序列（UAS）。UPE可增强TAT框和（或）INR元件的活性。病毒常见的UPE的类型及其相应DNA结合蛋白的比较见下表。病毒编码的启动子具有一般真核基因启动子元件的结构，但又有某些特点。如痘病毒的早期启动子缺少UPE，而晚期启动子需要UPE才能高效表达。
增强子是指能使它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列，其增强作用相对不依赖于它的位置、方向以及与目标启动子的距离，无基因专一性，可在不同基因组合中表现增强效应。其功能主要是通过与调节蛋白相互作用刺激特定的一个或一组基因的基础转录活性。增强子常由一个或多个连续或不连续的DNA序列元件组成，并与特异的蛋白质相互作用。这些DNA结合蛋白可由病毒本身编码，也可由宿主细胞编码。绝大多数增强子中没有保守序列，而其各亚单位（enhanson）序列可以是保守的，并有严格的空间位置限制，以保证与各亚单位结合的反式作用因子能够相互作用形成蛋白质复合体并调节转录活性。
　　病毒增强子按功能可分为诱生性和组织特异性两种：前者如AdV和HSV的立即早期（IE）蛋白可作用于许多不同的聚合酶Ⅱ、Ⅲ启动子和另一些序列，发挥对基因转录的反式激活或阻抑作用。后者如HPV 16的上游调节区（URR）内有一部分回文结构为增强子保守序列，它对宫颈癌细胞是特异的。除逆转录病毒外，RNA病毒的启动子迄今研究得很不充分。
　　二、几种人类病毒编码的启动子和增强子研究进展　　HIV：HIV最大特点就是含有很多调控基因。长末端重复序列（LTR）位于HIV基因组两端，序列高度保守。LTR 5’端含有HIV基因调控必需的多个特定区域，是一组真核增强子和启动子单位。其中研究最多的是NFκB结合位点，即增强子区，位于U3功能区C基因启动子的上游。在HIV-1，它由2个10bp的序列组成，诱变试验证实这2个位点都具有功能。而HIV-2中只含一个保守的NFκB位点，另一个位点则无功能。该序列负责调节HIV基因在多种细胞，特别是T细胞中的高效表达。 　　HIV-1 LTR核心转录单位有；①刺激蛋白1（SP1）结合位点，在核心转录单位GC丰富区连续有3个SP1结合位点，在HIV-2则有4个。②TATA框。此TATA框及 其侧翼区在HIV转录调控中发挥重要作用，病毒转录起始于此TATA框下游22bp处。变异后可降低启动子基因活性及影响病毒在细胞培养中的转录。③起始子：在TATA序列下游这些突变可降低HIV-1基因的转录。具有锌脂结构的细胞起始子结合蛋白（YY1）和TF Ⅱ可结合到细胞启动子的起始子区。最近证实BCL6蛋白可特异性结合于HIV-1 U3启动子一增强子区域，此蛋白的锌脂结构域能抑制HIV-1由LTR起始的转录。
　　HIV、Rous肉瘤病毒（RSV）、小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）、嗜人T淋巴细胞病毒-Ⅱ（HTVL-Ⅱ）、牛免疫缺陷病毒（BIV）等逆转录病毒的LTR中既存在真核启动子结构，也存在原核启动子结构。这种真核、原核启动子镶嵌存在的现象可能是逆转录病毒LTR启动子的一种共性。
　　2.HSV：HSV基因可分为α、β和γ3组，分别相应为IE、E和L基因。在允许细胞中繁殖时，其时相调节可分3期，第1期为立即早期（IE），转录并不完全全需要病毒蛋白的合成，IE启动子上游区和增强子中有TAAT-GARAT基序以及SP1结合位点。第2期为早期（E）或迟早期（DE），DE基因的转录需要IE蛋白，DE启动子的上游区有CTF/NF-1、SF1结合位点和A+C丰富区。第3期为晚期（L），L基因的激活必需要有病毒DNA的复制，通过修饰模板发挥调节作用。L型启动子不具明显的TATAAA序列，而是TTAAT或TAAAT序列。目前对HSV-1基因结构的研究集中在两个方面：一是确定基因启动子序列，二是确定基因表达所必需的顺式作用位点。　　3.EBV：EBV有疱疹病毒科类同的基因组转录调控机制。其基因组的转录依靠细胞的RNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ。已发现20多个聚合酶Ⅱ启动子，可分为早期、晚期和隐性3类。启动子上游有TATAAAAA同源序列。EBV核抗原1（EBNA1）结合位点是依赖于EBNA的增强子的成分，也可能是隐性转录的控制区。在U5下游的TR区域发现一个新的启动子（称为ED2），其序列中不含有TATA或CAAT框，只含有GC富集区，推测该区域可单独与转录因子SP1结合而起始转录过程。 潜伏膜蛋白1( lMP 1)是EBV在鼻咽癌（NPC）细胞中编码的两种蛋白之一。B95-8株EBV感染的NPC细胞中检测到LMP 1基因的3.5kb和2.8kb转录物，提示一个转录物起始于启动子ED-L1的5’端。由NPC组织中分离的EBV变异株更强致病性的LMP 1基因，和B95-8株相比，其5’上游区明显突变。
　　与潜伏、生长转化相关的EBV基因控制区中不连续点的甲基化可抑制这些基因的表达。EBV感染的B细胞中6个核抗原的转录起始于早期启动子Wp，再转换为上游启动子Cp，其活性受EBNA1和EBNA2的调控。EBNA1在Wp向Cp转换和由此导致的EBV感染的B细胞的永生化中有重要作用。最近证实在Burkitt淋巴瘤和霍奇金病中，EBV主要潜伏启动子Cp（BamHI C）甲基化相关的抑制对这两种肿瘤的致病机制起重要作用，因可保护肿瘤逃逸CTL应答。
　　4．HPV：HPV基因转录的主要调节系统位上于上游调节区（URR）或长控制区（LCR），关键调节蛋白E2有3个结构域。N端保守区有2个启动子。LCR中的HPV增强子可与细胞因子及病毒编码的转录因子作用，这些组织特异性的增强子元件在HPV基因起始表达和维持持续感染中有重要作用。HPV的恶性转化能力与病毒E6、E7基因的表达直接相关。HPV-16的P97启动子研究较多，致病力较强的HPV-16和HPV-18和分别由2个启动子调控完整的E6、E7 mRNA的合成，而致病力较弱的HPV-6和HPV-11和E6、E7基因分别由2个单独的启动子调控表达。HPV-16的增强了其中有7个NF-1、3个AP-1、1个黄体酮和糖皮质激素受体、1个PVF以及1个NFA的结合位点，HPV-16增强的上皮细胞特异性是这些激活蛋白相互作用的结果。HPV-18组成型增强子的转录活性主要靠AP1序列组件和增强子5’旁侧区顺式激活元件之间的协同作用。HPV-18增强子元件受到启动子特性的影响，并有细胞类型特异性。HPV-31的URR区的保守序列为TTTGGTTT，而在HPV-16中，这一序列为TTTGGCTT，是角蛋白依赖性增强子的一部分，与HPV嗜上皮性有关。
　　5．CMV：CMV基因组有229kb，属疱疹病毒亚β科。CMV DNA只有一个单向性的IE启动子复合体，可指导多个基因的表达。在IE94基因上游存在一个强启动子，IE94的上游区比SV40病毒的72bp重复序列具有更高的增强子功能。IE94基因启动子区序列分析证明这一区段内有多个回文结构，并相间着保守的序列。在这一区段的-50～-580bp之间至少有4套13～18bp的重复序列。IE1和IE2蛋白的表达受增强子的调控，此增强子也称为主要增强子立即早期启动了一增强子、IE1/IE2增强子或CMV增强子，是上游调节区复合体的一部分。因集中了细胞转录因子结合位点而具有异常高的活性，并且在多种类型的细胞的影响条件下均有活性。根据对基因表达的影响可将此增强子分为3个区。在CMV感染中，增强子调控的表达先激活后抑制。在CMV复制早期可诱导NF-κB、AP-1和CREB/ATF等细胞转录因子与增强子中多位点结合。感染后可诱导产生NF-kB和 aP-1。在感染晚期，ATF的结合受影响，其活性受病毒基因产物的调节。
　　CMV启动子/增强子被广泛应用于构建高效真核表达载体，用于基因工程、基因治疗和DNA免疫。用基因小鼠分析CMV增强子活性，其主要立即早期启动子（MIEP）的转录活性可能部分决定病毒在子宫内特异性感染胎儿组织的能力。MIEP不是广泛特异性的启动子，因在转基因小鼠中，表达由MIEP调控的报告基因的组织和CMV自然感染的组织一致的。
　　6．HBV：HBV基因组仅有3.2kb，结构紧密，所有调控序列均位于蛋白编码区，是研究真核基因表达调控的理想模型。HBV3.5kb、2.4kb、2．1kb和0.9kb的RNA转录物的起始点附近各有一个启动子，分别为C、SPⅠ、SPⅡ和X启动子。其长度为100-300bp，其中有一些保守序列，如SPⅠ启动子有类似TATA框的序列，C启动子有类似ATA框的序列等。但总体上，嗜肝病毒启动子和保守序列与已知启动子元件的共有序列同源性较低，说明HBV的启动子元件可能是一类独特的启动子序列。
　　SPⅠ启动子负责2.4kb mRNA的转录，其产物是表面抗原大蛋白。在SPⅠ启动子含有肝细胞特异性的转录因子HNF1的结合位点，与TATA框相隔45bp中间有一个Oct-1结合位点。HNF1结合位点主要出现于某些仅在肝细胞中专一表达基因的启动子区，是SPⅠ启动子在分化的肝癌细胞株中进行高水平转录的必要条件。SPⅠ启动子的AT丰富区中有一个AFP-1结合位点，可能与肝细胞特性转录有关。SPⅡ启动子负责2.1kb mRNA的转录，调控表面抗原中蛋白和主蛋白的表达。SPⅡ可分为A～G7个区段，其中D区对SPⅡ的活性是必需的。这7个区都可能通过与序列特异性的DNA结合蛋白相互作用而影响转录水平，其中5个负责正调节的转录因子结合位点（A～E，G），1个负责负调节的转录因子结合位点（F）。Raney等发现SPⅡ启动子B、D、E、F区均可与转录激活蛋白SPⅠ相结合。HBV的L和X基因mRNA在体内肝组织中表达很低，但在转染的肝癌细胞系中高效表达，X基因mRNA在转染的HepG2细胞中可高效表达，但在HBV感染的肝细胞中却检测不到。对体内控制X基因mRNA稳定状态水平的因子尚不明确。
　　HBV的2个增强子分别为1 074～1 234位核苷酸的ENⅠ和1 627-1 774位的ENⅡ。ENⅠ在S基因和X基因之间，与X基因启动子重叠，可增强C、SPⅠ、SPⅡ和X启动子的转录，但效率不同，如对下游的C启动子比对X启动子的增强作用高60倍。与ENⅠ结合的转录因子有非肝细胞特异性的NF-1、AP-1、NF-kB和EF-C/RF-X，以及肝细胞特异性的C/EBP/HNF-4和HBLF。ENⅠ对C启动子的作用不是直接的，而是通过与ENⅡ协同作用，ENⅡ可分为ENⅡ-A和ENⅡ-B。前者是正调节元件，与ENⅡ的肝细胞特异性有关，必须与后者协同作用才有活性。后者是ENⅡ的基本单位，有60%～70%的ENⅡ活性，又可分为B1、B2和B33个亚区，前两部分是主要功能区，B2是主要转录因子的结合位点。ENⅡ有可与相应的蛋白因子C/EBP和HNF-4结合的位点。HNF3能结合B2亚区并激活ENⅡ的活性，在ENⅡ的肝细胞特异性中起重要作用。B1亚区也结合有肝细胞特异的因子，只存在于HepG2细胞中，而不存在于CCL13细胞和HeLa细胞中。ENⅡ对于分化的肝细胞和肝癌细胞有显著的特异性，可增强C、SPⅠ、SPⅡ和X启动子的转录。在ENⅡ/C启动子区内发现了两个SPⅠ结合区，含有3个SPⅠ结合位点。严重肝病的免疫抑制患者在ENⅡ/C启动子区内有基因变异，而在肝病轻微的免疫抑制患者中则无此类变异。这类具有HNF1结合位点的突变使pre-C mRNA水平显著降低，而C基因mRNA/前基因组RNA水平增加，使HBeAg表达缺损，HBV水平增强，蛋白水平改变，提示这类变异在乙型肝炎病理中起一定作用。HBV基因组的GRE序列表现出增强子的基本特性，可与激素受体结合而提高特定基因的转录水平。
　　用含有LDL受体基因的重组腺病毒分别在HBV C启动子、C启动子和ENⅠ、HBV-CMV杂合启动子转录控制下表达，与CMV IE启动子驱动的表达相比，前三者有较高水平LDL受体基因表达，且有肝细胞特异性。小鼠体内实验证实前三者在肝脏中与后者表达相同，而在肺和骨骼肌中表达很低。HBV-CMV杂合启动子在体内和体外均有较强活性，可用于肝脏基因治疗。
　　三、研究病毒编码的启动子及增强子的意义和有待解决的问题
　　研究病毒的启动子及增强子为了解真核生物基因组调控提供了模型。应用病毒的启动子和增强子等基因转录调节原理构建各类基因工程载体（包括克隆、表达、检测、基因治疗载体），可有效提高目的转录、表达效率，还可通过抑制细胞内某种特异性病毒反式激活蛋白，寻找抗病毒治疗新的途径。转录因子也是设计各种新药的重要基础之一。如用反义寡核苷酸与相应的启动子或增强子结合，抑制病毒某些基因的表达而起到抗病毒治疗的目的，在乙型肝炎的治疗研究中已有应用。
　　病毒基因组有效转录并非专一的顺式与反式激活因子相互作用的结果，常是多种DNA结合蛋白与DNA之间和（或）DNA结合蛋白与其他蛋白质互相作用的结果。因而不能孤立地看待病毒某个启动子或增强子在基因转录调控中的作用。
　　启动子和增强子作用机制尚不很清楚。目前对真核基因启动子作用的机制有两种解释：①RNA聚合酶首先的基因5'上游较远端的作用位点相结合，然后移向起始区；②染色质的次级结构可能使某些线性DNA链上有一定距离的位点聚合在一起。增强子作用机制有以下几种假说；①增强子为转录因子提供进入启动子区的位点；②增强子可改变染色质或DNA的构象，即增强子作用机制的拓扑模型；③增强子模块化作用模型。 人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组就是RNA
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内含子与基因表达调控
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如何分析基因组序列中存在的内含子和外显子
中心实验室
如何分析基因组序列中存在的内含子和外显子
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这个帖子发布于9年零295天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
测得病毒的全基因组序列，如何准确的得到它的intron和exon序列？
手头找到的软件利用HMM原理 好像都要输入protein序列做alignment,但我哪里有protein的序列啊？一些序列分析软件预测的准确性如何知道？怎样确认该ORF 是编码区？高手请指教？
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直接用病毒的基因预测工具来预测。如GeneMark等，http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/这样的工具很多，需要鉴别一下，并尝试几个程序。另外，老兄好像是计算机相关专业的，病毒基因组的结构相当紧凑，所以一般会出现基因读码框（ORF）的重叠，而很难有intron和exon的结构。
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有没有针对病毒基因组的基因预测工具，GeneMark好像真核原核的都可以用，是吗
中心实验室
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Revelation：的确不错，绝大多数病毒的基因组不会出现intron，重叠基因的情况倒比较多，但是腺病毒例外，它含有intron，文献报道的它的其中一个基因E1A:577-648,
里面就含有intron。
大家有没有见到别的病毒含有intron？
中心实验室
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超马兄：GeneMark是针对原核生物设计的软件，对于真核可能效果不好，不知道你分析的是什么病毒？另外上贴中也讲过，除了腺病毒我还不清楚哪些病毒含有intron，别的病毒用genemark可以分析，当然还有GenScan：http://genes.mit.edu/GENSCAN.html很不错的，但这些只是预测，准确性很难说。
关于丁香园（遗传学专业论文）节旋藻二类内含子GII+intron基因特性分析论文,分析,遗传,GII..
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