细胞培养技术中的原代细胞按1：细胞株为什么是按1：4分种传代?_百度作业帮
细胞培养技术中的原代细胞按1：细胞株为什么是按1：4分种传代?
细胞培养技术中的原代细胞按1：细胞株为什么是按1：4分种传代?
原代细胞按1：2分种传代就是指将1瓶细胞瓶内的原代细胞接种到2个细胞瓶内进行传代培养.细胞株为什么按1：4的话就不是非常清楚了……我感觉按什么比例接种应该是根据细胞密度、实验目的等来决定的吧,而不是说所有细胞株都要按1：4传代的.
按比例传代的原因主要是：1、原代细胞以及一些细胞株有密度依赖性，如果细胞密度不够，细胞就不容易生长，甚至很快会死亡；2、如果接种密度太大，细胞生长太快，你就需要频繁传代，很累。所以，根据什么比例传代取决于细胞的特性和你的目的，实际操作中凭经验，有时估计下就好。有些肿瘤细胞没有密度依赖性，在瓶子里放上几个，你就可以长时间不去处理它。...
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大鼠肾小管上皮细胞的原代培养及传代
来源：青年人()&更新时间： 15:47:42 &【字体： 】
【摘要】　目的　建立大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定方法。方法　采用研磨、消化培养法，并以0.25%胰蛋白酶(A组)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA(B组)分别消化、传代、对比，以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类。 结果　成功培养、传代(13～18代)并鉴定(抗Cytokeratin 18抗体)了肾小管上皮细胞，发现A组消化传代效果明显优于B组。 结论　0.25%胰蛋白酶消化传代方法是大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定的有效手段。　　【关键词】　大鼠　肾小管上皮细胞　细胞培养
primary culture and passage of rat kidney tubular epithelial cells in rats　WANG Dong, WU Xiongfei, JIN Xiyu. Department of Urology, Southwestern Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038　　【Abstract】　Objective 　To establish a method for primary culture, passage and identification of rat renal tubular epithelial cells. Method　Grinding and digesting were used in primqry culture, and 0.25% tryspase (group A) and 0.25% tryspase-0.02% EDTA (group B) were respectively used in passage. The cell types were identified by immunocytochemistry. Result　The primary and secondary culture of renal tubular epithelial cells were both successful (the passage number could reach 13-18),so was the identification of the cultured cells. The passage effect of group A was significantly better than of group B. Conclusion　The present method (group A) is an efficient means for the primary culture, passage and identification of rat kidney tubular epithelial cells.　　【Key words】　Renal tubular epithelial cell　　Cell culture　　Rat
　　我们通过本研究建立了一种Wistar大鼠肾小管上皮细胞原代培养、传代及鉴定的方法，现将方法报道如下。
材料与方法　　1.材料　① Wistar大鼠10只(雌2雄8)，重50g(第三军医大学实验动物中心)。② RPMI1640(GIBCO)。③ 新生小牛血清(第三军医大学分子生物学教研室生产)。④ 胰蛋白酶(GIBCO)。⑤ 抗细胞角质素(Cytokeratin 18 CY90)抗体、SABC、DAB试剂盒(BOSTER，武汉博士得公司)。　　2.肾小管上皮细胞的原代培养　① 肾小管节段的分离：大鼠实验前12小时禁食，自由进水；处死后无菌取肾，置于生理盐水的培养皿中(25℃)，分离、剪碎肾皮质并置于80目不锈钢网筛，研磨并以生理盐水充分冲洗，网下液体倒至100目不锈钢网筛上，收集网上物于装有生理盐水的培养皿中，充分吹吸后，1000转/分钟，离心10分钟。② 肾小管节段的消化及培养：离心后弃上清液，加入0.2%胰蛋白酶1.5～2.0ml，充分吹打使之混匀消化液与离心物，置于37℃振动水浴中，消化20分钟，1500转/分钟×5分钟，小心弃上清后加入5ml含有10%新生小牛血清的RPMI1640培养液，充分吹打混匀后装入培养瓶中。置孵育箱(37℃5%CO2)培养。　　3.原代肾小管上皮细胞的传代　原代培养第5～6天，细胞完全铺满瓶底。倒空瓶内培养液，加入少许无血清RPMI1640培养液，摇动使之浸润所有细胞后倒出，分两组分别滴加0.25%胰蛋白酶(A组)和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA复合消化液(B组)，液量能覆盖瓶底所有细胞即可，置孵箱中3～5分钟，约85%细胞收缩、变圆、少许脱落，A组立即加入双倍量含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液，轻摇混匀，B组先小心倒出消化液后加入上述同样培养液。两组均以弯头吸管顺瓶底依次轻轻吹打，1500转/分钟×5分钟，弃上清，加入含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液，充分吹打混匀，细胞计数后分别装入培养瓶中。　　4.肾小管上皮细胞的鉴定　常规免疫细胞化学方法［1］。一抗为1∶400Cytoteratin18，二抗为1∶100的山羊抗小鼠。
结　果　　1.原代培养细胞生长观察(倒置显微镜)　培养瓶中的细胞节段于12小时左右贴壁，24～36小时后始见有上皮样细胞从节段周边“长出”，72小时更换培养液一次，96小时细胞呈指数性增长，120～144小时基本铺满瓶底，计数为1.86×106个细胞/ml。其形态为多边鹅卵石样，体积较大，镜下透明度及折光性强，各细胞紧密相靠，互相衔接，可见融合成片及复层生长；较分散细胞贴壁后形态不一，体积增大，较为伸展，镜下透明度增大而折光减弱。　　2.传代后生长情况　A组：首次传代的细胞于传代后第2天贴壁，第3～4天生长良好，第5～6天更换培养液，第10～11天细胞呈指数性生长，形态为多边鹅卵石样，衔接紧密，复层生长现象减少，镜下透明度及折光性同前，第12～14天细胞铺满瓶底，以相同方法继续传代，其生长周期、细胞形态及镜下反光强度变化不大。继续以同方法可顺次传至第13～18代，其后细胞贴壁逐渐减少。B组： 传代细胞至第3天方有极少量贴壁，且细胞形态不规则，胞浆内可见大量颗粒状物质，细胞间空隙较大，镜下折光性差，第4～5天时，贴壁细胞数量更明显减少，第6～8天时，细胞全部悬浮、大部分破碎、死亡。　　3.细胞鉴定　显色3～4分钟时，光镜下观察： 细胞核中空而胞浆染色的细胞形态，胞核周围和胞浆内可见不均匀散在分布、强度不一的棕褐色颗粒状、点状染色，并与阴性细胞交杂分布，对照组呈阴性。阳性染色证实培养细胞为肾小管上皮细胞。
讨　论　　目前直接对在体单个肾小管上皮细胞进行形态和功能研究仍然十分困难。体外培养的肾小管上皮细胞仍是广泛应用的研究对象。目前国外普遍使用的是BS-C-1肾小管上皮细胞株［2］，价格昂贵且不易获得。国内曾有学者用Wistar大鼠进行肾小管上皮细胞的原代培养［3］，且使用价格昂贵的胎牛血清。原代细胞不便于保证细胞性能的稳定和大量多项研究工作的同时开展［4］。本实验结果表明，在一定的方法和条件下，大鼠的肾小管上皮细胞生长状况良好，并且可以进行一定程度的传代，为进一步建立细胞株奠定了基础。　　细胞角蛋白作为上皮细胞的特异性标记，至今已发现了19型(或更多)，肾小管上皮细胞优先表达第18型(Cytokeratin 18)［1］，故我们选择该抗体对其进行特异性鉴定。虽然有研究表明，肾小球上皮细胞(足细胞、球囊上皮)也有角蛋白表达(未明确是否为18型)［5］，但我们使用研磨、分离方法可将肾小球结构滤过，仅保留肾小管节段(收集物中肾小管节段的纯度可达90%以上)［3］，使肾小球上皮细胞与肾小管上皮细胞分开，达到了纯化的目的［5］。本实验经免疫组化鉴定呈阳性反应者即是肾小管上皮细胞。　　本实验反复证实，使用胰蛋白酶加EDTA复合消化方法进行消化和传代时，肾小管上皮细胞贴壁所需时间长，贴壁数量少，无法保证继续传代。提示了肾小管上皮细胞对EDTA的高度敏感性和被抑制性。单纯使用胰蛋白酶时，细胞贴壁所需时间短，数量多，并可进行13～18次传代。提示一定程度内的胰蛋白酶对肾小管上皮细胞的损伤是可逆的，细胞可以通过一定时间的恢复、传代后，继续保持其正常的形态和功能。　　本研究中的实验动物为常用的Wistar大鼠，所用试剂简单、价廉，均为可以直接获得的普通产品，使得同期进行大批量的同种动物实验成为可能，操作简便易行，可重复性强，易于推广，可为有关肾小管上皮细胞的研究提供便利。
　　本课题为国家自然科学基金资助项目(No.)　　作者单位：400038重庆，第三军医大学西南医院泌尿外科
参考文献1　蔡文琴，王伯. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 成都： 四川科学技术出版社，.2　Gailit J, Colflesh D,Rabiner I,et al. Redistribution and dysfunction of integrins in cultured renal epithelial cells exposed to oxidative stress. Am J Physiol，:F149-F157.3　田劲，陈香美，黎磊石. 冬虫夏草、大黄及肾大部切除大鼠血清对肾小管上皮细胞生长的影响. 中西医结合杂志，7-549.4　司徒镇强，吴军正. 细胞培养. 西安： 世界图书出版公司，.5　Mattila PM, Nietosvaara YA, Ustinov JK, et al. Antigen expression in different parenchymal cell types of rat kidney and heart. Kid Int，-233.
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什么叫原代培养?传代培养?细胞株?细胞系?
细胞培养的几个概念
帮你找到些：
动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养。
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