& 【求助】含8M尿素的样品能直接上样做SDS-PAGE吗？
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【求助】含8M尿素的样品能直接上样做SDS-PAGE吗？
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【求助】含8M尿素的样品能直接上样做SDS-PAGE吗？
请教一个SDS-PAGE的问题，急求答案：含8M尿素的样品能直接上样做SDS-PAGE吗？8M尿素的pH应该是碱性的吧，对SDS-PAGE系统肯定会有影响是吧。请各位知道的兄弟姐妹帮帮忙！先谢谢了。
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没问题啊，要是盐酸胍就不行了
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可以的，盐酸胍的就需要处理一下再上样
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哦，谢谢你们的解答，那加入尿素后不会影响SDS-PAGE的电泳系统的pH吗？用不用透析除去尿素？
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电泳时样品不用透析，只是条带可能没有不含尿素的样品漂亮。
样品中的尿素不会影响到电泳体系的pH，因为电泳体系的缓冲能力很强，尿素的那一点弱碱性根本撼动不了体系pH。你看一看制胶、上样缓冲液的配方就明白了。
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可以直接上样，我每次都是这么做的，没有任何影响
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请教一个SDS-PAGE的问题，急求答案：含8M尿素的样品能直接上样做SDS-PAGE吗？8M尿素的pH应该是碱性的吧，对SDS-PAGE系统肯定会有影响是吧。请各位知道的兄弟姐妹帮帮忙！先谢谢了。
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直接跑没问题。
盐浓度高的会向低浓度的地方扩散，所以如果同时有多个样品条带，边上的会歪。（可以在两边各加1条同浓度的空白来压住你的8M的样品）
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我近来跑的都是尿素变性样，完全不会影响！可能和跑胶系统也有关吧！我们实验室里用的是Tris-Tricine系统（缓冲液分阴阳极），而不是甘氨酸系统（只用一种缓冲液）！Tris-Tricine系统似乎对盐浓度等不太敏感。如果觉得甘氨酸系统跑得不好看的话，不妨换这种系统试试！
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哦，谢谢yes4的宝贵意见，我们实验室也是用的Tris-Tricine系统，只是没有跑尿素变性样，我的肽样不在实际位置，偏大了好多，在胶上显示很粗的带，我在想我的东西会不会在沉淀里，所以想加点尿素再跑一次试试，还没跑，等有了结果我再回来反馈呵&& 查看话题
如何处理后盐酸胍变性的蛋白液，跑SDS-PAGE电泳。
最近在做蛋白的纯化，蛋白分离后，用盐酸胍变性，通过AKTA纯化蛋白，但没有收集到蛋白。想知道蛋白液是否在挂柱子时流失，想对挂柱子的流出液跑SDS-PAGE胶检测，但是流出液中有盐酸胍，遇到loadingbuffere 析出白色物质，无法跑电泳，这里求助高手，怎样处理含有盐酸胍的样本来跑SDS-PAGE电泳。先谢谢谢谢啦，请各位高手多多帮助
盐酸胍处理的蛋白经过处理后是可以用来进行SDS-PAGE的，具体做法如下：1份（如50ul）盐酸胍溶解的蛋白和9份(450ul)预冷的无水乙醇，混匀，-20摄氏度静置5min，4℃，13000rpm离心10min，弃上清，然后用1ml预冷的75%的酒精将肉眼可见的蛋白团块重新悬浮起来，-20摄氏度静置5min，4℃，13000rpm离心10min，弃上清，然后用50ul 5×Loading buffer 溶解蛋白团块，剩下来的就剩下煮样跑胶了 : Originally posted by anyaxiong at
盐酸胍处理的蛋白经过处理后是可以用来进行SDS-PAGE的，具体做法如下：1份（如50ul）盐酸胍溶解的蛋白和9份(450ul)预冷的无水乙醇，混匀，-20摄氏度静置5min，4℃，13000rpm离心10min，弃上清，然后用1ml预冷的75%的 ... 您好，还想向您好好学习，咨询一下：我把柱子离心后跑了胶，发现有蛋白，没洗脱干净是一定的，我想知道，洗脱蛋白的洗脱液的配方是怎样的？或者说洗脱液中咪唑的浓度怎样？谢谢谢谢 盐酸胍变性的蛋白用含咪唑的buffer洗脱：8M尿素+20至50nM Tris+300至500mM NaCal+500mM咪唑，pH8.0洗脱，洗杂蛋白的buffer可以将咪唑浓度降低，如10/20/50mM咪唑，最后一步用500mM咪唑洗脱目的蛋白。 可以先用ＴＣＡ沉淀蛋白然后再制备样品
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【求助】涵体6M尿素溶解，电泳出现沉淀
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我表达的蛋白质呈包涵体，我按照Novagen的操作手册超声细胞，然后离心收集包涵体，6M尿素溶解，离心取上清，我想检测下这个上清是否是我要的蛋白，上样的时候加了loading buffer后，就析出了一堆沉淀，煮了后也没有很大的用处！怎么会这样啊！大家检测这包涵体的溶解液的时候有没有遇到过这个问题是怎么解决的？或者是我什么地方出现了问题才导致了这个情况啊？
急等！谢谢查看完整版本请点击这里：
remonte ( 10:12:39)
呵呵,正好我也在做包涵体的表达复性什么的.不过我也没有任何经验,只能从自己做过的方面来考虑了.
第一,你收集到破碎好的包涵体后,是否进行了包涵体洗涤?我们这里做的时候,都是先用TRITON洗一次,完了2M尿素洗两次,再1M尿素洗两次,最后离心后,才用6M的尿素溶解;
第二,你用多少克包涵体溶解到多少毫升的6M尿素中?如果你的包涵体量过多,可能就不溶了;
第三,我做的时候,是把包涵体溶解后,再进行复性,复性完了,把复性液离心,上清用三氯乙酸沉淀后再跑PAGE电泳,沉淀直接进行PAGE电泳,来看复性如何
不清楚你的包涵体是否需要进行复性,还是可以直接跑电泳.我自己也没有什么经验,是不是你的包涵体加得过多,直接就没有溶解在尿素中.你再说详细一些吧.
GOOD LUCK!!大家多交流多讨论,相互促进相互学习,共同进步
glass ( 10:13:40)
我现在在准备做包涵体的纯化 ，我是按照分子克隆上面的做的
需要裂解 洗涤 溶解
有两个方法可供选择
而且它的尿素需要8M尿素溶解
rxcc33 ( 10:14:02)
我现在换了盐酸胍来溶解新收集的包涵体，结果我发现哪怕是只用2M的盐酸胍溶液不含蛋白质和上样buffer混合都有无数沉淀析出来了，估计是SDS沉淀吧，我也只是这样怀疑，我刚刚又在上样，结果发现了这样的事实，搞得我很郁闷！这都凌晨了，疯了！
答楼上的楼上，我是完全按照Novagen的操作手册来的，收集菌体，超声破碎，离心收集包涵体，用不含盐酸胍的binding buffer洗涤，然后用6M的盐酸胍溶解，离心取上清，0.45um膜过滤，然后我就想检测下，我要的目的蛋白还在否，结果就发现盐酸胍和上样buffer生成沉淀了！哀号！
PS：你的头像太彪悍了！我缺睡得本来就～心，现在更了：（
remenb ( 10:15:52)
用盐酸胍溶解液直接加loading buffer跑电泳肯定是不行的，即使没有沉淀也因为盐浓度太高，跑不出好的条带。用尿素溶解好像没遇到你的情况，我想即使有点沉淀，你离心一下去上清跑也是可以的。
另外，你为什么非要溶解以后在跑呢，你直接取点包涵体，加1×loading buffer 溶解上样就可以了，就象菌种表达检测一样。
如果你用尿素或盐酸胍能把包涵体几乎全部溶解，那你要的蛋白肯定在溶解液里了，你说是不是?
阿司匹林 ( 10:16:11)
我也在做包含体,是GST融合蛋白,在裂解buffer 中加了TRITON X-100,超声破碎后,沉淀用Triton和DOC 洗两次,6M的尿素洗两次,然后用8M的尿素溶解,溶解效果不好,沉淀中有很多目的蛋白,而且上清中有很多杂蛋白.请大狭指点,谢谢
guagua ( 10:16:32)
我有一段小分子量的蛋白，诱导表达后以包涵体形式存在，
请问，我怎么设计我的纯化步骤？
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