猪—人尿酸酶的纯化与PEG化修饰研究—硕士毕业论文
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猪—人尿酸酶的纯化与PEG化修饰研究
[硕士毕业论文]【摘要】：尿酸是人体内嘌呤代谢的终产物,大部分嘌呤在肝脏通过氧化代谢后变成尿酸,尿酸70%从尿液排除,30%从肠道排除。由于尿酸及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会引发或加剧很多疾病,高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节引起的急性炎症和疼痛是痛风的主要病因,严重痛风可引起关节功能障碍。尿酸可刺激血管平滑肌细胞增殖,导致内皮细胞功能障碍。血浆高尿酸是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素。高尿酸血症时尿酸沉积在肾小管会造成肾功能障碍,高水平的血浆尿酸也是急性肾衰、肾小管损伤、IgA肾病炎症的主要危险因素。在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量裂解,胞内核酸大量降解,血浆尿酸急剧升高,引起以高尿酸血症为主的代谢紊乱和造成患者肾脏衰竭而死亡,此现象称为肿瘤裂解综合症。
尿酸氧化酶(urate oxidase, uricase)是一种在嘌呤代谢过程中把尿酸分解为尿囊素,二氧化碳和过氧化氢的酶,可利用分子氧把尿酸氧化成过氧化氢和溶解度比尿酸高5倍以上的尿囊素。为尿酸代谢的关键酶。目前国外对尿酸酶的研究颇为迅速,在欧洲,已从黄曲霉制备的尿酸酶治疗与白血病化疗有关的严重高尿酸血症的报告；其中一种重组黄曲霉尿酸酶被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综合征,但是尿酸酶又是一种外源蛋白,直接或重复使用易引发抗体降低疗效,而且易过敏,所以对于长期治疗,显然需要长效且无免疫原性的尿酸酶制剂,PEG化尿酸酶能够解决应用天然酶时遇到的这些问题,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是以CH2CH20为基础结构的大分子线性或分枝状多聚物。蛋白质的免疫原性由分子表面的抗原决定簇决定,PEG是一种线性、亲水、灵活且不带电的分子,当它与蛋白质的非必需基团共价结合时,可作为一种屏障,挡住蛋白质的抗原决定簇。低分子量的PEG(小于400Da)在体内经乙醇脱氢酶作用后能产生有毒的代谢产物,显示出毒性：但是,当PEG的分子量大于I000Da时其毒性就丧失。聚乙二醇具有免疫学惰性,即使分子量高达5.9×106Da,本身的免疫原性也很低。将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联,影响蛋白质的空间结构,最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变：化学稳定性增加,抵抗蛋白酶水解的能力提高,免疫原性和毒性降低或消失,体内半衰期延长,血浆清除率降低等。
但目前国内治疗高尿酸血症所引起的相关疾病还是用经典的别喋呤醇或用丙磺舒等药物促进尿酸排泄和控制急性发作药秋水仙碱、非甾体类抗炎药等,用药期间大部分能使尿酸下降,但停药则反弹,需要长期用药,许多患者不能耐受药物的毒副反应而使病情加重；所以对目前的降尿酸治疗策略疗效不够理想。因此目前对降低血浆尿酸的药物市场上存在巨大需求；尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊索的高效排泄能力使尿酸酶成为治疗高尿酸血症的理想候选药物。从体内尿酸代谢机制推段,高尿酸血症应伴随血浆的高水平黄喋呤,而实验也证实高尿酸血症伴随着高浓度血清黄嘌呤。尿酸酶制剂比活性越高则治疗所需剂量越小,治疗的成本就越低且安全性反越有保障。因此,抗黄嘌呤且催化效力高的尿酸酶才是治疗高尿酸血症的理想药用尿酸酶。
研究目的：将已构建好的工程菌BL21/pET28a进行诱导表达及表达后的目的蛋白通过多种分离纯化使其纯度达到96%及以上：然后将高纯度尿酸酶进行PEG化修饰并探索其最佳修饰条件；最后将修饰尿酸酶制备成冻干粉针剂。
实验方法：首先用乳糖对BL21/pET28a进行诱导表达,在37-℃下诱导5h,得到的高效表达产物采用尿酸酶法及Brodford法测定其酶活性及蛋白含量,然后通过SDS-PAGE蛋白电泳测定其目的蛋白条带；再根据目的蛋白的等电点、离子强度等因素,首先选择阴离子交换层析纯化,阴离子交换层析适应于蛋白体积较大、蛋白浓度较高、且其分离效果较好、较易操作和有浓缩作用等特点使其除去一部分杂蛋白,再将回收目的蛋白液中加入硫酸钠.,通过增大离子浓度影响疏水蛋白和疏水层析介质的相互作用,从而提高蛋白疏水性,通过疏水柱再次纯化,为了进一步分离不同聚合体形式和分离不同分子量而提高蛋白纯度,最后通过分子筛分离纯化,在每步纯化后都分别采用尿酸酶法及Brodford法测定其酶活性及蛋白含量,及通过SDS-PAGE蛋白电泳测定其纯化效果；然后对纯化尿酸酶进行mPEG-SC-10KD修饰,分别从尿酸酶和不同PEG摩尔比值对修饰反应的影响,不同尿酸酶蛋白浓度对PEG化修饰的结果,不同碳酸缓冲液PH值对PEG化修饰影响的结果,不同碳酸缓冲液浓度对PEG化修饰影响的结果这四个方面进行了研究；最后将修饰尿酸酶加入赋形剂,采用冷冻干燥法制备成粉针剂。
实验结果：诱导表达产物经蛋白电泳检测在0.1M PH6.8磷酸缓冲液中为不可溶性蛋白,经10.14碳酸缓冲液复溶沉淀得到大小为33KD的目的蛋白,破碎全菌液通过酶活检测,与尿酸反应,测定其具有较高的活性11.7U/ml。用Brodford法测定尿酸酶蛋白含量为4.9ug/ul,比活为2.4U/mg,沉淀复溶液酶活性为11U/ml。蛋白含量为3.4ug/ul,比活为3.4U/mg,虽然两者比较比活性有所提高,但结果还是较低,这与尿酸酶蛋白的纯度不是很高有关,通过蛋白电泳图可以清楚的看到蛋白液中含有大量大肠杆菌内源蛋白,需要通过后期纯化得到纯度较高,比活高的尿酸酶。将不溶于磷酸而含有目的蛋白的沉淀溶于0.02M pHl0.14的碳酸缓冲液中,依次进行了三步层析纯化,蛋白比活力由上样前未处理的4.6U/mg提高到15.3U/mg,纯度较上样前提高将近四倍,纯度仍然很低,蛋白损失达20%以上；在通过疏水层析纯化纯度又提高了21倍,比活性达到50U/mg,除去绝大部分杂蛋白；最后通过分子筛分离纯化,最终将目的蛋白尿酸酶的纯度提高了26倍,比活性达到62.2U/mg,比文献中报道的48U/mg还要高出10U。通过SDS-PAGE电泳检测及凝胶系统条带测定其纯度达96%以上。采用PEG化修饰后的尿酸酶,其最佳修饰结果为pH9.16,0.02mol/l的碳酸缓冲液,酶浓度为8mg/ml,修饰剂以1：13.5的摩尔比为最优修饰条件。本实验用：mPEG-SC-10KD修饰剂进行修饰是根据其修饰剂分子量越大对抗原的屏蔽作用越理想,修饰后毒副作用较少,本身的免疫原性也很低；有动物实验研究mPEG-SC-5KD修饰剂因其对抗原的屏蔽作用不理想,修饰后毒副作用较多,所以一般用其进行预实验；而mPEG-SC-10KD修饰剂因其理想效果用于正式实验。最后通过冷冻干燥方法将修饰尿酸酶制备成2.0ml/瓶的粉针剂。
结论：本实验成功表达出尿酸酶蛋白,并经多种分离纯化方法使其纯度达到及超过96%,探索PEG化修饰的最佳修饰条件并对其修饰后制备成粉针剂,为后期动物实验研究打下基础。
【关键词】：猪-人尿酸酶
【学位级别】：硕士【收录网站】：【学位授予年份】：2013【分类号】：R914【目录】：(注:以下目录后面的数字为论文页码)
中文摘要4-7Abstract7-14第一章 绪论14-19 1.1 引言14-15 1.2 研究尿酸酶的进展15-18
1.2.1 尿酸酶主要的反应机制15
1.2.2 尿酸酶的嘌呤代谢方式15-16
1.2.3 尿酸酶进化相关研究16
1.2.4 尿酸酶的化学修饰研究16-17
1.2.5 尿酸酶在医学诊断和治疗上的相关研究17-18 1.3 本研究的目的及意义18-19第二章 重组猪-人尿酸氧化酶蛋白的诱导表达19-27 2.1 引言19 2.2 材料与方法19-24
2.2.1 实验材料19-20
2.2.2 大肠杆菌BL21/pET28a-UO的诱导表达20
2.2.3 重组猪-人尿酸氧化酶蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳检测20-22
2.2.4 表达产物的酶活性测定22-23
2.2.5 蛋白含量测定23-24 2.3 结果与讨论24-27
2.3.1 诱导表达产物的SDS-PAG电泳检测结果24-25
2.3.2 表达产物尿酸酶活性检测结果25
2.3.3 表达产物尿酸酶蛋白含量检测结果25-26
2.3.4 讨论26-27第三章 重组猪-人尿酸酶蛋白的纯化27-54 3.1 引言27 3.2 材料27-29
3.2.1 试剂27-28
3.2.2 层析填料28
3.2.3 实验仪器28
3.2.4 溶液配制28-29 3.3 实验原理29-31
3.3.1 离子交换层析原理29-30
3.3.2 疏水层析原理30
3.3.3 凝胶层析原理30-31 3.4 实验方法31-33
3.4.1 阴离子交换层析31
3.4.2 疏水层析31-32
3.4.3 凝胶过滤层析32-33
3.4.4 纯化后重组猪-人尿酸氧化酶蛋白SDS-PAGE电泳检测33
3.4.5 纯化后重组猪-人尿酸氧化酶蛋白酶活性测定33
3.4.6 蛋白含量测定33
3.4.7 纯化尿酸酶SDS-PAGE电泳胶条带百分比分析33 3.5 结果33-52
3.5.1 阴离子交换层析280nm处洗脱峰图及SDS-PAGE电泳图结果33-35
3.5.2 疏水层析280nm处洗脱峰图及SDS-PAGE电泳图结果35-36
3.5.3 凝胶过滤层析280nm处洗脱峰图及SDS-PAGE电泳图结果36-37
3.5.4 三次层析纯化后酶液活力和蛋白含量结果37-38
3.5.5 纯化尿酸酶SDS-PAGE电泳胶条带百分比分析结果38-52 3.6 讨论52-54第四章 纯化尿酸酶PEG化修饰与尿酸酶冻干粉针剂的制备54-68 4.1 引言54 4.2 实验原理54-56 4.3 材料与方法56-59
4.3.1 材料56-58
4.3.2 实验方法58-59
4.3.2.1 纯品尿酸酶的预处理58
4.3.2.2 修饰重组猪-人尿酸氧化酶蛋白SDS-PAGE电泳检测58
4.3.2.3 修饰重组猪-人尿酸氧化酶蛋白SDS-PAGE电泳58
4.3.2.4 修饰重组猪-人尿酸氧化酶蛋白酶活性测定58
4.3.2.5 尿酸酶活性测定及活性单位定义58
4.3.2.6 蛋白含量测定58
4.3.2.7 纯化尿酸酶PEG化修饰的不同修饰条件58-59
4.3.2.8 修饰尿酸酶结合物的凝胶层析分离纯化59
4.3.2.9 修饰尿酸酶冻干粉针剂的制备59 4.4 实验结果59-66
4.4.1 尿酸酶和不同PEG摩尔比值对修饰反应的结果59-61
4.4.2 不同尿酸酶蛋白浓度对PEG化修饰的结果61-62
4.4.3 不同碳酸缓冲液pH值对PEG化修饰影响的结果62-64
4.4.4 不同碳酸缓冲液浓度对PEG化修饰影响的结果64-65
4.4.5 修饰尿酸酶结合物的凝胶层析分离纯化结果65-66
4.4.6 修饰尿酸酶冻干粉针剂制备结果66 4.5 讨论66-68第五章 结论与展望68-69 5.1 结论68 5.2 展望68-69致谢69-70参考文献70-76个人简介76-77
本篇论文共77页，。
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31、一种改良氧化酶试验装置[简介]： 本发明是一种竹叶青蛇*L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用，该方法从-70℃的冰箱已保存的竹叶青蛇*腺进行总RNA的提取，反转录成cDNA，根据Genebank中公布的序列AY277739利用引物设计软件进行设计引物，以cDNA为模板，利用R...32、竹叶青蛇*L-氨基酸氧化酶的制备方法及应用[简介]： 本发明公开了一种重组乙醇氧化酶rAOX的表达与纯化的方法。本发明运用分子生物学技术先构建乙醇氧化酶-多聚组氨酸表达载体pPIC9K-AOX-HIS，然后将其线性化后转入毕赤酵母GS115中，从而获得能够表达有活性的重组乙醇氧化酶...33、在毕赤酵母中进行重组乙醇氧化酶的表达与纯化的方法[简介]： 一种基于掺硼金刚石薄膜的抗坏血酸氧化酶传感器电极，由硼掺杂金刚石薄膜、氨基单分子层和酶膜层构成；其制备方法是：首先将钽片经表面预处理后，利用热丝CVD设备在钽片上沉积掺硼金刚石薄膜，然后对掺硼金刚石薄膜进行氨基...34、一种基于掺硼金刚石薄膜的抗坏血酸氧化酶传感器电极[简介]： 本发明涉及一种小鼠醛氧化酶转录水平定量PCR引物组合及PCR方法，PCR引物组合核苷酸序列为：正向：5’-ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3’反向：5’-TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC-3’。通过使用本发明的引物，对小鼠的醛氧化酶转录水平实施...35、小鼠醛氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法[简介]： 本发明公开了一种羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用，涉及五环三萜化合物的生物合成技术。羽扇豆醇C28氧化酶基因来源于长春花植物叶片，基因被命名为CYP716AL1，基因序列为①或②：①其核苷酸序列是SEQIDNO：1所示DNA分...36、羽扇豆醇C28氧化酶基因及其获得方法与应用[简介]： 本发明公开了使用氧化酶的测定方法。本发明提供了一种测定方法，所述测定方法使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定，并能够对样品中的溶解氧的影响进行修正。所述使用氧化酶对样品中的测定对象物进行测定的测定方法包括...
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37、使用氧化酶的测定方法[简介]： 一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法，先将34-乙撑二氧噻吩、十二烷基肌氨酸钠、碳钠米管、1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯配制成电解质溶液，再使用三电极体系在恒电位1.1V聚合60秒一步制得导电聚（34-乙...38、一种抗坏血酸氧化酶电化学生物传感复合修饰电极的制备方法[简介]： 本发明提供一种氧化酶活性的检测方法，包括：将待测溶液与氧化酶底物和芳基硼化合物混合，得到含有酚类化合物的中间待测溶液；采用电化学检测法检测所述中间待测溶液中酚类化合物的浓度，根据酚类化合物的浓度计算出待测溶...39、氧化酶活性和氧化酶底物浓度的检测方法[简介]： 提供的是涉及转基因或非转基因植物中的基因和或蛋白突变的组合物和方法。在某些实施方案中，本发明涉及原卟啉原IXP*基因中的突变。在一些实施方案中，本发明涉及具有除草剂抗性的植物。40、突变型原卟啉原IX氧化酶P*基因[简介]： 一种来自家蚕的具有氧化昆虫体内蜕皮激素活性的蜕皮激素氧化酶EO基因，利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆得到。其表达产物能有效地催化作用于蜕皮激素，使得蜕皮激素的活性降低，可以有效地降低昆虫体内蜕皮激素...41、家蚕蜕皮激素氧化酶EO基因[简介]： 本发明公开了一种从高效表达的基因工程菌中提取重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法。该菌是携带重组质粒的大肠杆菌RosettaDE3，该重组质粒是含黄曲霉尿酸氧化酶uricase基因的质粒pET-30c+。用该菌生产黄曲霉尿酸氧化酶的方法...42、一种提纯大肠杆菌表达的重组黄曲霉尿酸氧化酶的方法[简介]： 本发明提供了PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备方法，用PEG化重组猪-人尿酸氧化酶制备*液和冻干粉针剂的方法，及其降低血尿酸含量的应用。本发明还提供了重组猪-人尿酸氧化酶的核苷酸序列，包含核苷酸序列的载体...
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43、一种PEG化重组猪-人尿酸氧化酶融合蛋白的制备及应用方法[简介]： 本发明公开了一种Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因，其具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。本发明还同时公开了该基因编码的蛋白质，其具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本发明还同时公开了上述Microbacterium属细菌...44、Microbacterium属细菌耐热尿酸氧化酶基因及其用途[简介]： 本发明公开的人尿酸氧化酶蛋白，由SEQIDNO.3的氨基酸序列组成。本发明所得到的人尿酸氧化酶蛋白，回复人尿酸氧化酶基因中的突变密码，将回复突变后的人尿酸氧化酶基因导入工程菌中实现人尿酸氧化酶基因的表达，产生具有酶...45、人尿酸氧化酶蛋白及其制备方法和其聚乙二醇结合物[简介]： 本发明公开了重组胆红素氧化酶的生产方法，所述方法包括如下步骤：将来源于半知丝状真菌疣孢漆斑菌的胆红素氧化酶基因导入大肠杆菌中并使其得以表达。本发明还公开了由这一生产方法得到的重组胆红素氧化酶。这一重组胆红素...
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46、重组胆红素氧化酶及其生产方法[简介]： 聚乙二醇PEG化犬源尿酸氧化酶类似物，其中犬源尿酸氧化酶类似物为天然犬源尿酸氧化酶和含有部分犬源和人源尿酸氧化酶氨基酸序列的嵌合蛋白及突变体蛋白，聚乙二醇的平均分子量约为1kDa-40kDa，每个尿酸氧化酶单体平均偶...47、聚乙二醇化犬源尿酸氧化酶类似物及其制备方法和应用[简介]： 本公开提供赖氨酰氧化酶样2LOXL2多肽结合剂，包含例如特异结合LOXL2多肽的抗体；和还提供包含其的组合物。所述结合剂能用于多种也提供的治疗和诊断方法。48、结合赖氨酰氧化酶样2（LOXL2）的抗体和其使用方法[简介]： 本发明提供了胆固醇氧化酶基因及其编码的胆固醇氧化酶，提供了含有其基因序列的表达载体和含有该表达载体的基因工程重组菌株，提供了制备该胆固醇氧化酶的方法。本发明提供的胆固醇氧化酶重组菌株可用于对3-羟基类甾体化...
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49、胆固醇氧化酶基因和工程菌及应用[简介]： 本发明公开了一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途。黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因全序列长度为1725bp，开放阅读框长度为1584bp，其具体位置在43-1626区域，编码527个氨基酸。该L-氨基酸氧化酶从黄斑蓝子鱼血...50、一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途[简介]： 本发明涉及一种氧化铝纳米粒子壳聚糖辣根过氧化酶复合膜修饰玻碳电极测定酚类化合物的方法，属电化学分析检测技术领域。本发明的要点是将一定量的氧化铝纳米粒子壳聚糖辣根过氧化酶混合液滴涂在玻碳电极表面，得到修...21、一种胆红素氧化酶固体发酵方法22、一种胆红素氧化酶固体发酵方法23、作为NADPH氧化酶抑制物的吡唑啉二酮衍生物24、赖氨酰氧化酶和LOXL2的催化结构域
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25、果糖基肽基氧化酶和用于测定糖化蛋白质的传感器26、果糖基氨基酸氧化酶27、糖氧化酶28、黄曲霉尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰物及其制备方法29、人血清白蛋白与尿酸氧化酶的融合蛋白及其制备方法30、根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法
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31、新的果糖基肽氧化酶32、包含糖类氧化酶和或吡喃糖氧化酶的焙烤产品33、丙酮酸氧化酶及其核苷酸序列、重组载体、重组宿主细胞和试剂盒
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34、用氧化酶制备面条面团的方法35、含有氧化酶的口腔护理组合物36、一种尿酸氧化酶基因重组质粒、基因工程菌及它们的制备
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37、新型过氧化氢生成型NADH氧化酶及编码其的DNA38、一种含有假丝酵母尿酸氧化酶的*用制剂39、定向进化构建的耐热型肌氨酸氧化酶及其基因40、一种以聚碳酸酯膜为基体的乙醇氧化酶膜及其制备方法41、高活性果糖缬氨酸氧化酶及其制备方法42、尿酸氧化酶用于治疗或预防由局部缺血或再灌注事件引起的心脏疾病或间接后遗症的用途
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43、新的氧化酶基因及使用该基因生产3-吲哚-丙酮酸的方法44、牡丹ACC氧化酶基因Ps-ACO1特异性探针45、5-脂氧化酶-活化蛋白（FLAP）抑制剂46、一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白及其载体和应用47、利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的分批式补料发酵工艺48、新颖的赖氨酰氧化酶
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49、D-氨基酸氧化酶的抑制剂50、一种破坏蔗汁中氧化酶的方法51、一种胞外胆固醇氧化酶产生菌的分离方法
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52、一种高产胆固醇氧化酶的红色甾短杆菌53、稳定储藏的葡糖氧化酶54、一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用
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55、利用重组大肠杆菌高效生产丙酮酸氧化酶的培养基56、小麦细胞*素氧化酶基因TaCKX1序列及其克隆与应用57、以两相酶生物传感器实时监测葡萄糖氧化酶活力的方法58、D-氨基酸氧化酶的稠合杂环抑制剂59、聚乙二醇化重组黄曲霉尿酸氧化酶偶合物及制备工艺60、含具有黄嘌呤氧化酶抑制效果以及炎症诱发酶抑制效果的朝鲜当归提取物的治疗痛风用组合物
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61、沉默赤霉素2-氧化酶的表达的组合物及其用途62、用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法63、用D-氨基酸氧化酶和D-天冬氨酸氧化酶拮抗剂治疗中枢神经系统障碍64、聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用65、自身免疫病症和NADPH氧化酶缺陷66、一种定点引入非天然氨基酸的突变尿酸氧化酶及其制备方法
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67、氧化酶试验测试管68、氧化酶试验测试液及其测试管69、一种丙酮酸氧化酶基因、其重组表达质粒及转化的菌株
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70、5-脂氧化酶-活化蛋白FLAP抑制剂41、具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因42、具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因
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43、具有给予对三氟羧草醚的抗性的活性的原卟啉原氧化酶及其基因44、液相半乳糖氧化酶希夫测定法45、在表面活性剂存在下稳定的胆固醇氧化酶46、尿酸氧化酶的变体形式及其用途47、尿酸氧化酶的变体形式及其用途48、尿酸氧化酶的变体形式及其用途
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49、尿酸氧化酶的酶活性分析方法50、一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及其专用基因51、类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用52、D－葡糖酸内酯氧化酶基因以及生产重组D－葡糖酸内酯氧化酶的方法53、类1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶及其编码基因与应用54、过量表达和纯化的无花果曲霉氧化酶及其编码核酸
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55、含二氨基氧化酶的*物组合物56、包括在种子中表达细胞*素氧化酶的改变植物形态学、生物化学和生理学的方法57、一种利用番石榴脂肪氧化酶和氢过氧化物裂解酶制备天然香料的方法
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58、含有尿酸氧化酶的*用制剂59、包含糖氧化酶的漂白组合物60、用于抑制NADPH氧化酶和血小板活化的含有与稠合环部分连接的N-杂芳基部分的化合物
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61、一种含有改组乙醇氧化酶启动子的毕赤酵母植酸酶表达系统62、一种从蛇*中分离L－氨基酸氧化酶的方法63、控制甜菜碱合成的胆碱单氧化酶，甜菜碱醛脱氢酶双基因表达载体64、从小麦麸皮中提取草酸氧化酶的方法65、一种黄曲霉尿酸氧化酶的制备方法66、重组D-氨基酸氧化酶
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67、重组D－氨基酸氧化酶的用途68、一种制备D-氨基酸氧化酶的方法69、茶树1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶特异表达序列标签及其生物芯片70、新胆固醇氧化酶基因及其应用71、修饰的肌氨酸氧化酶制备方法及其试剂组合物72、金属分散碳氧化酶传感器
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73、一种重组假丝酵母尿酸氧化酶的制备方法74、蛇*L-氨基酸氧化酶在制备艾滋病治疗*物中的应用75、一种D-氨基酸氧化酶的制备方法
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76、一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法77、一种多肽――人细胞色素C氧化酶COII蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸78、丝状真菌来源的赖氨酰氧化酶
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79、包括表达植物*素氧化酶的修饰植物形态学、生物化学和生理学的方法80、鉴定5-脂氧化酶作为引起动脉硬化症的主要基因81、纸材料制造中的氧化酶82、高效表达D－氨基酸氧化酶的甲醇酵母，其构建及发酵方法83、新的果糖基氨基酸氧化酶84、脂氧化酶基因及其启动子、转运肽和蛋白质
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85、一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾－4－烯－3－酮的方法86、一种多肽――人亚铁血红素铜离子呼吸氧化酶亚基1－17.27和编码这种多肽的多核苷酸87、适合用作碘化物氧化酶的含铜氧化酶88、用于制备非免疫原性聚合物性缀合物的无聚集体尿酸氧化酶89、用于制备非免疫原性聚合物性缀合物的无聚集体尿酸氧化酶90、低脂氧化酶1大麦
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61、一种新的多肽――人赖氨酰氧化酶54.45和编码这种多肽的多核苷酸62、一种新的多肽――人赖氨酰氧化酶54.45和编码这种多肽的多核苷酸63、细胞色素C氧化酶复合体
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64、细胞色素C氧化酶复合体65、一种黄嘌呤氧化酶的冻干保护剂及其应用66、一种新的多肽――人多铜氧化酶9.57和编码这种多肽的多核苷酸
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67、一种新的多肽――人细胞色素C氧化酶亚单位Ⅶa19.25和编码这种多肽的多核苷酸68、野生茄子细胞色素氧化酶基因StCYP77A2及其表达载体和应用69、用原卟啉原氧化酶基因增加农作物产量或单产的方法70、一种新的多肽――人过氧化物酶体脂肪酸乙酰辅酶A氧化酶14.85和编码这种多肽的多核苷酸71、一种新的多肽――人过氧化物酶体脂肪酸乙酰辅酶A氧化酶46.97和编码这种多肽的多核苷酸72、含有谷胱甘肽过氧化酶的*物组合物及其制备方法
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73、一种新的多肽――人赖氨酰氧化酶46.31和编码这种多肽的多核苷酸74、一种葡萄糖氧化酶GODJ4A及其基因和应用75、二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物及其制备和应用方法76、一种新的多肽――人过氧化物酶体脂肪酸乙酰辅A氧化酶8.8和编码这种多肽的多核苷酸77、一种生产饲用固定化葡萄糖氧化酶的方法78、共固定化葡萄糖氧化酶过氧化氢酶微球及其在生产葡萄糖酸或其盐中的应用
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79、耐除草剂的原卟啉原氧化酶80、一种新的多肽――人细胞色素C氧化酶亚基8.91和编码这种多肽的多核苷酸81、具有抑制黄嘌呤氧化酶和降尿酸作用的化合物以及组合物
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82、肾酶单胺氧化酶C的检测、分离和应用83、一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法84、一种高效筛选黄嘌呤氧化酶产生菌的培养基
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85、一种葡萄糖氧化酶分泌增强型菌株及其应用86、一种发酵生产葡萄糖氧化酶的方法87、一种新的多肽――多铜氧化酶12和编码这种多肽的多核苷酸88、一种新的多肽――人过氧化酶13和编码这种多肽的多核苷酸89、小麦籽粒脂肪氧化酶基因的分子标记及其应用90、一种大麦脂肪氧化酶LOX-1合成缺陷基因的多态性分子标记方法
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91、一种新的多肽――人过氧化酶25和编码这种多肽的多核苷酸92、氧化石墨烯定向固定化葡萄糖氧化酶的工艺方法93、一种新的多肽――人过氧化酶11和编码这种多肽的多核苷酸94、一种新的多肽――人过氧化酶22和编码这种多肽的多核苷酸95、一种新的多肽――人过氧化酶18和编码这种多肽的多核苷酸96、一株产葡萄糖氧化酶的基因工程菌及其构建与应用
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97、定性检测细胞色素氧化酶CYP2C19基因分型的测序引物对及其试剂盒98、一种新的多肽――过氧化酶8和编码这种多肽的多核苷酸99、一种新的多肽――人赖氨酰氧化酶33和编码这种多肽的多核苷酸
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100、负载有葡萄糖氧化酶的磁性纳米微球101、负载有葡萄糖氧化酶的磁性纳米微球的制备方法102、一种新的多肽－细胞色素C氧化酶COII蛋白9和编码这种多肽的多核苷酸
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103、可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物及其制备方法和在检测中的应用104、一种以PDDA-Fe3O4纳米粒子为载体制备固定化葡萄糖氧化酶的方法105、一种利用生物相容的高分子修饰葡萄糖氧化酶表面以提高其寿命和稳定性的新方法106、人肌氨酸氧化酶及其编码序列107、尿酸氧化酶108、尿酸氧化酶
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109、分离四聚体尿酸氧化酶的方法110、聚乙二醇或聚环氧乙烷－尿酸氧化酶结合物及其应用81、小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法82、小鼠黄嘌呤氧化酶转录水平定量用PCR引物组合及PCR方法83、乳发酵短杆菌细胞色素BD型醌醇氧化酶基因84、重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用
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85、一种产葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其应用86、一种在面包制作过程中具有强筋作用的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法87、一种抗人精胺氧化酶的单克隆抗体及其应用
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88、双齿围沙蚕细胞色素氧化酶基因的克隆方法89、一种葡萄糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、果胶酶和CBD-木素过氧化物酶棉织物前处理方法90、大豆脂肪氧化酶Lox2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其抗体和应用
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91、大豆脂肪氧化酶Lox3的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其抗体和应用92、将葡萄糖氧化酶固定在自组装膜上的方法93、糖氧化酶及其在焙烤中的用途94、糖氧化酶及其在焙烤中的用途95、一种制备共固定化葡萄糖氧化酶过氧化氢酶微球的方法96、以稻谷加工副产物为原料生产饲用葡萄糖氧化酶的方法
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97、从甘薯的水溶性提取液中分离和制备多酚氧化酶、β-淀粉酶和储藏蛋白的方法98、突变的羟基苯丙酮酸双氧化酶、基DNA序列和含该基因且耐除草剂的植物的分离99、新的人谷胱苷肽过氧化酶、其编码序列及制法和用途100、木薯叶多酚氧化酶的制备方法101、Aspeverin在制备单胺氧化酶MAO抑制剂中的应用102、由大肠杆菌产生的修饰的三角酵母D－氨基酸氧化酶制备头孢菌素烷基7β－4－羧丁基酰胺酸的方法
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103、一种具有环氧化酶-2异常表达抑制活性的芍*苷类化合物其制备方法及其用途104、MyriberineA在制备单胺氧化酶MAO抑制剂中的应用105、一种具有多酚氧化酶抑制活性的蓝莓叶提取物
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106、红冬孢属D－氨基酸氧化酶107、细胞*素氧化酶108、蔬菜提取物抑制黄嘌呤氧化酶的用途及在制备预防和治疗高尿酸血症或痛风食品中的应用
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109、一种辣椒抗氧化酶促进剂及其制备与使用方法110、ChukrasoneB在单胺氧化酶抑制剂*物中的应用111、ChukrasoneA在单胺氧化酶抑制剂*物中的应用112、一种利用葡萄糖酸盐废菌体制备葡萄糖氧化酶的方法113、SarcabosideB在单胺氧化酶抑制剂*物中的应用114、一种具有氧化酶催化特性的氧化铽纳米材料及其使用方法
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115、一种L-氨基酸氧化酶活力的定量检测方法116、产生葡萄糖氧化酶的霉菌的快速检测117、毛竹紫黄质脱环氧化酶PeVDE蛋白，编码该蛋白的基因和应用118、一种基于葡萄糖氧化酶电极膜的制备方法及其产品119、番茄脂肪氧化酶家族沉默表达载体及其构建方法和应用120、一种脂肪氧化酶制备类胡萝卜素降解产物的方法及应用
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121、一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法122、具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中*提取物及制法和用途123、具有抑制α-葡萄糖苷酶和黄嘌呤氧化酶作用的中*组合物及其制备方法和用途
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124、葡萄糖氧化酶突变基因及其表达和应用125、包含肺表面活性物质和抗氧化酶的治疗组合物126、一种产葡萄糖氧化酶酵母工程菌及其构建方法与应用
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127、一种扇贝酚氧化酶的分离纯化方法128、具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的化合物及其盐、制备方法和用途129、HouttuynoidA在制备单胺氧化酶抑制剂*物中的应用130、HouttuynoidD在制备单胺氧化酶抑制剂中的应用101、负载有多层葡萄糖氧化酶磁性纳米微球的电极102、负载有多层葡萄糖氧化酶磁性纳米微球的电极
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103、负载有多层葡萄糖氧化酶磁性纳米微球的电极及其制备方法104、一种抑制全麦面粉中多酚氧化酶活性的方法105、纳米金作为葡萄糖氧化酶的应用106、含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜及其制法和用途107、一种橡胶树多酚氧化酶、其编码基因及应用108、一种橡胶树乳管表达的多酚氧化酶、其编码基因及应用
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109、脑栓通胶囊作为单胺氧化酶B抑制剂在临床治疗疾病的应用110、一种具有抑制单胺氧化酶B功能的保健食品和*的生产方法及其在临床的应用111、2-6-羟基-2′3′-二甲氧基苯基-6-羟基-7-甲氧基苯骈呋喃在制备单胺氧化酶抑制剂中的应用
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112、一种苯乙烯环氧化酶基因及其用途
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