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问题提出时间： 12:37:18
原位杂交之蛋白酶Ｋ如何配制？
做原位杂交时，我配制的蛋白酶K是按《分子克隆实验指南》中的贮存液的配制：用灭菌的 50mmol/L Tris(pH8.0) 、1.5mmol/L 乙酸钙 溶解配制成浓度为20mg/ml溶液，然后过滤灭菌。
因为克隆手册上说蛋白酶K本身可以灭活RNA酶，所以我没有对配制的相关溶液做去处RNA酶的处理，也就是说没有用DEPC水溶解配制蛋白酶K，这样做会影响实验结果吗？不知道大家做原位杂交时如何配制蛋白酶K？
行业分类：生物、医药
回答时间： 20:41:50
用DEPC水溶解配制蛋白酶K溶液，值得注意地是DEPC水必须是经过DEPC处理过夜但是又必须清除DEPC，DEPC对好多酶有抑制。
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回答时间： 22:30:37
转网友badger的一篇经验谈，供参考。
“蛋白酶 K，威力巨大的广谱蛋白酶，95C 加热10 分钟，则完全失活。数年前首次使用它，是替代 DEPC 处理 RNA 抽提用的离心管和枪头，效果不错；后来又用于处理 RNase-Free的水，效果也是一级棒。从此就再也不用 DEPC 了。现在将它的细节公开，与大家分享。 配制 RNA 裂解试剂时，直接用灭菌的双蒸水配制，最后，加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后即可。枪头及离心管去除 RNase：先将枪头及离心管清洗干净后，移入预先混好的含 1ug/ml 蛋白酶 K 的双蒸水，彻底浸入。室温放置 30 分钟后，连水一起高压灭菌。弃水后，烘干即可。RNase-Free 水的获得：直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀，室温放置 15 分钟后，灭菌处理即可。该蛋白质的残留对后续实验没有可见的影响。无蛋白质残留的RNase-Free 水的获得：这比较麻烦。直接在灭菌的双蒸馏水中加入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀后，倒入专用的蒸馏器中。放置 15 分钟后，加热蒸馏，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free 水。要提醒的是，该专用蒸馏器头几次流出来的水，只能当普通蒸馏水用，因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外，一定要主要密闭性，否则，流出的水又被污染了。 蛋白酶 K: 价格 100元/25mg，可处理 25 升水。DEPC: 价格 &150元/5ml，可处理 5 升水。”
http://emuch.net/html/411.html
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回答时间： 22:03:58
入蛋白酶 K 至终浓度 1ug/ml。轻轻混匀后，倒入专用的蒸馏器中。放置 15 分钟后，加热蒸馏，流出的就是无蛋白质残留的RNase-Free 水。要提醒的是，该专用蒸馏器头几次流出来的水，只能当普通蒸馏水用，因为通道中难确保 RNase-Free 的环境；另外，一定要主要密闭性，否则，流出的水又被污染了。 蛋白酶 K: 价格 100元/25mg，可处理 25 升水。DEPC: 价格 >150元/5ml，可处理 5 升水。”
http://emuch.net/html/411.html
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回答时间： 07:56:34
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization
ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。?
原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno?Nardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。Orth(1970)应用?3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。?由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)报道用2，4?二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶组织化学的方法显示杂交 信号。Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶?抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。Boeringer Mannhem Biochemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场，和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色(标记碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶显色系统)，有较好的反差背景，更有利于与免疫组织化学相结合，同时可以检测基因表达。核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸 性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核甘酸探针等。DNA探针还有单链DNA(Single stranded,ssDNA)和双链DNA(Double stranded,dsDNA)之分。所以原位杂交可分为DNA?DNA，cDNA?RNA,RNA?RNA和寡核苷酸探针与DNA或RNA等杂交方式。原位杂交技术在生命科学的研究中可视为一顶革命性的技术。它使我们的研究从器官、组织 和细胞水平走向分子水平，为各个学科的研究带来突破性的进展。
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蛋白酶k，胰蛋白酶水解蛋白质的方法步骤，什么样的缓冲液。请高手专业人士多多帮忙。谢谢！
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10 mg/mL蛋白酶K怎么配
0.1g 蛋白酶K溶解于10mL去离子水中建议：蛋白酶K最好不要称量了，因为本身量就很少，称量过程中会有损失，你就看看包装上是多少克或者多少毫克，按比例算一下需要多少水，加进去就好了。
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