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不同固定方法对Pyk2免疫荧光染色的影响毕业论文
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3秒自动关闭窗口免疫荧光_百度百科
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Immunofluorescence technique 又称是标记免疫技术中发展最早的一种它是在生物化学和的基础上建立起来的一项技术很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合利用进行组织或内抗原物质的定位外文名Immunofluorescence technique&时&&&&间1941年主要缺点非特异性染色问题尚未完全解决原&&&&理
免疫荧光immunofluorescence technic
Coons等于1941年首次采用进行标记而获得成功这种以荧光物质而进行定位的技术称为fluorescentantibodytechnique　用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法用已知的荧光抗原示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法这两种方法总称因为不但能与抗体球蛋白结合用于检测或定位各种抗原也可以与其他结合用于检测或定位抗体但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用所以人们习惯称为荧光抗体技术或称为免疫荧光技术以荧光抗体方法较常用[1]用免疫荧光技术显示和检查或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞或组织化学技术
该技术的主要特点是特异性强敏感性高速度快主要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决结果判定的客观性不足技术程序也还比较复杂
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同还可进一步分做若干种与放射免疫法相比荧光免疫法无放射性污染并且大多操作简便便于推广国外生产的TDM用有相当一部分即属于此类并且还有专供TDM用的自动分析仪生产[2]
由于一般荧光测定中的本底较高等问题荧光免疫技术用于定量测定有一定困难新发展了几种特殊的荧光免疫测定与和一样在临床检验中应用[1]的基本反应是由于具有高度的特异性所以当抗原抗体发生反应时只要知道其中的一个因素就可以查出另一个因素免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的标记在抗体或抗原上与其相应的抗原或抗体结合后在下呈现一荧光反应将标记的特异性荧光抗体直接加在抗原标本上经一定的温度和时间的染色用水洗去未参加反应的多余荧光抗体室温下干燥后如检查未知抗原先用已知未标记的特异抗体第一抗体与抗原标本进行反应用水洗去未反应的抗体再用标记的抗抗体第二抗体与抗原标本反应使之形成抗原抗体抗体复合物再用水洗去未反应的标记抗体干燥封片后镜检如果检查未知抗体则表明抗原标本是已知的待检血清为第一抗体其它步骤的抗原检查相同
标记的抗抗体是同于血清球蛋白有种的如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应因此制备适用于鸡任何抗原的诊断抗原抗体反应后利用荧光显微镜判定结果的检测方法抗原抗体反应后利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
⑴荧光物质
许多物质都可产生荧光现象但并非都可用作只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或常用的有
⑴fluoresceinisothiocyanateFITC为黄色或橙黄色结晶粉末易溶于水或等溶剂分子量为389.4最大吸收光为490--495nm最大发射光波长520--530nm呈现明亮的黄绿色荧光结构式如下
有两种同分异结构其中异构体Ⅰ型在效率与蛋白质结合能力等方面都更好在冷暗干燥处可保存多年是应用最广泛的其主要优点是①人眼对黄绿色较为敏感②通常切片标本中的绿色荧光少于红色
⑵四乙基rhodamineRIB200为橘红色粉末不溶于水于酒精和性质稳定可长期保存结构式如下
最大吸收光波长为570nm最大发射光波长为595～600nm呈橘红色荧光
⑶四甲基异硫氰酸罗丹明tetramethylrhodamineisothiocyanateTRITC结构式如下
最大吸引光波长为550nm最大发射光波长为620nm呈橙红色荧光与FITC的翠绿色荧光对比鲜明可配合用于双重标记或其异硫氰基可与蛋白质结合但荧光效率较低
⑵其他荧光物质
1酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受的作用分解成4-甲基伞酮后者可发出荧光激发光波长为360nm发射光波长为450nm其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和的底物对羟基等
2镧系某些3价稀土镧系元素如铕Eu3 铽Tb3 铈Ce3 等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光其中以Eu3 应用最广Eu3
螯合物的激发光宽发射光波长范围窄荧光衰变时间长最适合用于分辨荧光免疫测定1)FITC
常见荧光素的特性
1)FITC黄色结晶粉末吸收光490~495nm发射光520~530nm明亮的黄绿色荧光
2)RB200橘红色粉末吸收光570nm发射光595~600nm橘红色荧光
3)TRITC紫红色粉末吸收550nm发射光620nm橙红色荧光
5)PE吸收光490~560nm发射光595nm红色荧光
6其它酶作用后产生荧光物质酶 底物 产物 激发光 发射光
Β-G MUG MU 360 450
AP MUP MU 360 450
⑷合适荧光素的选择
1具有与蛋白质形成的化学基团
-N=C +NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质
‖ ︱　 ︱‖ ︱
2荧光效率高标记后下降不明显
3荧光色泽与背景色泽对比鲜明
4标记后能保持活性和免疫活性
5标记方法简单快速
6安全无毒[1]⑴基本原理
将标记在相应的抗体上直接与相应抗原反应其优点是方法简便高非特异性荧光染色少缺点是敏感性偏低而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体此法常用于病毒等微生物的快速检查和肾炎活检皮肤活检的免疫病理检查
⑵试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水PBS0.01mol/LpH7.4
荧光标记的抗体溶液以0.01mol/LpH7.4的PBS进行稀释
缓冲甘油分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只内有0.01mol/LpH7.4的PBS 1500ml
有盖搪瓷盒一只内铺一层浸湿的纱布垫
荧光显微镜
37℃温箱等
⑶实验步骤
① 滴加0.01mol/LpH7.4的PBS于待检标本片上10min后弃去使标本保持一定湿度
② 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液使其完全覆盖标本置于有盖搪瓷盒内保温一定时间参考30min
③ 取出玻片置玻片架上先用0.01mol/LpH7.4的PBS冲洗后再按顺序过0.01mol/LpH7.4的PBS三缸浸泡每缸3-5 min不时振荡
④ 取出玻片用滤纸吸去多余水分但不使标本干燥加一滴缓冲甘油以覆盖
⑤ 立即用荧光显微镜观察观察标本的特异性荧光强度一般可用+表示
-无荧光±极弱的可疑荧光+荧光较弱但清楚可见++荧光明亮+++ --++++荧光闪亮待检标本特异性荧光染色强度达++以上而各种对照显示为±或-即可判定为阳性
⑷注意事项
1对荧光标记的抗体的稀释要保证抗体的蛋白有一定的浓度一般不应超过120抗体浓度过低会导致产生的荧光过弱影响结果的观察
2染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化染色时间可以从10 min到数小时一般30 min已足够染色温度多采用室温25℃左右高于37℃可加强染色效果但对不耐热的抗原如可采用0-2℃的低温延长染色时间低温染色过夜较37℃30 min效果好的多
3为了保证荧光染色的正确性首次试验时需设置下述对照以排除某些非特异性荧光染色的干扰
① 标本自发荧光对照标本加1-2滴0.01mol/LpH7.4的PBS
② 对照抑制试验标本加未标记的特异性抗体再加荧光标记的特异性抗体
③ 阳性对照已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光阳性对照和待检标本呈强荧光则为特异性阳性染色
4一般标本在高压汞灯下照射超过3min就有荧光减弱现象经荧光染色的标本最好在当天观察随着时间的延长荧光强度会逐渐下降⑴基本原理
染色程序分为两步第一步用未知未标记的抗体待检标本加到已知抗原标本上在湿盒中37℃保温30min使抗原抗体充分结合然后洗涤除去未结合的抗体第二步加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgGIgM抗体如果第一步发生了抗原抗体反应标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合从而可鉴定未知抗体
⑵试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水PBS0.01mol/LpH7.4
荧光标记的抗人球蛋白抗体以0.01mol/LpH7.4的PBS进行稀释
搪瓷桶三只内有0.01mol/LpH7.4的PBS 1500ml
有盖搪瓷盒一只内铺一层浸湿的纱布垫
荧光显微镜
37℃温箱等
⑶实验步骤
1滴加0.01mol/LpH7.4的PBS于已知抗原标本片10min后弃去使标本片保持一定湿度
2滴加以0.01mol/LpH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本覆盖已知抗原标本片将玻片置于有盖搪瓷盒内37℃保温30min
3取出玻片置于玻片架上先用0.01mol/LpH7.4的PBS冲洗1-2次然后按顺序过0.01mol/LpH7.4的PBS三缸浸泡每缸5min不时振荡
4取出玻片用滤纸吸去多余水分但不使标本干燥滴加一滴一定的荧光标记的抗人球蛋白抗体
5将玻片平放在有盖搪瓷盒内37℃保温30min
6重复操作3
7取出玻片用滤纸吸去多余水分滴加一滴缓冲甘油再覆以
8荧光显微镜高倍视野下观察结果判定同直接法
⑷注意事项
1荧光染色后一般在1h内完成观察或于4℃保存4h时间过长 会使荧光减弱
2每次试验时 需设置以下三种对照
① 阳性对照阳性血清+荧光
② 阴性血清+荧光
③ 荧光对照PBS+荧光标记物
3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中始终保持湿润避免干燥
4. 所滴加的待检抗体标本或荧光应始终保持在已知抗原标本片上避免因放置不平使液体流失从而造成非特异性荧光染色
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平滑肌细胞特异性Smad4基因敲除小鼠的建立.pdf48页
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转化生长因子．p transforminggrowth
转导中的核心枢纽分子，它与受体依赖的Smads结合调节下游靶基因的表达。
大量的研究显示它在心血管疾病中发挥着重要的作用。本研究的目的是利用
Cre／LoxP系统建立平滑肌细胞特异性Smad4基因敲除小鼠并进行初步表型分析，
期望获得一种可用于研究TGF．p在心血管疾病中的作用机制的动物模型以及建
立一种分离原代平滑肌细胞的方法，为从基因敲除小鼠体内获得原代平滑肌细胞
并在体外研究TGF．D对其功能影响提供技术手段。
本研究选择了平滑肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠 SMA．Cre
作为介导敲除的工具鼠，将其与ROSA26报告基因小鼠交配获得了
胞有特异性蓝染，说明SMA―Cre能在血管平滑肌细胞中特异的表达。接着用
SMA．Cre转基因小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配获得了在平滑肌细胞特异
性Smad4基因敲除小鼠，通过扩增Smad4剔除条带和原位免疫荧光显示敲除小
鼠中Smad4发生了敲除。Smad4基因敲除小鼠无胚胎致死，能够顺利出生，大
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腹主动脉瘤。本研究用胶原酶消化法分离小鼠原代平滑肌细胞，免疫荧光鉴定此
方法获得的平滑肌细胞。用这种方法分离平滑肌细胞特异性Smad4基因敲除小
鼠的主动脉的原代平滑肌细胞，用免疫荧光，Westernblot及Real．timePCR检测
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肌细胞获得了稳定遗传的Smad4敲除。
实验结果显示本研究成功建立了平滑肌细胞特异性Smad4基因敲除小鼠并
能自发形成腹主动脉
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生物膜的流动镶嵌模型细胞膜的功能
生物膜结构的探索历程： 1、19世纪末，欧文顿发现凡是可以溶于脂质的物质，比不能溶于脂质的物质更容易通过细胞膜进入细胞，于是他提出：膜是由脂质组成的。2、20世纪初，科学家第一次将膜从哺乳动物的红细胞中分离出来，化学分析表明，膜的主要成分是脂质和蛋白质。 3、1925年，两位荷兰科学家用丙酮从人的红细胞中提取脂质，在空气一水界面上铺展成单分子层，测得单分子层的面积恰为红细胞表面积的2倍。由此他们得出的结论是细胞膜中的脂质分子排列为连续的两层。4、1959年，罗伯特森在电镜下看到了细胞膜清晰的暗一亮一暗的三层结构，并大胆地提出生物膜的模型是所有的生物膜都由蛋白质--脂质--蛋白质三层结构构成，电镜下看到的中间的亮层是脂质分子，两边的暗层是蛋白质分子，他把生物膜描述为静态的统一结构。5、1970年，科学家用荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合的实验，以及相关的其他实验证据表明细胞膜具有流动性。6、1972年，桑格和尼克森提出的为流动镶嵌模型大多数人所接受。生物膜的流动镶嵌模型：1、生物膜的流动镶嵌模型图解：&①糖蛋白（糖被）：细胞识别、保护、润滑、免疫等。②蛋白质分子：膜功能的主要承担着。③磷脂双分子层：构成膜的基本支架。2、基本内容 (1)脂质：构成细胞膜的主要成分是磷脂，磷脂双分子层构成膜的基本骨架。①磷脂分子的状态：亲水的“头部”排在外侧，疏水的“尾部”排在内侧。②结构特点：一定的流动性。 (2)蛋白质：膜的功能主要由蛋白质承担，功能越复杂的细胞膜，其蛋白质的含量越高，种类越多。①蛋白质的位置：有三种。镶在磷脂双分子层表面；嵌入磷脂双分子层；贡穿于磷脂双分子层。 ②种类： a．有的与糖类结合，形成糖被，有识别、保护、润滑等作用。 b．有的起载体作用，参与主动运输过程，控制物质进出细胞。 c．有的是酶，起催化化学反应的作用。(3)特殊结构——糖被 ①位置：细胞膜的外表。②本质：细胞膜上的蛋白质与糖类结合形成的糖蛋白。③作用：与细胞表面的识别有关；在消化道和呼吸道上皮细胞表面的还有保护和润滑作用。(4)&细胞膜的特征：①结构特征：具有一定的流动性。②功能特征：具有选择透过性。细胞膜的流动性与选择透过性的区分方法：1．结构特点：具有一定的流动性。（1）原因：膜结构中的蛋白质分子和脂质分子是可以运动的。 （2）表现：变形虫的变形运动、细胞融合、胞吞、胞吐及载体对相应物质的转运等。（3）影响因素：主要受温度影响，适当温度范围内，随外界温度升高，膜的流动性增强，但温度超过一定范围，则导致膜的破坏。 2．功能特性：具有选择透过性。 （1）表现：植物根对矿质元素的选择性吸收，神经细胞对K+的吸收和对Na+的排出，肾小管的重吸收和分泌，小肠的吸收等。（2）原因：遗传性决定载体种类、数量决定选择性。 3．二者的区别与联系 （1）区别：流动性是细胞膜结构方面的特性，选择透过性体现了细胞功能方面的特性，主动运输能充分说明选择透过性。（2）联系：细胞膜的流动性是表现其选择透过性的结构基础。因为只有细胞膜具有流动性，细胞才能完成其各项生理功能，才能表现出选择透过性。相反，如果细胞膜失去了选择透过性，细胞可能已经死亡了。 易错点拨：1、位于细胞膜外侧面的糖蛋白形成糖被，它是识别图中细胞膜内外侧的标志。2、载体蛋白属于嵌入或贯穿磷脂双分子层的蛋白质。载体具有饱和现象，当细胞膜上的载体全部参与物质的运输时，细胞吸收该物质的速度不再随物质的浓度增大而增大。 3、磷脂双分子层数、生物膜层数与磷脂分子层数：磷脂双分子层数=生物膜层数=磷脂分子层数的一半 。例& 血浆中的1个葡萄糖分子进入组织细胞被彻底氧化分解，需要穿过几层磷脂分子(&& ) A．5层& B．3层&& C.6层&& D．4层 思路点拨：葡萄糖首先要穿过毛细血管壁进入组织液，至少要跨毛细血管壁的一层上皮细胞，即穿过2层细胞膜，再进入组织细胞共穿过3层细胞膜，生物膜都是由磷脂双分子构成，故本题穿越的磷脂分子层数是6。答案C 细胞膜的功能 1．将细胞与外界环境分隔开（细胞的界膜） (1)膜的出现——生命起源中至关重要的阶段。 (2)细胞膜使细胞成为一个相对独立的系统，保障了细胞内部环境的相对稳定。 2．控制物质进出细胞。行使控制物质进出功能的物质主要是细胞膜上的蛋白质。 3．进行细胞间的信息交流。实行细胞间的信息交流的物质是细胞膜上的糖蛋白。 细胞间的信息交流的方式主要有三种： (l)-些细胞（如分泌细胞）分泌一些物质如激素，通过血液的传递，运送到作用部位的细胞（靶细胞），被靶细胞的细胞膜上的受体（成分为糖蛋白）识别，引起靶细胞的生理反应。例如胰岛素，性激素等的调节。 (2)相邻两个细胞的细胞膜接触，通过糖蛋白识别，将信息从一个细胞传递给另一个细胞。例如精子和卵细胞的识别结合。 (3)高等植物细胞间的识别主要通过细胞间的胞间连丝来实现。 植物细胞壁的成分和功能 1．位置：位于植物细胞膜外面。 2．主要成分：纤维素和果胶。 3．功能 (1)支持：细胞壁具有较坚韧的支撑性，维持细胞稳定的形态。 (2)保护。 知识拓展： 1、病毒、病菌和一些有害物质也能进入细胞内，体现了细胞膜对物质进出细胞的控制作 用具有相对性。 2、细胞膜控制物质进出细胞的能力是活细胞才具有的，死细胞的细胞膜不能控制物质的出入。 3、物质能否通过细胞膜，是根据细胞生命活动的需要，并不完全取决于物质分子的大小。 例&& 取细胞膜上糖蛋白成分相同的两种海绵动物，将其细胞都分散成单个后混合培养，发现这两种细胞能够结合在一起；但将细胞膜上糖蛋白成分不相同的两种海绵动物的细胞分散后，混合培养，会发现这两种细胞不能结合在一起。这一实验现象说明细胞膜上的糖蛋白与什么功能有关(& ) A．细胞间的相互识别 B．细胞间的免疫作用 C．细胞的分泌作用 D．细胞间物质交流 答案A 4、细胞壁的透性：全透性。 5、不同种类的细胞，细胞壁成分不同： 水绵一纤维素和果胶， 细菌一肽聚糖， 真菌一几丁质。 6、用纤维素酶除掉细胞壁的植物细胞不再保持原来的形态，将这样的细胞放置在清水中时，它会像红细胞一样吸水破裂。从这一事实可得出以下结论：细胞壁具有机械支持和保护作用，并能维持细胞正常形态。 例&&& 能使高等植物细胞壁和细胞膜结构均破坏的一组酶是(& ) A．淀粉酶、纤维素酶、溶菌酶 B．纤维素酶、果胶酶、蛋白酶 C．果胶酶、溶菌酶、纤维素酶 D．磷脂酶、淀粉酶、蛋白酶 答案B 7、控制物质进出细胞的功能使细胞具有选择透过性。加热煮熟的玉米种子细胞死亡，细胞膜失去了选择透过性，红墨水中的色素大分子物质就可以大量进入胚细胞，而使胚细胞呈红色，相反正常玉米种子胚细胞则不会呈红色。 8、行使细胞间信息交流的物质是细胞膜上的糖蛋白。 例&& 研究发现，脂溶性物质能够优先通过细胞膜，细胞膜会被溶解脂质的溶剂溶解。它证明了(&& ) A．构成细胞膜的物质是脂质和蛋白质 B．细胞膜具有流动性 C．磷脂双分子是细胞膜的基本骨架 D．组成细胞膜的物质中有脂质 答案D
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