人类生殖器乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种非常普遍的,主要通过性接触而感染的病毒,长期持续的HPV感染将会导致生殖器疣和癌前期病变的发展甚至宫颈癌的发生.研究发现,HPV病毒属于乳头状瘤病毒科家族成员,天然病毒衣壳呈现二十面体结构,是无外膜的,双链环状DNA病毒.HPV基因组被主要的(L1)和次要的(L2)衣壳结构蛋白所包围,而L1蛋白占据了病毒表面整个蛋白的90%还多,是诱导机体产生抗体的主要抗原,并能够自行组装成病毒样颗粒(VLPs).目前发现的HPV型别超过100种,其中约有40种可以感染人类阴肛部,同时引起宫颈损伤和宫颈癌,被称为高危型HPV(例如HPV-16,-18,-31,-33,和-58).流行病学调查发现,持续性高危型HPV感染是宫颈癌发生的必要前提.2010年, Zhang通过Meta分析发现我国常见的五种高危型HPV型别分别为16,58,18,52,33型. 目的: 利用生物信息技术筛选出高危型16,58,18,52,33型共同抗原表位,通过多肽合成技术合成表位多肽,然后将其与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联.用该偶联蛋白分别免疫海兰母鸡和新西兰大白兔,制备卵黄抗体IgY和兔多克隆抗血清,并检测IgY和兔抗血清的特异性及效价,以研究合成多肽片段的免疫原性,为将其应用于宫颈癌早期诊断的研究奠定实验基础. 方法: 1,高危型HPV共同抗原表位的筛选 利用ExPASy-ProtScale和Antibody epitope prediction抗原表位预测网页,选取四个主要参数:亲水性预测,柔韧性预测,β转角预测,抗原表位指数预测.根据HPV16 L1蛋白的特征对其抗原表位进行参数分析. 利用UniProtKB蛋白质库,以HPV16 L1为标准,58,18,52,33型L1蛋白与其同源性最高分别为78%,64%,77%,79%.再利用Pubmed里的Blast软件,对这五种高危型HPV的L1蛋白氨基酸序列进行比对,得出共同的多肽片段序列.接着利用Cn3D4.1软件,寻找多肽片段在整个病毒蛋白质表面的三维立体空间结构,最终结合Urquiza等和Chen等的报道推测出一个最有可能成为抗原表位的氨基酸序列. 2,IgY及兔抗血清的的制备 化学合成的多肽与KLH进行偶联形成多肽抗原,分别对海兰母鸡和新西兰大白兔进行免疫接种,首次免疫选用多肽抗原与等体积弗氏完全佐剂的混合物,加强免疫选用多肽抗原与等体积弗氏不完全佐剂的混合物,选择鸡胸脯,大腿内侧和翅膀下以及兔背部皮下注射抗原.鸡初次免疫注射100ug多肽抗原,每间隔10天注射50ug多肽抗原,加强免疫共3次,首次免疫7d后收集鸡蛋,于4℃冰箱保存,免疫前的鸡蛋作阴性对照;兔首次免疫注射200ug多肽抗原,第20天,第35天,第49天分别注射100ug,60ug,60ug多肽抗原进行3次加强免疫,最后一次免疫10天后心脏取血,收集血清于-20℃冰箱保存,免疫前兔耳缘静脉取血后收集的血清作阴性对照. 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫组化的方法检测抗体的特异性和敏感性. 结果: (1)合成多肽经HPLC和质谱检测报告显示:纯度为91.87%,分子量为1465.4. (2)考马斯亮蓝蛋白含量检测提纯IgY蛋白含量:免疫前卵黄提取物的蛋白含量为1.561mg/ml;免疫后的IgY的蛋白含量为5.747mg/ml. (4)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价:以每孔2.5ug的偶联多肽抗原包被,卵黄抗体IgY和兔抗血清倍比稀释.结果表明,随着抗体稀释倍数的增加,反应孔吸光度值(A)逐渐降低,卵黄抗体IgY的最高效价在1:1024～1:2048之间,兔抗血清最高效价在1:320～1:640之间.说明卵黄抗体和兔抗血清与合成多肽抗原均有一定程度的特异性免疫反应,但卵黄抗体IgY敏感性高些. (5)免疫组化检测卵黄抗体IgY和兔抗血清的特异性及敏感性:结果发现以免疫后提纯的IgY作为一抗,其中有四个病例的挖空细胞核棕黄色,结果阳性.而以免疫后兔抗血清为一抗的只有一例病人的挖空细胞核棕黄色.而非免疫卵黄提取物和兔血清则无上述反应;实验还发现出现核棕黄色着色的多为宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ的病例. 结论: 人工合成多肽具有免疫原性,能诱导机体产生特异性抗体,间接ELISA检测IgY的效价远高于兔抗血清的效价,免疫组化证明IgY的敏感性比兔抗血清IgG强,故本研究工作为高危型HPV快速诊断的研究提供了一些实验数据.