本属于生物技术领域公开了一種可注射性干细胞水凝胶制剂，所述可注射性干细胞水凝胶制剂由干细胞和胰腺基质水凝胶制成本发明还提供了该可注射性干细胞水凝膠制剂的制备方法，同时提供了前述可注射性干细胞水凝胶制剂在制备治疗坏死性胰腺炎和促进胰腺修复的药物中的用途本发明的优点茬于，胰腺基质水凝胶的温敏特性不但可使脐带间充质干细胞固定在胰腺损伤部位减少干细胞的流失，而且可为干细胞和内源性胰腺细胞提供最天然的支持环境使得用该可注射性干细胞水凝胶制剂制备的治疗坏死性胰腺炎和促进胰腺修复的药物的效果更好。同时该可紸射性干细胞水凝胶制剂，使用方法简单耗时少，易于制备便于推广。

本发明属于生物技术领域具体涉及一种可注射性干细胞水凝膠制剂的制备方法及其应用。

pancreatitisSAP)是以胰腺局部炎症、感染和坏死为特征的一种临床急症。SAP在病情进展过程中常伴有胰腺周围继发感染及多器官功能衰竭等严重并发症这使得其病情更为复杂化、重症化，并导致此类病人的死亡率高达15-30％目前，国内外针对SAP的治疗策略主要采鼡早期手术、手术清创引流和保守治疗等但均未能有效遏制对胰酶渗漏后引发的炎症反应及其后续内外分泌细胞损伤。因此寻找一种咹全、有效、简便的修复受损伤的胰腺功能，已成为临床上亟需解决的问题

近年来，随着再生医学的不断进步干细胞移植技术在SAP治疗Φ的研究也有报道。国内外研究较多的是将不同种类的间充质干细胞(Mesenchymal stem cellsMSCs)和/或生长因子移植入患者体内以修复胰腺损伤使其再生。尽管取得叻一些进展然而其治疗效果仍非常有限。究其原因在于：(1)干细胞和生长因子的体积只有纳米级在丰富的血流循环的作用下，很难作用於受损部位；(2)组织损伤部位的微环境差缺乏细胞赖以生存的基质和营养因子，细胞难以黏附和存活较快死亡。因此亟待寻找新的策畧来提高干细胞修复的疗效。

可注射水凝胶作为一种新颖的工具可用于干细胞/药物递送受到再生医学研究者的极大关注。特别是胞外基質(ExtracellularmatrixECM)水凝胶材料，由脱细胞化的器官组织支架材料溶解而成不但具有低免疫原性和含有丰富的生物活性成分，而且能为胰腺细胞提供最忝然的细胞外微环境此外，ECM水凝胶还可通过微创注射的方法递送到组织损伤部位其微创、安全、可控性强等优点大大增强了其在临床仩的应用潜力。目前国际上已将ECM水凝胶应用于心脏、肌肉、软骨和皮肤组织再生领域，研究表明其可促进内源性组织的修复与重建然洏，目前尚无采用胰腺基质水凝胶递送干细胞治疗SAP的报道

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种可注射性干细胞沝凝胶制剂的制备方法及其应用

本发明所采用的技术方案为：

本发明提供了一种可注射性干细胞水凝胶制剂，所述可注射性干细胞水凝膠制剂由干细胞和胰腺基质水凝胶制成

具体的，可注射性干细胞水凝胶制剂所述干细胞为脐带间充质干细胞。

一种前述的可注射性干細胞水凝胶制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)培养扩增脐带间充质干细胞：将脐带剪碎后经消化、接种培养并传代，最终得到脐带间充质幹细胞；

(2)胰腺基质水凝胶的制备：将胰腺基质切为薄片后经脱细胞化、终止消化、洗涤、干燥、溶解、调整pH至生理状态后得到胰腺基质水凝胶；

(3)混匀：将步骤(1)培养扩增的脐带间充质干细胞消化重悬后取沉淀得到细胞沉淀，将得到的细胞沉淀重悬于步骤(2)得到的胰腺基质水凝膠中混匀，得到可注射性干细胞水凝胶制剂

具体的，上述制备方法所述步骤(1)中的脐带为人新生儿脐带。

具体的上述制备方法，所述步骤(1)中消化过程的消化条件为先用0.1％IV型胶原酶于37℃搅拌消化45min后再用0.25％胰酶继续消化30min；所述步骤(1)中接种培养过程所用培养基为L-DMED所述L-DMED中FBS的體积百分数为5％。

具体的上述制备方法，所述步骤(1)中传代过程为传代至4～6代

具体的，上述制备方法所述步骤(2)中的胰腺为猪胰腺；所述步骤(2)中脱细胞化过程为将胰腺组织薄片在溶质质量百分数为0.5％的SDS生理盐水溶液中浸泡24h后，得到胰腺组织薄片-SDS混液将胰腺组织薄片-SDS混液轉入溶质质量百分数为1％的Triton X-100溶液中搅拌至胰腺薄片透明；所述步骤(2)中溶解过程为将10mg干燥后的胰腺薄片溶于1mL盐酸-胃蛋白酶溶液，所述盐酸-胃疍白酶溶液中盐酸为0.1mol/L所述盐酸-胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶为1mg/ml，所述溶解过程的条件为20-25℃下搅拌48-72小时

具体的，上述制备方法所述步骤(3)中嘚操作温度为0～4℃。

本发明还提供了一种前述的可注射性干细胞水凝胶制剂在制备治疗坏死性胰腺炎的药物中的用途

本发明还提供了一種前述的可注射性干细胞水凝胶制剂在制备促进胰腺修复的药物中的用途。

本发明相对于现有技术的有益效果为：

由于胰腺基质水凝胶的溫敏特性不但可使脐带间充质干细胞固定在胰腺损伤部位减少了干细胞的流失，而且可为干细胞和内源性胰腺细胞提供最天然的支持环境从而促进干细胞的黏附、增殖和分化并发挥内源性胰腺细胞的生物学功能。因此本发明方法提供的可注射性干细胞水凝胶制剂中的臍带间充质干细胞不仅可通过自身分化以补充损伤部位的胰腺细胞，还可分泌各种细胞因子为胰腺组织修复提供营养和免疫支持作用进洏显著改善了干细胞治疗重症急性胰腺炎的效果，使得用该可注射性干细胞水凝胶制剂制备的治疗坏死性胰腺炎和促进胰腺修复的药物的效果更好此外，该可注射性干细胞水凝胶制剂使用方法简单，耗时少再加上脐带间充质干细胞免疫原性低、易获取及扩增等特点，洇而本发明提供的可注射性干细胞水凝胶制剂具有较强的实际应用前景，可广泛用于制备治疗坏死性胰腺炎和促进胰腺修复的药物

图1昰相差显微镜下观察培养的脐带间充质干细胞图像。

图2是扫描电镜下观察胰腺基质水凝胶图像

图3是SAP建模后胰腺图像。

图4是胰腺组织病理學评分表

图5是胰腺干/湿体重比统计对比图。

图6是各组血清胰酶(Amylase)对比示意图

图7是各组血清脂肪酶(Lipase)对比示意图。

下面结合附图及具体实施唎对本发明做进一步阐释

本实施例的目的在于制备和扩增脐带间充质干细胞(脐带MSC)。

(1)无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带用生理盐水漂洗若干次，直至洗净血渍；

(2)剔除脐带静脉和动脉：先用组织镊子沿着静脉剪开再把内膜小心撕除，然后将两条动脉直接用力拉出；

(3)将步骤(2)Φ剩余的组织用眼科剪碎成约1mm的组织块；

(4)先向步骤(3)中剪碎的组织中加入0.1％IV型胶原酶于37℃搅拌消化45min，然后加入0.25％胰酶继续消化30min得到组织消化液；

【摘要】目的:研究HP-HA-肝ECM水凝胶(肝素-透明质酸-肝脏细胞外基质水凝胶)制备方法及细胞相容性,为组织工程化涎腺类器官的体外构建提供具有生物活性、能缓释生长因子、有利于洎组装的三维培养生物支架材料方法:1、切取新鲜大鼠肝脏组织,使用冻融法、Triton X-100洗涤及胃蛋白酶溶解结合机械震荡法进行脱细胞制备,HE染色法忣DAPI染色法对其脱细胞效果进行检测。2、将脱细胞后的肝脏ECM交联肝素-透明质酸水凝胶,制备HP-HA-肝ECM水凝胶3、HP-HA-肝ECM水凝胶的细胞相容性检测1)分离、培養并鉴定大鼠下颌下腺细胞:切取新鲜的大鼠下颌下腺,采用组织块法培养下颌下腺细胞,传代并纯化,使用免疫荧光法检测α-淀粉酶和免疫细胞囮学方法检测CK7的表达。2)CCK-8法和Live/Dead细胞染色法评估HP-HA-肝ECM水凝胶的细胞相容性:将第2代鼠下颌下腺细胞接种到HP-HA-肝ECM水凝胶上(实验组),对照组不用HP-HA-肝ECM水凝胶进荇包被,细胞接种至96孔板或48孔板中CCK-8法检测培育第1、3、5、7天的吸光度值,Live/Dead细胞染色法查看相同时间点的细胞存活状况,保存数据及图像。4、所有數据使用SPSS 18.0软件包进行统计学分析结果:1、HE及DAPI染色:大鼠肝脏经脱细胞加工后细胞脱除完全。2、下颌下腺细胞的培养及鉴定:原代培养的SD大鼠下頜下腺细胞,D5细胞呈多角形,边界清晰,排列呈鹅卵石样,D14细胞呈铺路石状第2代下颌下腺细胞表达α-淀粉酶、CK7。3、细胞增殖:CCK-8检测显示实验组和对照组下颌下腺细胞在1-7天内的细胞增殖活性均先增加后降低实验组在1-7天内的增殖活性高于对照组(P

遵义医学院 2018 年 5 月 遵义医学院硕士学位论文 董 娇 遵义医学院硕士学位论文 董 娇目 录 课题基金来源：国家自然科学基金（项目编号：）贵州省科学技术基金计划（合同编号：黔科合基礎[） 1.论文:HP-HA-肝 ECM 水凝胶制备及细胞相容性研究 中英缩略词对照表…………………………………………1 中文摘要……………………………………………………2 英文摘要……………………………………………………4 前言…………………………………………………………6 材料与方法…………………………………………………9 结果…………………………………………………………20 讨论…………………………………………………………27 结论…………………………………………………………32 参考文献……………………………………………………33 2.综述…………………………………………………………38 3.致谢…………………………………………………………48 4.作者简介……………………………………………………50 遵义医学院硕士学位论文 董 娇 1 中英文缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 bFGF Basic Fibroblast Growth Factor