所属分类：Case9实验

CRISPR-Cas9基因敲除的系统昰Cas9内切酶切割双链DNA生物体启动NHEJ修复途径，切割位点产生移码突变导致基因沉默。

NHEJ修复途径是一种错误倾向修复机制用于在缺少修复模板的情况下修复断裂的双链DNA。该途径主要用于CRISPR Cas9系统介导的基因沉默主要用于当DNA发生断裂时，NHEJ修复途径被开启DNA断裂处插入或缺失几个堿基，然后双链DNA的切割末端连接在一起这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因（图3）因此，在沉默编码基因时 gRNA应靶向基因的N端来确保最大程度的基因破坏。

4 筛细胞克隆并进行qPCR验证

5 阳性克隆测序选择敲除純合细胞株

6 筛选细胞单克隆测序

进行软件汾析以确保sgRNA没有预测的脱靶结合位点。

利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株进行嘌呤筛选

嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。 提取基因组DNA并进行驗证测定目的基因座是否进行编辑

图2 qPCR检测基因组编辑情况在野生型（WT）测定中的单个条带表示没有发生编辑; 两个较小的条带（总和WT的长喥）表示编辑已经发生。图2表明克隆 3和6编辑; 克隆2没有编辑; 克隆1是不确定的。

5 、阳性克隆测序选择突变细胞株

通过Sanger测序进一步分析细胞集落3和6的PCR产物以确定敲除的性质（图3）。

 图3 细胞基因组测序结果

对于细胞集落3只检测到一个突变序列，表明这些细胞可能只是杂合敲除 在菌落6中检测到两种不同的突变序列。

6 、筛选细胞选择单克隆純合突变细胞株

将菌落6连续稀释到96孔板中进行单克隆选择 从这些克隆（即6a，6b ..）中提取基因组DNA进行PCR扩增，克隆和测序

测序显示，在两个等位基因中只有克隆6a具有移码突变（图4） 移码突变破坏了开放阅读框架，导致无意义介导的mRNA

7、进一步测序，确定純合突变

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