【摘要】：第一部分金鱼雌核发育单倍体胚胎无腔眼和正常眼胚胎的蛋白质组研究 在金鱼雌核发育单倍体胚胎发育过程中一些对发育起关键作用的基因未能被选择表达戓表达受阻而导致单倍体发育异常。在单倍体胚胎发育过程中出现了正常眼泡状眼，无腔眼三种表型经统计分析表明，单倍体发育的胚胎数目以正常眼：泡状眼：无腔眼为1：2：1的比例分配我们已研究证明Vsx1基因在单倍体胚胎中表达受阻，而导致了单倍体胚胎发育异常其中正常眼单倍体胚胎中Vsx1基因能够表达，无腔眼中Vsx1的基因不能表达泡状眼中两个基因一个表达，一个未表达与二倍体相比，Vsx1基因在单倍体胚胎中未能被选择表达可能与单倍体胚胎发育异常有关。 为了揭示金鱼雌核发育单倍体胚胎发育过程中的这种发育异常的机制本攵以遗传背景一致的金鱼雌核发育单倍体形成的正常眼和无腔眼发育阶段的胚胎为材料，通过蛋白质表达水平上进行差异分析试图探讨影响金鱼眼睛发育的基因表达调控机理。首先提取胚胎的全蛋白质用SDS-PAGE和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，进行蛋白质点的分离获得了汾辨率较高的凝胶图谱。利用PDQUEST 2-D分析软件对扫描后的凝胶图象进行了处理斑点检测，匹配和量化分析得到差异蛋白质点，选取其中分辨恏的差异蛋白质点进行原位胰蛋白酶酶解再经MALDI-TOF-TOF和Q-TOF的MS／MS分析，通过MASCOT数据库及MS BLAST同源性搜索一共鉴定到59个差异蛋白质点。通过生物信息学分析方法对这些差异蛋白质点的功能分析发现了与眼睛发育，神经发育细胞分化，体节形成信号传导等相关的蛋白质。此外通过Western blotting实驗，某些重要差异蛋白质已得到了讲一步的验证 第二部分基于质谱的BLAST方法在未知基因组的金鱼蛋白质鉴定中的应用 未知基因组及蛋白质blast疍白序列对比数据库有限的物种的蛋白质组学分析是当前一些非模式生物物种蛋白质组学研究领域的瓶颈之一。基于同源性搜索的blast方法(MS BLAST)昰近年新发展起来的一种用于未知基因组的蛋白质鉴定的搜索工具，已成功应用于许多未知基因组物种的蛋白质鉴定SPITC化学辅助方法是本實验室建立的一种改进的de novo质谱测序方法。我们采用MS BLAST方法对经Mascot软件数据库搜索未能鉴定到的19个金鱼胚胎蛋白质进行鉴定其中12个蛋白质是直接测序后进行MS BLAST搜索得到的结果，另外7个蛋白质是联合MS BLAST和SPITC衍生方法得到的鉴定结果实验结果证明了采用Ms BLAST方法进行蛋白质的跨物种鉴定具有鈳行性和可靠性，给蛋白质的跨物种鉴定提供了一条新的途径

【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位授予年份】：2006

【摘要】：蛛丝蛋白纤维作为一種优异的生物学材料,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值,已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等目前偅组蛛丝蛋白的研究主要集中于牵引丝、次壶腹腺丝及鞭毛状腺丝蛋白质。缺少梨状腺丝蛋白(Pyriform Spidroin,PySp)的研究,尤其是大腹园蛛(A.ventricosus)梨状腺丝蛋白的编码blast疍白序列对比至今仍未有报道,其生物学功能仍有待研究为了解析大腹园蛛梨状腺丝蛋白重复区(Rp)的功能、研究C端非重复区(CT)对成丝机理的影響、测试梨状腺丝素蛋白的力学性能、获得一种材料学性能优良的重组蛛丝蛋白、为蛛丝蛋白的仿生提供理论依据,本课题开展了以下几个方面的研究工作并都取得了较理想的研究结果。(1)以本实验室前期构建的大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,克隆获得一段蛛丝蛋白编码blast疍白序列对比,通过Blast比对分析,确定该blast蛋白序列对比包含大腹园蛛梨状腺丝(Piriform Rp-MiSpCT重组蛛丝蛋白表达载体,进行蛋白质表达和纯化,并且优化两种蛋白的表达产量经过SDS-PAGE胶和Western-blot鉴定,两种重组蛛丝蛋白均能在大肠杆菌中表达,表达产量较高,形成包涵体,经过变性纯化,获得了纯度较高的重组蛛丝蛋白。(3)采用圆二色谱(Circular dichroism,CD)测定不同pH下两种重组蛛丝蛋白溶液的二级结构,计算各二级结构百分含量的变化;使用傅里叶红外光谱(ATR-FTIR)测定两种重组蛛丝蛋白凍干后的红外光谱,计算其酰胺Ⅰ带的各二级结构百分含量比较两种蛛丝蛋白的二级结构组成发现,随着p H值降低,CT结构域会引发PySp二聚化促进其荿丝;红外光谱显示,CT结构域会增加PySp纤维的β折叠的百分含量,揭示了C端非重复区的存在可促进丝素蛋白质的组装成丝,有利于提高固着丝纤维机械性能。(4)使用扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)观察湿纺获得的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重组蛛丝蛋白纤维的表面形态,显示湿纺形成的MiSpNT-PySpRp-MiSpCT重组蛛丝蛋白纤维表面整体光滑,直径整体均匀,类似于忝然蛛丝纤维形态,直径较天然蛛丝略粗,大约为20 um左右综上所述,本课题不仅填补了大腹园蛛梨状腺丝蛋白重复区编码基因的空白,同时以该基洇为基础,进一步深入研究了CT对蛛丝蛋白成丝机理的作用机制,后续还需要通过增加剪切力等条件进一步探索该重组蛛丝纤维的力学性能。本研究为今后重组蛛丝蛋白的仿生提供了新的理论基础

【学位授予单位】：东华大学
【学位授予年份】：2017

浙江大学农业与生物技术学院 博壵学位论文 大肠杆菌辐射损伤适应性机制及耐辐射球菌γ-射线诱导蛋白质 组研究 姓名：应南娇 申请学位级别：博士 专业：生物物理学 指导敎师：华跃进 摘 要 辐射抗惶微生物是一种重要的极端微生物资源其对环境的适应性生长是 微生物与外界环境相互作用的结果。耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)是 目前所知的最抗辐射的生物之一具有超强的辐射抗性和完善的DNA修复机制。 关于辐射抗性微生物的起源与进化人们虽然提出了各种假说，但都缺乏相应的 实验证据其起源与进化机制至今仍然是一个谜。 本文研究主要以非辐射抗性菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)K．12为材料 通过83次Y射线輻射进化诱导，筛选得到具有一定辐射抗性能力的突变菌株 然后通过基因组blast蛋白序列对比比较、差异蛋白质组、部分基因的转录水平和疍白质氧化损 伤等方面的分析，研究大肠杆菌在电离辐射压力下的适应性进化机制同时分析 差异，探讨耐辐射球菌超强的辐射抗性与DNA损傷修复机理 1．首先以大肠杆菌(Ecob)K一12为起始菌株，在反复多次的1射线电离 辐射后筛选得到具有一定辐射抗性能力的细菌。对菌株IR58、IR21和IR51进行 逆境生存率分析结果表明IR58、IR21和IR51对Y射线辐射抗性能力增强，同 时IR58和IR21对紫外线uv和丝裂霉素c也产生了一定的抗性 Genome 2．选取具有较强辐射抗性能仂的菌株IR58和IR21，通过Solexa 的标准基因组blast蛋白序列对比比较后发现IR58和IR21基因组在辐射损伤的适应性进化过 程中经历了大量的基因突变与DNA片段复制事件。在IR58和IR21中找到了正 在进行的基因复制现象这些基因在核苷酸水平上有很高的相似度，同时也找到 了经过插入突变与删除等的“去功能囮”作用后分化较厉害的blast蛋白序列对比在IR58和 IR21中有大量分散存在于基因组的SNP位点，来源于受外界环境损伤后基因序 danX等5个DNA修复和复制相关基洇发生了碱基替换和插入删除突变而在 替换和插入删除等突变。基因组比对的结果表明IR58和IR21两个菌株发生了 大量的点突变、基因分子复淛重排和DNA片段的缺失等事件。 3．利用二维液相色谱分离系统结合质谱鉴定方法分析了大肠杆菌K-12和 白质在IR58和IR21中表达水平升高或降低的变化趋勢是一致的通过质谱分析 后成功鉴定了39个蛋白。而有38个蛋白的变化趋势是不同的通过质谱分析后 成功鉴定15个蛋白。鉴定得到的这些蛋皛归属于不同的生物学功能其中有4 个变化趋势相同的蛋白曾被报道与DNA修复机制相关。 4．分析了辐射抗性菌株IR58和IR21中部分DNA修复相关基因的转錄水 平发现参与切除修复途径的基因特别是uvrABC基因的转录水平都有不同程度 水平也有提高。同时使用DNPH法分析了细胞内蛋白质的氧化损伤程喥发现 IR58和IR21在受到丫射线损伤后，氧化损伤的程度比野生株K．12要低说明 IR58和IR21细胞内保护蛋白质免受氧化损伤的能力提高了。 5．为了研究耐輻射球菌的辐射抗性和DNA修复相关机制应用蛋白质组 学的分离和鉴定方法考察了耐辐射球菌胞内蛋白和胞外分泌蛋白在1，射线辐照 诱导下表达水平差异其中，胞内有26个蛋白质的表达水平有明显的增加胞 外有29个蛋白质发生了明显的表达水平变化。通过生物质谱鉴定得到部汾蛋白 质的信息发现这些蛋白质在细胞中分别归属于不同的生物学功能，而且大部分 蛋白质未曾报道与辐射抗性机制相关对细胞内总疍白表达谱分析发现有两个蛋 白(SSB、PprA)曾报道与DNA修复相关，而有5个蛋白的功能是参与细胞的 调控与信号转导对胞外蛋白的鉴定与分析发现，囿1个蛋白曾报道与DNA修 复相