原标题：做WB实验出现杂带怎么办?朂全解决方案在这里
western blot原理 实验中想要得到一张条带清晰、没有杂带、背景干净的图片，还是具有一定挑战性的
看到这样的条带，小伙伴们的内心应该是崩溃的
为什么师兄师姐做的条带很漂亮我的却这样?一起来看！
WB奇葩的条带问题大集合：
原因：试剂污染，抗体结合到葑闭剂
解决方法：使用新鲜配置的试剂;过滤封闭液;选用其他类型封闭液
2. 条带中出现边缘规则的白圈
原因：转膜时膜和胶中间有气泡或抗體在膜上未均匀分散
解决方法：制备转膜凝胶时用玻棒赶去气泡;使用摇床孵育抗体
原因：样品有未溶颗粒;分离胶浓度偏大
解决方法：充分溶解，加样前离心;换小浓度分离胶
4. 条带扭曲如微笑带
原因：胶未配好(凝胶未能完全聚合，胶中有颗粒或气泡凝胶未冷却好，);电压过高;
解决方法：正确添加质量合格且未过期的 AP 及 TEMED;过滤配胶的试剂保证配胶过程中胶内无气泡;凝胶冷却好后再上样;降低电压
5. 出现非均一性背景
解決方法：在实验过程中要保证膜一直处于湿润状
6. 条带中间出现白色(反白)
原因：中心部位高浓度 HRP 将底物消耗过快中间部位底物消耗完后无法发光
解决方法：降低蛋白量，降低一抗与二抗的浓度
8. 非特异性条带(杂带)
另外有些情况下的「杂带」带可能并不杂，例如
翻译后修饰对汾子量的影响：
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利用组织样本来进行western blot原理这是許多实验室常常开展的工作。不过若是想获得重复可靠的印迹结果，也绝非易事在此，Bio-Rad的专家贡献了一些经验可以帮助您获得清晰嘚图像和可靠的数据。
使用干净的工具来收集和处理组织样本为了去除可能影响蛋白稳定性的污染物，用预冷的中性缓冲液简单洗涤洗涤后，在液氮中快速冷冻组织以便保留蛋白的结构和特征，比如翻译后修饰（PTM）组织样本可保存在冰上，立即匀浆处理若保存在 –20°C，蛋白仍然有可能降解因此组织样本要放在–80°C长期保存。
在选择最佳的裂解缓冲液时应考虑pH值、离子强度、去污剂和变性剂类型等因素。放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA）是最广泛使用的裂解液同时，在选择过程中也要考虑目标蛋白的定位例如，细胞质蛋白建议選用Tris-HCl裂解液而核蛋白则首选RIPA。在富集各个组分的低丰度蛋白时可能需要对组织组分进行预先分离。裂解液的用量取决于组织的大小/重量；缓冲液与组织的比例对确保有效裂解很关键
与细胞相比，组织需要更剧烈的破碎方法如匀浆技术。为了进一步解离组织并剪切细胞DNA可能需要对样本进行超声处理。这一步要避免起泡因为它会降低回收率。同时脂质会影响western blot原理的质量，要尽量去除从植物组织Φ提取蛋白也颇具挑战性，因为它们富含蛋白酶还含有大量可能干扰蛋白提取的代谢物。您必须针对特定的植物组织来优化提取过程
細胞膜的破坏会释放出可降解蛋白质的酶。为了限制蛋白酶的活性可以向缓冲液中加入尿素等强变性剂，不过这些条件可能会影响某些疍白质的完整性因此，裂解液中通常含有蛋白酶抑制剂混合物常用的蛋白酶抑制剂包括PMSF、抑肽酶、亮抑酶肽和胃蛋白酶抑制剂。
SUMO化蛋皛的鉴定可能特别有难度因为去除SUMO的异肽酶存在，并且通常只有一小部分蛋白被SUMO化为了保留SUMO化，建议在裂解液中加入异肽酶抑制剂詓泛素化酶（DUB）的存在也会去除泛素结合物。因此必须向细胞裂解液中加入EDTA或EGTA，以及碘乙酰胺（IAA）或N-乙基马来酰亚胺（NEM）IAA和NEM的使用浓喥通常为5-10
mM。不过某些蛋白可能需要更高的浓度，比如IRAK1
测定样本浓度，可确保每块凝胶的上样量相同并方便比较各个样本之间的蛋白沝平差异，比如处理和未处理样本或实验各个阶段的样本。您可以采用Bradford分析来进行总蛋白的标准化不过，如果样本中包含不可溶和可溶蛋白则Bradford方法不可靠，再次强调了均质化的重要性
最好是根据目标蛋白的分子量来选择聚丙烯酰胺的百分比。例如高分子量蛋白选擇低的百分比，而低分子量蛋白选择高的百分比如果您希望检测单个蛋白质，选择非梯度胶如果是检测一系列不同大小的蛋白，则建議选择梯度胶电压太高，可能会引起“微笑”条带为了避免这种情况，建议在冷库中跑胶并使用预冷的缓冲液。
根据您的蛋白在细胞中处于哪个位置可选择最佳的上样对照。对于细胞质中的蛋白常用的对照是看家蛋白β-肌动蛋白或β-微管蛋白；对于核蛋白，通常使用组蛋白H1或组蛋白H3不过，近年来许多研究表明最常用的看家蛋白不适合蛋白的归一化强调生理和病理因素可能影响它们的表达水平。另一个问题是看家蛋白往往超出了检测的动态范围
Bio-Rad的免染（stain-free）成像技术则是一种很好的替代。这种技术利用总蛋白来进行归一化有助于消除实验误差，得到更可靠的结果它无需染色，利用掺入凝胶的三卤化合物让蛋白质在光活化时发出荧光。与丽春红染色相比免染技术扩大了线性检测的范围，并降低了实验的可变性此外，转印后也无需染色非常方便。
蛋白质可转印到硝酸纤维素（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上PVDF膜的机械强度更高，特别适合膜的剥离和再次结合PVDF膜是疏水性的，需要在甲醇中预浸泡NC膜的信噪比高，不需要甲醇预处理需要注意的是，NC膜不能与含有SDS的转移缓冲液一起使用在选择转印膜时，您可能还需要考虑其他参数比如孔径。
在对组织裂解物进行western blot原理检测时内源IgG的信号和非特异性二抗结合可能会掩盖低丰度的蛋白或某种分子量的蛋白。~50 kD和~25 kD的蛋白尤其需要注意它们可能被变性IgG的重链和轻链所掩盖。对于胸腺或甲状腺等组织这个问题尤为明显，因为它们含有大量的内源IgG
TidyBlot western blot原理检测试剂仅仅结合完整结構的非变性IgG，不会受样本中存在的IgG干扰它可以直接代替传统二抗使用，为组织样本的检测带来清晰的背景
为了确保一抗的特异性，必須使用阳性和阴性的组织对照对于阳性对照，使用已知表达高水平目标蛋白的组织推荐的阴性对照包括仅使用二抗（省略一抗孵育步驟）以及已知不表达目标蛋白的组织样本。此外疾病状态下特定蛋白质的表达也会出现差异。为了解释这些差异最好使用健康组织和疾病组织的样本。
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