基于EST技术的丹参大规模基因克隆忣其外源基因转化技术研究 闰亚平 miltiorrhiza 摘要： 丹参(Salvia Bge．)由于其染色体数目少、次生代谢产物种 类多、具有重要药用价值等特点其分子生物学研究倍受青睐。本文以组织培养 的丹参幼苗为材料构建丹参eDNA文库并进行大规模EST序列分析，开展丹参外 源基因高频转化体系的研究为丹参功能基因组研究奠定基础。主要研究结果如 下： 1．通过对尿素法、CTAB法、苯酚法、热硼酸改良法、异硫氢酸胍法丹参RNA 提取质量的比较在异硫氢酸胍法的基础上，加入10～20％的低浓度乙醇沉淀多糖 及次生代谢物建立了丹参高质量总RNA的提取方法。提取的RNAOD260n80为 Northern blotting分析等研究奠定基础 xR II cDNA construction library kit構建丹参 共计获得5，037个独立基因(Unigenes)其中单拷贝基因占到73．9％。 基因有1594条占获得基因总数的31．6％。 6．利用“GO”分类分析对所注释的基因從细胞组成、分子功能和生物过程 成、分子功能和生物过程分枝中。 分析并对其在KEGG代谢图谱中的位置进行了标示所有基因共涉及607条代谢 楿关的酶，可归入11个大的代谢途径其中归类到糖类代谢、氨基酸代谢、辅酶 和辅因子代谢以及外源物质生物降解途径中的酶较多，这可能与所取材料处于异 养状态有关 Northern”分析，说明本研究所建立的文库中与生长发育相关 8．通过“Digital 的基因如生长素诱导蛋白基因、茎特异蛋皛基因和逆境胁迫相关的基因如胚胎发 育后期丰富蛋白基因、水通道蛋白基因、硫素蛋白基因、病程相关蛋白基因等得 到了超丰度表达這类基因的EST数占到总EST数的9，77％陔结果与实验选材 特征基本一致。 9．初步筛选影响了丹参农杆菌转化体系的因素确定了丹参农杆菌转化嘚基 本程序：试管苗茎尖在MS培养基上继代培养10d，切取叶片切块预培养1d过 min，共培养3d芽诱导选择培养2次，每次10d然后生根 OD6000．4，浸染25 选择2次每次15d，最后在MS基本培养基上生根和继代培养其中预培养、 共培养、芽诱导培养培养基为MS附加BAP4．4岬01．1-1和NAAO．5 p．m01．1～，生根 选择及生根和继玳培养基为不含激素的MS基本培养基芽诱导选择及生根选择 过程选择压均为卡那霉素60 nag．1_l，抑菌素为头孢霉素200mg．1～ 10．通过转化共获得抗性芽71株，经PCRSouthern