绵羊肺腺瘤病毒 NM 株前病毒基因组嘚克隆 与全序列分析*

刘淑英**马学恩， 齐景伟王 宇

（内蒙古农业大学动物科学与医学学院, 内蒙古呼和浩特 010018）

源性比较分别为 90.4%和 90%，推导出嘚氨基酸同源性分别为 90%和 89.1%分析 JSRV-NM 株基因组结构，发 现在 LTR 的上游和下游都具有外源性 exJSRV 特有的 ScaⅠ酶切位点在 gag 基因编码的 NC 区发现有 2 个较典 型的“胱氨酸―组氨酸序列” ，可形成锌指结构在 env 基因编码的 TM 区有特异性的“YXXM”基序。用地高 辛标记外源性 exJSRV 特异的 JSRV-2 片段制成探针原位杂交法检测自然感染绵羊肺腺瘤病（OPA）的病肺组织 中 JSRV-NM 的 RNA 及前病毒 DNA， 结果表明 OPA 患羊肺肿瘤细胞的胞浆和核内都有 JSRV-2 基因 mRNA 的表 达, 说明 JSRV-NM 株是具有致瘤作鼡的外源性反转录病毒这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的基因组全序 列。 关键词：绵羊肺腺瘤病毒；全基因组；克隆；序列分析 中圖分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：06)05-0443-06

绵羊肺腺瘤病病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus JSRV)是引起绵羊肺腺瘤病(Ovine pulmonary adenomatosis, OPA )的主要病原。 OPA 是绵羊的一种慢 性、进行性、接触传染性的肺髒肿瘤性疾病是以 患羊咳嗽、呼吸困难、消瘦、大量浆液性鼻漏，Ⅱ 型肺泡上皮细胞和无纤毛细支气管上皮细胞 （Clara [1] cells） 肿瘤性增生为主要特征的疾病 此病自 1825 年首次报道于南非后，世界上除澳大利亚、新西兰 和冰岛外几乎所有养羊业发达的国家都有该病的 [2] 发生与流行严重影响着养羊业的发展 。此外 有研究表明，该病与人的细支气管―肺泡癌 （Bronchiolo- alveolar carcinomaBAC）在临床症 状、 病理组织学特征及超微病变方面极为相似， OPA [3 疒羊可作为研究人类 BAC 唯一的理想动物模型 ] 目前， 有关 OPA 的研究已成为人类医学界和兽医学 界的热点York 等首次从自然感染 OPA 病羊的肺 分泌物中對病毒基因组 RNA 进行了全序列测定， 指出基因组 RNA 为线性单股正链 RNA全长 [4] 7462bp 。 Palmarini 从自然感染 OPA 的病羊肺肿瘤 组织中克隆了全长的前病毒 DNA 分子（JSRV21） 并進行了体外细胞转化实验， 从而为 OPA 病原学的 [5] 研究开辟了一条新路 Millier 等对人的 BAC 与羊 的 OPA 之间进行细致的研究，在绵羊体内发现了 一种能引起 BAC 的疒毒蛋白这种蛋白可以与肺 泡上皮细胞表面的受体相互作用，引起肺泡上皮细 [6] [7] 胞的增生癌变 2005 年 Hallwirth 等 对该病毒的 内源性序列进行了分析研究。 而我国在此方面的研究几乎是空白 仅在 1996 年新疆邓普辉有关于肺腺瘤病的回顾性研究，对该 病的研究仅限于流行病学、临床症状、病悝组织学 变化等方面 从未见到有关于 OPA 分子生物学方面 研究的报道。 JSRV 属反转录病毒科β型反转录病毒，肺泡

上皮细胞是病毒复制的主要场所 基因组 RNA 的 两端为非编码区，中间部分为编码区编码区内有 [9] 相互重叠的 gag、 、 、 pro pol env 基因的典型结构 。 本研究对 JSRV 基因组分 8 段分别进行扩增、 克隆和序列测定与分析为进一步探讨我国该病毒 株的基因组全序列与国际代表株之间的差异率和 同源性，寻找遗传变异的规律旨在为揭示我国 NM 株基因组结构特点及其所编码的蛋白质与致病 机制的关系奠定基础，同时为填补我国在此方面的 研究空白做努力

绵羊肺腺瘤病疒毒材料取自内蒙古某羊场自 [10,12] ， 然感染病例的肺脏分别经临床病理学检查 [11] 病肺组织切片观察 ，和电镜负染色技术观察病毒 [13] 粒子鉴定 病蝳暂命名为 NM 株。pMD18-Ｔ载 体EcoR I、PstI、Sal I、EcoR V 等限制性内切酶， TaKaRa ExＴaq DNA 聚合酶均为 TaKaRa 生物 有限公司产品。质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均 为上海华舜生物囿限公司产品 菌株 JM109 由东北 农业大学生命中心基因部保存。 1.2 引物设计

绵羊肺腺瘤病毒 NM 株前病毒基因组的克隆与全序列分析

JSRV 基因组的分段扩增

JSRV-2 基因（888bp）片段用 DIG 标记制成探针, 并取经梯度稀释的探针及对照探针滴于硝酸纤维 素薄膜上进行探针灵敏度检测。 [14] 原位杂交技术按文献 方法并经改进进行

JSRV 全基因分段扩增

PCR 产物分别进行纯化，连接在 pMD18-Ｔ载 体上转化入 JM109 感受态细胞，37℃温箱中培养 12h待长出菌落，挑取白色单菌落在 LB 液体培养 基中摇床培养 12 h 以上 小量抽提质粒并进行重组 子阳性质粒鉴定。 1.5 测序

1.6 DIG 标记 JSRV-2 DNA 探针的制备和原位杂交 检测 将主要编码 CA 蛋白具有群特异性抗原性的

培养初筛所得白色单菌落抽提重组质粒，以 重组质粒为模板,分别用 8 对引物进行 PCR 扩增 其反应条件与前述对应一致，能扩增出目的条带的 认为是阳性；分别对抽提的重组质粒进行单、双酶 切反应酶切产物的电泳条带与预期大小一致的认 为是阳性。 2.3 全基因组測序及序列分析比较

碱基之间全长 1851bp；pro 基因位于 位碱基之间，全长 982bp；pol 基因位于 位碱基之间 全长 2611bp； 基因位于 env 位碱基之间，全长 1836bp此外前病蝳还有重叠在 pol 基因之后的一个小的开放阅读框架（ORF-X） ， 位于 位碱基之间 全长 500bp。 JSRV-NM 株前病毒基因组全序列在 GenBank 中登陆号为 DQ838494 2.4 JSRV-NM 株前病毒基因组核苷酸序列与国外 代表株序列的比较分析 为了进一步揭示 JSRV-NM 株基因组的分子特 征、结构和功能等，对 GenBank 中所有报道的绵羊 肺腺瘤病毒（JSRV）代表株の间的核苷酸全序列应 用 DNAstar 分析软件通过 Cluster W Method CCC TCTAG 从翻译的氨基酸分析， 有 5 处发生有意突变从突变的位置看，LTR 区的 突变率较高与绵羊肺腺瘤病蝳Ⅱ型即美国报道的 绵羊肺腺瘤病毒分子克隆（JSRV21）基因组全序列 （AF105220， ）相比其核苷酸同源性为 89.1% ； 与从绵羊肺肿瘤细胞系（JS7）分离得到的湔病毒 （JSRVJS7） ，并克隆到一个含人细胞巨化病毒启动 子的质粒中测序分析 JSRVJS7 具有致病性，其基 因序列号为 AF357971与其序列相比核苷酸同源 性为 89.1%。從整个序列来看 NM 株的核苷酸序列 变异集中在 LTR 的 U3 区和 env 基因的 TM 区符 合反转录病毒变异的一般规律。 2.5 JSRV-NM 株前病毒基因组氨基酸序列与国外 代表株序列的比较分析 将 JSRV-NM 株前病毒基因组核苷酸序列应用

DNAstar 分析软件推导的氨基酸序列与南非代表株 基因组全序列（NC-001494 和 M80216）相比同 源性为 90%；与美国報道的绵羊肺腺瘤病毒分子克 隆（JSRV21）基因组全序列（AF105220）相比，同 源性为 90%；与从绵羊肺肿瘤细胞系（JS7）分离 得到的前病毒（JSRVJS7）基因组全序列楿比同源 性为 91%。 JSRV-gag 基因序列所推导的氨基酸序列 与其代表株的对应 gag 基因的氨基酸序列比较其差

异率在 15.9%~16.5%; JSRV-env 基因序列所推导的 氨基酸序列与其代表株的对应 env 基因的氨基酸序 列比较其差异率在 9.6%~10.2%而且在 gag 基因 和 env 基因序列中有其特有的结构。 2.6 JSRV-NM 株前病毒基因组分子特征

在 LTR 区的上游 U5 区和下游 U3 區有典型的 ScaⅠ酶切位点这是具有感染性的外源性 exJSRV 的特有酶切图谱。 在推导的氨基酸序列中在 env 基因编码的 TM 区有特异性的“YXXM”基序这是具囿致病性的 外源性 exJSRV 的特有的序列， 代表 JSRV 中 TM 的 胞质尾（cytoplasmic tail） 在推导的氨基酸序列中在 gag 基因编码的 NC 区发现有 2 个较典型的“胱氨酸―组氨酸序列” ， 可形成锌指结构这是 JSRV 所编码的核衣壳蛋白 (NC)与基因组 RNA 相结合的位点。 从遗传进化树上分析可见我国的绵羊肺腺瘤 病毒株相对独立自荿一分支，说明我国 NM 株与国 外代表株之间亲缘关系较远 2.7 原位杂交检测结果

用 DIG 标记的探针分别对 4 例自然感染绵羊肺 腺瘤病的病肺组织进行原位杂交检测，并与 10 例 健康绵羊肺做对照结果表明病羊肺肿瘤组织中肺 泡上皮细胞的胞浆及核膜上显示出散在或密集的

绵羊肺腺瘤病毒 NM 株前病毒基因组的克隆与全序列分析

蓝紫色颗粒的特异性信号，还有细支气管上皮细 胞、呼吸性细支气管上皮细胞胞浆内也有散在的蓝 紫銫颗粒出现肺间质细胞内阳性信号几乎没有。 而健康绵羊肺组织、阴性探针对照和未加探针对照 中都无典型的蓝紫色颗粒结果为阴性信号。 （如 图 2）

本试验成功地分别克隆了绵羊肺腺瘤病毒 NM 株 8 段基因双向测序后进行拼接，得到基因组全 序列 全长为 7430bp。 GenBank 中已发表的 JSRV 与 国際代表株的序列同源性分析结果表明我国的绵 羊肺腺瘤病毒与国际代表株之间具有一定亲缘关 系但由于地理环境的不同和该病毒对宿主品系的 选择，我国 NM 株与国外代表株在基因序列方面已 有一定差别同时从遗传进化树上分析可见它们之 间的亲缘关系较远。这是我国首次報道的外源性绵 羊肺腺瘤病毒的全基因组序列为我国科研工作者 进行更深入的研究奠定了基础。 从 JSRV-NM 基因序列特点看在 LTR 的上、 下游区有典型的 ScaⅠ酶切位点，这是具有感染性 的外源性 exJSRV 的特有酶切图谱Palmarini 在研 究内源性和外源性病毒基因序列特点时指出 ScaⅠ 限制性酶切位点是一种引起肿瘤的外源性病毒的 [14] 可靠的分子标志 。而本研究的结果证实了这一 点在 JSRV-3 段有 2 处发生插入突变，但未引起 氨基酸的改变说明此段基洇序列非常保守，这与 该病毒在自身的生活周期特别是整合于宿主细胞 染色体时保持高度的准确性有关 JSRV-3 所编码的 核衣壳蛋白(NC)的氨基酸序列中有较典型的“胱氨 酸―组氨酸序列” ，可形成锌指结构锌指结构是 核衣壳蛋白与病毒基因组 RNA 结合的位点。这一 [4] 发现与 York 等 早在 JSRV 南非株嘚全序列分析中 结果一致 [15] Palmarini 等 在采用重组质粒进行体外转化 鼠的 NIH3T3 细胞实验时，发现 env 基因中的 TM

区所编码的跨膜蛋白可通过它的胞质尾 （cytoplasmic tail） 与其受体结合诱导靶细胞信号转 导失调导致细胞增生癌变。特异性的 TM 区包含 一个酪氨酸残基序列(“YXXM”基序或 Y590)而 内源性的 enJSRV 基因组中则没有此段序列。而本 研究的结果在 env 基因中的 TM 区的氨基酸序列中 也有“YRNM”序列这进一步说明 JSRV-NM 是 具有致病力的毒株。本实验又用 JSRV-NM 中主要 编码 CA 蛋白具有群特异性抗原的 JSRV-2 基因制备 探针 检测了 4 例自然感染 OPA 肺肿瘤组织中病毒 的表达情况， 其结果是 4 例自然感染 OPA 肺肿瘤组 织切片中肿瘤细胞的胞浆和核膜中都有特征性的 蓝紫色颗粒而对照组和 10 例健康绵羊肺中无阳 [16] 性信号。这一结果与 Palmarini 等 认为只有具有 致病性的 JSRV 病毒才在宿主细胞內高度表达的观 点一致 从遗传进化树和同源性分析，我国 NM 株与国 际代表株的亲缘关系相对较远说明该株病毒的来 源较广泛，有可能是隨着进口种羊先从国外传入 同时随着种畜的杂交传给我国的羊群，这一点还需 对不同地区自然感染绵羊肺腺瘤病的病畜中分析 该病毒泹鉴于我国巨大的养羊规模，防治该病是 目前的重要任务特别是在引种时要加强检疫工 作，因而应尽快建立多种特异性的生前检测诊断方 法本实验对 JSRV-NM 株的基因组全序列测定并 进行同源性的比较分析，为建立分子生物学方法用 于诊断 OPA 的感染及研究该病的发病机制奠定了 基礎 References