BD公司Annexin V/PI凋亡检测相关问题请问(悬浮细胞,胰酶,试剂盒,空白对照)
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[BD公司Annexin V/PI凋亡检测相关问题请问(悬浮细胞,胰酶,试剂盒,空白对照)] 请问各位XDJM：通常购买的BD公司Annexin V/PI凋亡检测产品是Annexin V : FITC Apoptosis Detection Kit I 100 tests 吗？(货号:556547) 公司网站：/pharmingen/products/product_list.php?key_products=48它和Annexin
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请问各位XDJM：通常购买的BD公司Annexin V/PI凋亡检测产品是Annexin V : FITC Apoptosis Detection Kit I 100 tests 吗？(货号:556547) 公司网站：/pharmingen/products/product_list.php?key_products=48它和Annexin V : FITC Apoptosis Detection Kit II （556570）有什么区别？好象KIT II 中多了一个蛋白。是否每次单独实验都需要做一个空白对照以及一个双染和两个单染?KIT I盒说明书上写道：用冷PBS洗细胞两遍后用1X 的buffer重新悬浮细胞。那么重新悬浮的过程具体有什么好方法呢？是先用0。25%胰酶将细胞消化下来，再通过离心胰酶消化液，沉淀细胞弃上清，最后用buffer重新悬浮细胞吗？如果是这样的话，包括离心时间在内，胰酶就要对细胞作用很长一段时间了，应该对细胞有很大损伤吧？甚至增加了细胞的凋亡和死亡。另外，Kit I 说明书上写：用buffer重新悬浮细胞密度至10的6次方每毫升，再取100微升（含10的5次方个细胞）继续往下操作实验。我想问，实际重新悬浮细胞后，不可能确定细胞的密度，也就是说不可能确定100微升刚好含10的5次方个细胞，那么这种情况下，是应该以100微升的容积为重，还是以10的5次方个细胞为重？最后我该试剂盒多少钱,有没有分装的KIT，因为用不了100tests.非常非常感谢给予任何指导和帮助的朋友!!!
回复细胞损伤肯定会有的，你得操作快点，轻点，减少操伤。ANNEXIN V-FITC细胞凋亡(Apoptosis)检测试剂盒使用说明书细胞凋亡(Apoptosis)是细胞的基本特征之一，在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡(Apoptosis)过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）高亲和力特异结合。FITC-Annexin V结合到凋亡细胞后，在蓝色光的激发下，发出绿色荧光，区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种核酸染料，它不能穿透完整细胞膜，但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透，并使细胞核红染。将FITC-Annexin V与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。 特 点?检测快速简单，仅需10 分钟，一次测试即可； ?组成为: FITC-Annexin V；结合缓冲液；碘化丙啶 ?和DNA检测方法相比，能够更早地检测到凋亡细胞。 产品组成（50次/25次反应） Annexin V-FITC 　　　　　　500μl/250μl（20 μg/ml） Binding Buffer 　　　　　　40ml/20mlPropidium iodide(PI) 　　　500μl/250μl（20 μg/ml） 操作步骤1.整待测细胞的浓度为5×10５—1×106个/ml。2.取1ml细胞，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。3.加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清（对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS洗涤）。4.重复步骤3两次。5.将细胞重悬于200μl Binding Buffer。6.加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15分钟 或4℃反应30分钟。7.加入300ul Binding Buffer，在1小时内上机检测。8.若用荧光显微镜检测，将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片，再进行观察。 保存 贮存于 2-8℃。建议Annexin V-FITC打开后，分装成小份冻存于-20℃。 注意事项为保证得到理想的实验结果在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项。 ?旋帽装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 ?Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光。 ?Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用。 ?在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。 ?PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。 ?整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作。 ?反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡(Apoptosis)是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变。 ?成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡(Apoptosis)的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的。 此试剂盒仅供科研使用这个是北京创根胜泰的这个凋亡的使用说明书，你参考下，可能有帮助。回复非常感谢centrebio,希望各位大虾继续给予更为确切的帮助和指导!回复自己顶一下....望指导!回复帮顶一下回复1.如果你的细胞对胰酶很敏感的话，消化下来的时候可以用小牛终止胰酶的作用，再把胰酶洗掉，或者直接多加buffer吹打，稀释胰酶，可以减少对细胞的损伤。2.流式对细胞数的要求比较高，应该镜下计数细胞个数，说明书让你重悬细胞的目的就是确定细胞密度，不是说固定加多少的buffer进去，而是根据你的细胞总量确定加多少buffer来调整细胞密度。祝好运！回复如何进行沉淀细胞涂片啊，怎么取沉淀，怎么涂片，急回复楼主！！！我想share一些你购买的BD公司的凋亡检测产品，可以汇款给你。本来想买的，老板说价格有些高，用的比较少，买回来也浪费，所以我在找share，急，***回复！！！
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