色谱分析法_百度文库
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色谱分析法
色​谱​分​析​法​
​
​原​理​、​方​法
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74天然药物化学实验讲义-3
物，但不一定是单体化合物，有时它仍是个混合物，需；形成结晶的条件是有效成分在欲结晶的混合物中的含量；（1）溶剂的选择；理想的溶剂必须具备以下条件：①不与结晶物质起化学；有些成分在一般溶剂中不易形成结晶，可考虑其它不常；当难以选择到合适的单一溶剂时，通常使用混合溶剂；（2）结晶溶液的制备；结晶溶液一般是过饱和溶液；机酸制成钾、钠、钙、铵盐，羟基化合物制成乙酰化
物，但不一定是单体化合物，有时它仍是个混合物，需进一步分离纯化。因此，结晶法是天然药物化学实验中获得单体的一个重要环节。形成结晶的条件是有效成分在欲结晶的混合物中的含量、适宜的溶剂系统、合适的温度和时间、正确的操作等。其中最主要的是选择合适的溶剂。（1）溶剂的选择理想的溶剂必须具备以下条件：①不与结晶物质起化学反应；②杂质与结晶物质在溶剂中的溶解度相差很大。例如，结晶成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热都不溶或冷热全能溶解；③溶剂的沸点不宜大高或太低。沸点太低则溶剂易挥发逸失，过高则不易将结晶表面的溶剂除去。常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等；④能给出较好的晶形；⑤无剧毒。事实上很少能找到如上所要求的理想溶剂，需要通过小量摸索试验而定，或藉文献资料，参考同类型化合物的一般溶解性质和结晶的溶剂条件，或依据“相似相溶”规律按所推测的结晶物质的极性大小来选择溶剂。当不了解结晶物质的溶解性能时，可取少量样品（数毫克），用不同溶剂（数滴或数毫升）在小试管中，用滴管逐滴加入溶剂试验其溶解度，包括冷时或热时的溶解度。一般首选乙醇，因它为脂溶性和水溶性基团均可用的溶剂，且经济安全。有些成分在一般溶剂中不易形成结晶，可考虑其它不常用的溶剂如二氧六环、二甲基亚矾、乙睛、甲酞胺、二甲基甲酞胺、冰醋酸等。如葛根素在冰醋酸中形成结晶；大黄素在吡啶中易于结晶。也有用水或酸水结晶，如小檗碱可在水中结晶；石蒜碱可用5％盐酸溶液生成盐酸盐结晶。当难以选择到合适的单一溶剂时，通常使用混合溶剂。先将样品用易溶的溶剂溶解，然后在加热的情况下，分次滴加对样品难溶而与原来溶剂能相混溶的溶剂，直至初显混浊，再略加热溶解或稍滴加易溶的溶剂，使溶液澄明后置室温或冰箱中析晶。在选择混合溶剂时，最好使需结晶的成分在低沸点溶剂中较易溶解，而在高沸点溶剂中较难溶解，这样可在放置过程中，先挥发低沸点溶剂，使结晶慢慢析出。常用的混合溶剂有：水一乙醇、乙醇一乙醚、石油醚一苯、水一丙酮、乙醚一乙醇一乙酸乙酯、石油醚一乙醚等。 物生做om心.c专oo-bi秀.b物w生ww（2）结晶溶液的制备结晶溶液一般是过饱和溶液。通常将需结晶物质置于锥形瓶中，加入较需要量略少的溶剂，于水浴上加热至微沸，为了避免溶剂挥发及安全操作，应在装置中接上冷凝管，若未完全溶解，可逐步添加溶剂，直至所需结晶物质刚好完全溶解（要注意判断是否有不溶性杂质，以免误加过多溶剂）。趁热过滤，放置冷处析晶。结晶时一般以低温较好，且温度应逐渐降低，使结晶慢慢形成，这样才能使结晶含杂质少，纯度高。溶剂的用量是影响结晶的纯度和速率关键。在放置过程中，先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低。如不结晶，可打开瓶塞，使溶剂逐步自然挥发，慢慢析晶。也可以用玻璃棒或金属刮勺摩擦瓶壁或加入微量晶种，诱导析晶。有些化合物即使在含量高而又纯的情况下也机酸制成钾、钠、钙、铵盐，羟基化合物制成乙酰化衍生物或苯甲酞衍生物，碳基化合物可以制成脎或腙类化合物等。分离后，再用化学方法处理使其恢复到原来化合物。（3）重结晶与分步结晶一般采用减压抽滤把结晶从母液中分离出来。晶体需用少量溶剂洗涤，以除去存在于结晶表面的母液。洗涤时，宜暂停抽气，用刮刀小心拨动，使所有晶体润湿，略静置后再行抽气。母液适当浓缩放置，又可得到一部分纯度较低的晶体。上述得到的结晶仍为粗晶，有时仍是几个成分的混合体，可以用分步结晶使之分开。由于不同成分的含量不同、形成晶体的条件不同，析晶也有先后。因此在制备结晶时，最好在形成一批结晶后，立即抽滤分出结晶，母液略作浓缩，放置后得第二批结晶。抽滤后又浓缩母液……得到数批结晶。从上述分步结晶法所得各部分结晶，其纯度往往有较大的差异，而且常是不同的成分，在未作检查之前不要贸然混合。纯化结晶常用的方法是数次的重结晶。重结晶用的溶剂可以用原先制备结晶的溶剂，但也经常改变，因为经精制后的结晶在溶剂中的溶解度和混晶的溶解度随着纯度的改变而改变。通常，可依据结晶外观的色泽均匀，晶形一致程度和是否具有一定的熔点和较小的熔距；结合在薄层色谱或纸色谱上，经数种不同展开系统展层，均显示出的单一近圆形的斑点来判断结晶的纯度。必要时，可制备衍生物，采用高效薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱来进一步确定结晶是单一化合物。4．干燥分离得到的单体需要干燥，除去附着在结晶表面的少量水分或溶剂，尤其在进行测定熔点。波谱分析、定性和定量分析时必须使其完全干燥，以免影响检测的准确性。在两相溶剂萃取后，有机相需干燥除去水分，精制或再生溶剂时也需干燥脱水。所以，干燥是天然药物化学实验中最普通而又很重要的操作。选择适宜的干燥方法，选择适当的干燥剂是本操作的关键。（1）基本原理干燥的方法大致可分为物理法和化学法两种。吸附、分馏以及利用共沸蒸馏除去水分均为物理法。用吸附物理法干燥时，常用分子筛吸附去水，分子筛是多水硅铝酸盐的晶体，晶体内部有许多孔径大小均一的微孔，具有很强的吸咐能力，能有效地把小于其孔径的分子吸进孔内，从而达到将不同大小的分子“筛分”的目的。其无毒、无腐蚀性，不溶于水和有机溶剂，能在pH为5～12的范围内使用。常用的为3A[钾A]型和4A[钠A]型，它们的微孔的表观直径分别约为3．2?、4．2?，能吸附直径≤4?的分子，商品规格的吸附水量分别为≥170mg／g、≥240mg／g（水分子的直径约为3?，最小有机分子甲烷的直径为4．9?）。新的分子筛用前应于350℃±10℃，烘2h活化脱水，待冷至200℃左右，应立即存于干燥器内备用。分子筛宜用于除去微量的水分，如样品中水分过多，应先用其它干燥剂去水后，再用分子筛干燥。用过的分子筛可在相同温度烘烤解吸后重复使用。化学法是以干燥剂去水，按其去水作用可分为两类：①能与水可逆地结合生成水合物如氯化钙、硫酸钠等。②与水发生不可逆的化学反应生成新的化合物，如金属钠、五氧化二磷。实验室应用最广泛的是前者。（2）固体的干燥重结晶后，滤集的结晶表面上仍吸附有少量溶剂，需根据其性质选择适当的方法进行干燥。少量结晶可用数层滤纸挤压吸出溶剂，此法常使晶体上沾污滤纸纤维。对易挥发性溶剂，可将结晶置表面皿上铺成薄层，上覆一滤纸避免灰尘沾污，置于室温自然干燥。对热稳定的化合物可置红外干燥箱或烘箱中加热干燥。因溶剂的存在，使结晶可能在较其熔点低得多的温度下就开始熔融，因此操作中应十分注意控制温度并经常翻动，以免造成分解或变色。置干燥器内常压或减压下进行干燥是最常用的方法，其适物生做om心.c专oo-bi秀.b物w生ww用于易吸湿，在较高温度干燥时会分解或变色的物质，以及未明性质的样品的干燥。真空干燥器干燥效率较高，抽气时干燥器外需以布包裹，一般以盖子推不动为宜，以防炸碎，最常用的干燥剂是变色硅胶。石蜡片可用来吸收乙醚、氯仿、苯等溶剂。实验过程中抽滤得的固体析出物视具体情况选择处理。真空恒温干燥器（干燥枪）干燥效率高，特点是可除去结晶水或结晶醇，需专用装置，当需要化合物完全干燥（如作波谱分析送样），才采用本法进行干燥处理。（3）液体的干燥溶剂萃取液在浓缩前和溶剂的精制，再生脱水干燥是必经的步骤。选择干燥剂的首要条件是其不与被干燥的有机化合物发生任何反应和互溶，次之是干燥效能和价格低廉。操作时应将被干燥的液体中的水分尽可能分离干净，不应有任何可见的水层。干燥剂的用量要适当，因其在吸水的同时也会吸附部分溶质和溶剂，必要时，宁可先加入一些干燥剂，密塞后振摇片刻，放置一段时间，若发现干燥剂附着瓶壁互相粘结，可过滤后再加入新的干燥剂或更换干燥效能较强的干燥剂。因液体中含水量不同，干燥剂质量、颗粒不同，处理时温度不同等因素，难以规定干燥剂具体用量，实验者应在实践中仔细观察积累经验。5．其他方法沉淀法、盐析法、吸附法、透析法、升华法等也是分离、纯化天然产物的常用方法。该部分内容在理论教材中已作介绍。事实上，从天然药物中获得单体常是多种分离手段结合运用，逐步分离，纯化的结果。（三）色谱分离技术色谱法是目前一种被广泛应用的物理、化学的分离纯化、分析的方法。由于天然产物的各类成分结构不同，性质各异，选择的色谱法也不同的。如一般生物碱的分离可用氧化铝或硅胶吸附色谱法；极性较高的生物碱可用分配色谱法；季铵型水溶性生物碱常用分配色谱法或离子交换色谱法；对具多元酚结构的黄酮类和鞣质的分离前用聚酰胺色谱法或葡聚糖凝胶色谱法；分离三萜皂苷常用大孔吸附树脂法和分配色谱法。总的来说，对非极性成分往往考虑硅胶或氧化铝吸附色谱法；若极性较大的成分则采用分配色谱法或弱吸附剂的吸附色谱法；对酸性或两性成分可用离子交换色谱法，有时也可用吸附色谱法或分配色谱法；凝胶色谱法用于分离分子大小差异较大的物质。根据色谱分离原理不同，现将几种常用的色谱分离技术介绍如下：1．吸附色谱法在天然产物的分离与精制工作中，吸附色谱法应用十分广泛。吸附色谱法是利用混合物中不同组分的分子、溶剂分子与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用不同，引起了不同的物理吸附性能，随着流动相的移动，在不断地进行着吸附、解吸附的可逆过程中，藉各组分在两相间的迁移速度不同而达分离的方法。物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱及洗脱难易（迁移快慢）都大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。常用的吸附剂是硅胶、氧化铝和活性炭，前二者均属极性吸附剂。硅胶略呈酸性，具有中程度吸附能力，应用最广泛，适用于分离极性、非极性化合物。氧化铝具有较强的极性，市售色谱商品有碱性（pH10），中性（pH7）及酸性（pH4）3种氧化铝，，其中以碱性氧化铝的吸附性最强。硅胶和氧化铝物生做om心.c专oo-bi秀.b物w生ww的吸附能力（活度）与含水量有关，其分级见表1一2。硅胶活化温度为100℃～110℃，烘30min。氧化铝在400℃活化6h，可得I～II级活度，保存于密闭容器中备用。用时根据需要，按表1一2，在氧化铝中分次加入计算量的水，充分搅匀，不时振摇，平衡3h～4h后，测定其活度。关于活度测定方法，是采用对一系列偶氮苯染料吸附情况判断定级。详细操作参阅《分析化学》教材。表1一2硅胶、氧化铝的活度与含水量 活度等级ⅠⅡⅢⅣⅤ活性炭属非极性吸附剂，对非极性物质有较强的亲和能力，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中随着溶剂极性的降低吸附力降低。适用于分离亲水性成分。市售色谱商品有粉末状、颗 粒状和锦纶活性炭3种，其吸附活性依次减弱。用前，前二者150℃，后者100℃活化4h。 含水量（％） 硅胶 0 5 15 25 28 氧化铝 0 3 6 10 15吸附色谱法的三要素是吸附剂、溶剂（展开剂、洗脱剂）、被分离物质，三者之间相互联系又相互制约，处理好三者的关系是分离成败的关键。（1）吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法是一种将吸附剂用适当方法涂布于玻璃板或薄膜、铝箔片上进行色谱分离的操作方法，具有微量、快速、简便的特点，广泛应用于天然产物的定性、定量分析、微量制备，也可配合柱色谱作跟踪分离等。被分离物质的极性、酸碱性等性质是选择吸附剂的主要依据。供薄层色谱用的商品吸附剂的种类有单纯的、添加粘合剂的、添加荧光剂的。常用的硅胶H，硅胶G（含石膏15％～35％）。氧化铝G、硅胶HF254（指含在紫外波长254nn1激发下显荧光的物质）等。有时，用0．3％～2％酸溶液。0．4％～2％氢氧化钠溶液或用乙酸钠，磷酸盐等不同pH缓冲溶液代替水铺板，以期改变吸附剂性能而达到提高分离效果的目的。为提高糖。醇类化合物的分离效果，有时用硅胶：氧化铝（1：1）铺板。为分离不饱和程度不同的化合物，常用10％硝酸银溶液代替水铺板（操作时注意避光）。上述方法制成的薄层称作特殊薄层。在吸附色谱的三要素中，展开剂的选择是最关键的。主要考虑溶剂的极性和溶剂的选择性（溶解度）。极性大的被分离物质需用极性较大的展开剂。实际工作中需经试探实验而确定合适的展开剂，其方法是在一块薄层板上，用铅笔划分成若干小格，于各小格中央点上一滴样品，使挥干溶剂后，用毛细管吸取极性大小不同的各种溶剂，点加到各样品点上，待扩散后在紫外光灯下观察或用显色剂显色，如果某一溶剂能很好地把样品展开成一层层明显的色环，就用此溶剂在薄层板上试展层，以能使欲分离的主要物质的Rf值在0.3～0.7的范围，或使混合物能达到最佳分离度作为指标。通常，尚需要在此溶剂基物生做om心.c专oo-bi秀.b物w生ww础上进一步调整展开剂的极性，采用混合溶剂。在分离碱性或酸性物质时，可在展开剂中加入少量碱（氨水、二乙胺）或酸（甲酸、醋酸），也可在层析缸内置一小杯挥发性碱或酸，均能收到良好分离效果。有时溶剂中含少量极性杂质，如氯仿中含1％乙醇。乙醚中含少量的水，会影响展开剂的极性，因此，为了提高色谱分离的效果和重现率，要注意所用溶剂的规格和混合溶剂配制的准确性。文献介绍和实践经验在优选展开剂工作中常起着主导作用。薄层色谱操作包括：制板――点样――展开――定位等步骤。若为制备性薄层，还须有洗脱操作。 ①制板
市售商品预制薄层板有氧化铝G，硅胶G，硅胶GF254等。但目前最常用的仍是手工自制板。用于制备薄层板的玻璃要求表面光洁、平整，最好使用1mm～2mm厚的优质平板玻璃。常用规格有5cm×10cm，5cm×l5cm，15cm×l5cm等，有时也用载玻片的。用前须用洗液或碱液清洗并晾干存放。铺板的方法可分为干法和湿法两类。干法铺板是将吸附剂直接均匀地铺于玻璃板上，虽方法简单，但因易吹散、松动，给操作带来不便，用的甚少。湿法铺板是将吸附剂加水或其它溶液先调成糊状再铺层。为了增加板的硬度，便于使用，常添加适量粘合剂（如石膏。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）或两者混合使用）。硅胶G板是1g硅胶G，加3ml水，调成糊状，铺于玻璃板上。硅胶G一CMC-Na板是用1g硅胶G加3ml0.5％～1％
CMC-Na水溶液，调或糊状，制成的薄板）前者比较脆，易从玻璃上脱落，不宜用铅笔在上面写字，但能耐受腐蚀性试剂。后者硬度较大，可用铅笔写字但不宜在强腐蚀性试剂存在时加热。薄层板要求无气泡，厚度均一，一般厚度为0．25mm～0．5mm。涂铺的薄层板置于水平台面上自然干燥后，即可在100℃～105℃活化30min～60min，保存于干燥器中备用。②点样
将被分离混合物溶于溶解度不是太大的、易挥发的有机溶剂中，配成浓度略高的样品溶液，用毛细管或微量注射器吸取一定体积样品溶液，分次点加样品，样品点直径应不大于3mm。点样基线距底边1.0cm～1.5cm，点间距离可视斑点扩散情况而定，以不影响检出为宜。溶解样品的溶剂在原点的残留会影响展开剂的选择性，除非样品有特殊要求，一般可在上样同步或上样后用红外灯或吹风机加热除去原点残留的溶剂。③展开
薄层的展开需在密闭的层析缸中进行，密闭的层析缸应用展开剂预先饱和片刻。将点样后的薄层板，移入缸内，置于支架上暂勿接触展开剂，吸附饱和片刻，使与层析缸内饱和展开剂的气体达到平衡状态。然后，将薄层板点样端浸入展开剂，其深度约为0．5cm，进行展开。因薄层的毛细管作用展开剂向上升，被分离物质随着展开剂上升而迁移，各成分因迁移速度不同而分离；待展开剂上升到预定高度（6cm～15cm），取出薄层板置通风处或红外线快速干燥箱内烘干。这是最常用的上行展开方式，此外，还有下行、近水平、环形、单向二次展开或双向展层等方式。④定位和显色
薄层色谱展开后，通常先在日光下观察，确定色斑的位置并标出有色物质的色斑，然后在紫外光灯254nm和（或）365nm下观察和标记。需要时，可用通用试剂或特征试剂显色定位。计算各色斑的Rf值。制备薄层色谱法该法是利用薄层色谱法操作简便和有一定的载样量的优点，分离精制少量单一化合物的方法，与上述薄层色谱操作不同点是：薄层厚度一般增加至2mm～3mm，薄层板的宽度和块数根据需要的样品量而定；样品溶液浓度一般在5％～10％，可将样品点成条状，提高薄层的载样量；色带定位最好采用紫外光物生做om心.c专oo-bi秀.b物w生ww包含各类专业文献、应用写作文书、各类资格考试、生活休闲娱乐、行业资料、专业论文、外语学习资料、高等教育、74天然药物化学实验讲义等内容。　
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高级食品检验工理论考核复习题2
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