第三章 发酵培养基 - 发酵工程原理发酵,原理,第三章,培养基,酵工程原理,发酵..
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第三章 发酵培养基 - 发酵工程原理
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3秒自动关闭窗口榆耳发酵培养基及发酵条件的优化--《食品工业科技》2013年15期
榆耳发酵培养基及发酵条件的优化
【摘要】：系统考察了培养基成分及发酵条件对榆耳JX2010菌株液体发酵生物量和发酵液抑菌活性的影响。培养基单因素筛选试验结果表明,玉米淀粉和黄豆粉为最适碳源和氮源;采用均匀设计法对培养基组成优化结果表明,最佳的培养基配方为4.6%玉米淀粉、1.6%黄豆粉、0.03%硫酸镁、0.03%磷酸二氢钾、0.01%磷酸氢二钾、0.001%硫酸锌、0.001%硫酸锰及0.1g/L维生素B1;以此优化的培养基对培养条件研究的结果表明,在10%接种量、20%摇瓶装液量、培养基初始pH5.5的条件下发酵培养时间7d时,发酵效果最好,发酵生物量达到(14.98±0.74)g/L,抑菌直径达到(16.7±0.5)mm。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：S567.39【正文快照】：
榆耳(Gloeostereum incarnatum S.Ito etI mai)是分布于我国东北部山区和日本北海道地区的一种稀有的食药用野生真菌,入药历史悠久。我国民间用于治疗红白痢疾、痔疮、皮炎、腹泻、肠炎等疾病,是一种值得开发利用的药用珍品[1]。榆耳野生资源稀少,与人工栽培相比液体发酵技术
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工业发酵中培养基选择和配制的原则
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& &　培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的质量和产量都有重要的影响。微生物的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶，将周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物，借助于细胞膜的渗透作用，吸收这些小分子营养物质来实现的。不同的微生物的生长情况不同或合成不同的发酵产物时所需的培养基有所不同，但对于所有发酵生产用培养基的设计仍存在某些共同点可供遵循，这就是所有的发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。
　　培养基的选择
　　不同的微生物对培养基的需求是不同的，因此，不同微生物培养过程对原料的要求也是不一样的。应根据具体情况，从微生物营养要求的特点和生产工艺的要求出发，选择合适的营养基，使之既能满足微生物生长的需要，又能获得高产的产品，同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。
　　1、根据微生物的特点选择培养基
　　用于大规模培养的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等四大类。它们对营养物质的要求不尽相同，有共性也有各自的特性。在实际应用时，要依据微生物的不同特性，来考虑培养基的组成，对典型的培养基配方需作必要的调整。
　　2、根据发酵方式选择培养基
　　液体和固体培养基各有用途，也各有优缺点。在液体培养基中，营养物质是以溶质状态溶解于水中，这样微生物就能更充分接触和利用营养物质，更有利于微生物的生长和更好地积累代谢产物。工业上，利用液体培养基进行的深层发酵具有发酵效率高，操作方便，便于机械化、自动化，降低劳动强度，占地面积小，产量高等优点。所以发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。而固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。此外，工业上也常用一些固体原料，如小米、大米、麸皮、马铃薯等直接制作成斜面或茄子瓶来培养霉菌、放线菌。
　　3、从生产实践和科学试验的不同要求选择
　　生产过程中，由于菌种的保藏、种子的扩大培养到发酵生产等各个阶段的目的和要求不同，因此，所选择的培养基成分配比也应该有所区别。一般来说，种子培养基主要是供微生物菌体的生长和大量增殖。为了在较短的时间内获得数量较多的强壮的种子细胞，种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用的原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。常用葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。而发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。当然，如果产物是含氮物质，应相应地增加氮源的供应量。除此之外，发酵培养基还应考虑便于发酵操作以及不影响产物的提取分离和产品的质量。
　　4、从经济效益方面考虑选择生产原料
　　从科学的角度出发，培养基的经济性通常是不被那么重视，而对于生产过程来讲，由于配制发酵培养基的原料大多是粮食、油脂、蛋白质等，且工业发酵消耗原料量大，因此，在工业发酵中选择培养基原料时，除了必须考虑容易被微生物利用并满足生产工艺的要求外，还应考虑到经济效益，必须以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。
　　培养基的配制原则
　　培养基的配制必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分;有利于减少培养基原料的单耗，单位营养物质所合成产物数量大或产率大;有利于提高培养基产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力;有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期;尽量减少副产物的形成;减少对发酵过程中通气搅拌的影响，有利于提高氧的利用率、降低能耗;有利于产品的分离和纯化;并尽可能减少产生“三废”的物质。
　　当然，设计任何一种培养基都不可能面面俱到地满足上述各项要求，需根据具体情况，抓主要环节。使其即满足微生物的营养要求，又能获得优质高产的产品，同时也符合增产节约、因地制宜的原则。发酵培养基的主要作用是为了获得预期的产物，必须根据产物特点来设计培养基。因此要求营养要适当丰富和完备，菌体迅速生长和健壮，整个代谢过程pH值适当且稳定;糖、氮代谢能完全符合高单位罐、批的要求，能充分发挥生产菌种合成代谢产物的能力。此外还要求成本降低。
　　1、根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基
　　不同的微生物所需要的培养基成分是不同的，要确定一个合适的培养基，就需要了解生产用菌种的来源、生理生化特性和一般的营养要求，根据不同生产菌种的培养条件、生物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。
　　2、营养成分的恰当配比
　　微生物所需的营养物质之间应有适当的比例，培养基中的碳氮的比例(C/N)在发酵工业中尤其重要。不同的微生物菌种、不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同的。菌体在不同生长阶段，对其碳氮比的最适要求也不一样。培养基的碳氮比不仅会影响微生物菌体的生长，同时也会影响到发酵的代谢途径。由于碳既作碳架又作能源，所以用量要比氮多。从元素分析来看，酵母细胞中碳氮比约为100:20，霉菌约为100:10。一般发酵工业中培养基碳氮比约为100: (0.2～2.0)，但在氨基酸发酵中，因为产物中含有氮，所以碳氮比就相对高一些。如谷氨酸发酵的碳氮比为100: (15～21)，若碳氮比为100: (0.2～2.0)，则会出现只长菌体，几乎不产谷氨酸的现象。
　　碳氮比随碳水化合物及氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，很难确定统一的比值。一般情况下，碳氮比偏小，能导致菌体的旺盛生长，易造成菌体提前衰老自溶，影响产物的积累;碳氮比过大，菌体繁殖数量少，不利于产物的积累;碳氮比较合适，但碳源、氮源浓度高，仍能导致菌体的大量繁殖，增大发酵液粘度，影响溶解氧浓度，容易引起菌体的代谢异常，影响产物合成;碳氮比较合适，但碳源、氮源浓度过低，会影响菌体的繁殖，同样不利于产物的积累。
　　3、渗透压
　　配制培养基时，应注意营养物质要有合适的浓度。营养物质的浓度太低，不仅不能满足微生物生长对营养物质的需求，而且也不利于提高发酵产物的产量和提高设备的利用率。但是，培养基中营养物质的浓度过高时，由于培养基溶液的渗透压太大，会抑制微生物的生长。此外培养基中的各种离子的浓度比例也会影响到培养基的渗透压和微生物的代谢活动，因此，培养基中各种离子的比例需求要平衡。在发酵生产过程中，在不影响微生物的生理特性和代谢转化率的情况下，通常趋向在较高浓度下进行发酵，以提高产物产量，并尽可能选育高渗透压的生产菌株。当然，培养基浓度太大会使培养基黏度增加和溶氧量降低。
　　4、pH值
　　各种微生物的正常生长均需要有合适的pH值，一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境。为此，当培养基配制好后，若pH值不合适，必须加以调节。当微生物在培养过程中改变培养基的pH值而不利于本身的生长时，应以微生物菌体对各种营养成分的利用速度来考虑培养基的组成，同时加入缓冲剂，以调节培养液的pH值。
　　5、氧化还原电位
　　对大多数微生物来说，培养基的氧化还原电位一般对其生长的影响不大，即适合它们生长的氧化还原电位范围较广。但对于厌氧菌，由于氧的存在对其有毒害作用，因而往往在培养基中加入还原剂以降低氧化还原电位。
　　在配制培养基时，除应注意以上几条原则外，还要考虑到营养成分的加入顺序，为了避免生成沉淀而造成营养成分的损失，加入的顺序一般为先加入缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质。
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简述配制培养基应遵循的几个原则?
简述配制培养基应遵循的几个原则?
1.目的明确
培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同,原料的选择和配比不同；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；
根据不同的工作目的,微生物不同的营养需要,运用自己丰富的生物化学和微生物学知识来配制最佳的培养基.2.营养协调
微生物细胞组成元素的调查或分析,是设计培养基时的重要参考依据.
微生物细胞内各种成分间有一较稳定的比例.
在大多数化能异养菌的培养基中,各营养要素间在量上的比例大体符合以下十倍序列的递减规律：
要素：H2O＞C源+能源 ＞N 源 ＞P、S＞K、Mg＞生长因子
含量：(～10-1) (～10-2) (～10-3) (～10-4) (～10-5)
(～10-6)A.选择适宜的营养物质,实验室的常用培养基：
细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；
放线菌：高氏1号合成培养基培养；
酵母菌：麦芽汁培养基；
霉菌：查氏合成培养基；
实验室一般培养：普通常用培养基；
遗传研究：成分清楚的合成培养基；
生理、代谢研究：选用相应的培养基配方；B.营养物质浓度及配比合适
营养物质的浓度适宜, 营养物质之间的配比适宜；
高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑制或杀菌作用.
培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和（或）代谢产物的形成和积累,其中碳氮比（C／N）的影响较大.真菌需C／N比较高的培养基；（素食）细菌（动物病原菌）需C／N比较低的培养基；（荤食）
发酵生产谷氨酸时：
碳氮比为4/1时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少；
碳氮比为3/1时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加.
NH3 ＞ CO(NH2)2 ＞ NH4NO3 ＞ (NH4)2CO3 ＞ (NH4)2SO4
含氮量（82％）（46％）
（29.2％）
这说明在同样重量时,在以上各氮源中含氮量以氨为最高,尿素次之,硝酸铵和碳酸铵更次之,而硫酸铵则最低.3.理化适宜指培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件较为适宜.包括：pH、渗透压和水活度、氧化还原电位(1) pH
各大类微生物都有其生长适宜的pH范围,培养基的pH必须控制在一定的范围内,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物.
通常培养条件：（初始pH ）
细菌： pH 7.0~8.0
放线菌：pH 7.5~8.5
酵母菌： pH 3.8~6.0
霉菌：pH 4.0~5.8
藻类： pH 6.0~7.0
原生动物： pH 6.0~8.0
嗜极菌（extremophiles）
在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物,为了维持培养基pH的相对恒定,通常要进行pH的调节.
pH的调节包括pH的内源调节和pH的外源调节.a.pH的内源调节:通过培养基内在成分所起的调节作用,就是pH的内源调节. 第一种是采用磷酸缓冲液进行调节.
［K2HPO4］/［KH2PO4］＝1时,溶液的pH稳定在6.8.调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比可获得pH 6.0～7.6间的一系列稳定的pH.反应原理：K2HPO4＋HCl→KH2PO4＋KCl KH2PO4＋KOH→K2HPO4＋H2O第二种以CaCO3作“备用碱”进行调节.CaCO3（不溶于水又是沉淀性的,在培养基中分布不均匀）、NaHCO3均可用来调节培养基的pH.b.pH的外源调节:
这是一类按实际需要不断从外界流加酸或碱液,以调整培养液的方法. (2) 渗透压和水活度
渗透压（osmotic pressure）是某水溶液中一个可用压力来量度的一个物化指标.
它表示两种浓度不同的溶液间被一个半透性薄膜隔开时,稀溶液中的水分子会因水势（water potentiality）的推动而透过隔膜流向浓溶液,直到浓溶液产生的机械压力足以使两边水分子的进出达到平衡为止,这时由浓溶液中的溶质所产生的机械压力,即为它的渗透压值.
与微生物细胞渗透压相等的等渗溶液最适宜微生物的生长；
高渗溶液会使细胞发生质壁分离；
低渗溶液则会使细胞吸水膨胀,形成很高的膨压,这对细胞壁脆弱或丧失的各种缺壁细胞,例如原生质体、球状体或支原体来说,则是致命的.
水活度即aw（wateractivity）是一个比渗透压更有生理意义的一个物化指标.它表示在天然或人为环境中,微生物可实际利用的自由水或游离水的含量.各种微生物生长繁殖范围的aw值在0.998～0.6之间：（3）氧化还原电势（redox potential）
又称氧化还原电位,是度量某氧化还原系统中还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标.
一般以Eh表示,它是指以氢电极为标准时某氧化还原系统的电极电位值,单位是V（伏）或mV（毫伏）.不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同:
好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜；
厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长；
兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸,+0.1伏以下时进行发酵.氧化还原电位与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响:
增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压,或加入氧化剂,从而增加Eh值在培养基中加入巯基乙醇、抗坏血酸（Vc,0.1%）、硫化氢(0.025%)、半胱氨酸（<0.05%）、谷胱甘肽、铁屑、二硫苏糖醇、庖肉（瘦牛肉粒）等还原性物质可降低Eh值.
测定氧化还原电势除用电位计外,还可在培养基中加入化学指示剂刃天青（resazurin）进行间接测定.
刃天青在无氧条件下呈无色（Eh＝-40 mV）；在有氧条件下,其颜色与溶液的pH相关；（中性——紫色；碱性——蓝色；酸性——红色）；在微量氧时,它呈粉红色.4.经济节约
配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,以降低
(1)以粗代精：对微生物来说,各种粗原料营养更加完全,效果更好.而且在经济上也节约.大量的农副产品或制品,如麸皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料.
(2)以“野”代“家”： 以野生植物原料代替栽培植物原料,如木薯、橡子、薯芋等都是富含淀粉质的野生植物,可以部分取代粮食用于工业发酵的碳源.
(3)以废代好：以工农业生产中易污染环境的废弃物作为培养微生物的原料.例如,糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、 豆制品工业废液、黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等.
工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,在我国农村,已推广利用粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料.
(4)以简代繁：某制药厂改进链霉素发酵液中的原有配方,设法减去30-50%的黄豆饼粉、25%的葡萄糖和20%硫酸铵,结果反而提高了产量.
(5)以氮代朊：以大气氮、铵盐、硝酸盐或尿素等一类非蛋白质或非氨基酸廉价原料用作发酵培养基的原料,让微生物转化成菌体蛋白质或含氮的发酵产物供人们利用.
(6)以纤代糖：开发利用纤维素这种世界上含量最丰富的可再生资源.将大量的纤维素农副产品转变为优质饲料、工业发酵原料、燃料及人类的食品及饮料.
(7)以“国”代“进”： 以国产原料代替进口原料,尽量减少工业成本.国内青霉素发酵工业的迅速发展,依赖于找到了富有中国特色的培养基配方,即用廉价的棉子饼（或花生饼）和白玉米粉代替玉米浆和乳糖.
1）目的明确；2）营养协调；3）理化条件适宜；4)经济节约}