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EPHB4基因启动子区域甲基化情况及其多态性与非小细胞肺癌关系的实验研究
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EPHB4基因启动子区域甲基化情况及其多态性与非小细胞肺癌关系的实验研究.PDF
官方公共微信来源：《中华实用儿科临床杂志》2012年第01期 作者：张文迪;余肖;黄姗;罗小平;
5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系
先天性心脏病(CHD)是引起新生儿死亡的出生缺陷病或基因疾病中最常见的疾病[1-3]。全世界范围内,在活产婴儿中CHD发生率为1%,在流产或死胎的胎儿中发生率更高[4];在我国新生儿中CHD的发生率为1%～2%[5]。目前CHD的病因和发病机制尚未明确。有研究发现,5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因与CHD存在密切关系[6]。文献报道叶酸缺乏是CHD发生的重要危险因素[7],而MTHFR是叶酸代谢途径的关键酶。目前,国内外的研究主要集中在MTHFR多态性方面,但是结论尚不统一。已经证明启动子区域超甲基化能够影响一些基因的表达,进而影响基因在生物生长发育中的正常功能。本研究采用甲基化特异性PCR(MSP)检测CHD患儿MTHFR基因启动子甲基化状态,分析MTHFR基因启动子甲基化与CHD的关系,探讨CHD的病因和发病机制,为CHD的预防、早期诊断和治疗提供理论依据。1资料与方法1.1一般资料病例组和对照组来自2008年1月-2010年1月本院儿科病房,均为武汉市及周边地区的汉族人。CHD患儿53例为病例组。男29例,女24例;年龄10个月～14......(本文共计3页)
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中华实用儿科临床杂志
主办：新乡医学院
出版：中华实用儿科临床杂志杂志编辑部
出版周期：半月
出版地：河南省新乡市文档分类：
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于MTHFR启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：MTHFR启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系 华中科技大学硕士学位论文MTHFR启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系姓名:张文迪申请学位级别:硕士专业:儿科学指导教师:罗小平2010-05华中科技大学硕士学位论文1MTHFR 启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科硕士研究生:张文迪指导教师:罗小平教授中文摘要目的目前我们对先天性心脏病(congenital heart diseases, CHDs) 的发病原因和机制了解还很少,部分文献表明 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolatereductase, MTHFR) 基因单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms ,SNPs)与CHDs 的发生有关,但也有文献显示基因 MTHFR 启动子区域超甲基化可能在 CHDs的发病中起了重要作用。本研究通过比较 CHDs 患儿与无出生缺陷的正常儿童MTHFR 启动子区域甲基化状态,旨在了解 MTHFR 启动子区域甲基化状态与 CHDs的关系。方法收集先天性心脏病(CH(来源：淘豆网[/p-4733771.html])Ds)儿童外周静脉血液标本 53 例,无先天性出生缺陷的正常儿童血液标本 80 例,提取外周血白细胞 DNA,然后对 DNA 进行亚硫酸氢钠修饰,采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术通过特异性引物检测 MTHFR 基因启动子区域 CpG 岛甲基化状态,分析 MTHFR 基因启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系。结果 MSP 分析显示,MTHFR 基因启动子区域在病例组中完全甲基化率(2/53,3.77%)稍高于对照组(2/80,2.50%);不完全甲基化率病例组(13/53,24.53%)亦稍高于对照组(9/80,11.25%)。但二者之间差别均无统计学意义(p=0.110)结论 MTHFR 基因启动子区域甲基化状态在 CHDs 患儿与正常对照组之间不存在显著差异性,MTHFR 基因启动子区域超甲基化可能不是导致 CHDs 发病的主要原因。关键词先天性心脏病;甲基化;MTHFR;启动子华中科技大学硕士学位论文2Associations of Methylation status in(来源：淘豆网[/p-4733771.html]) the MTHFR promoterregion with Congenital heart diseasesDepartment of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University ofScience and Technologypost-graduate: Zhang WendiTutor: Pro. Luo XiaopingABSTRACTObjective The etiogenic mechanisms of congenital heart diseases (CHDs) are still poorlyknown. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the etrahydrofolatereductase (Methylene tetrahydrofolate reductase ,MTHFR) gene have been re(来源：淘豆网[/p-4733771.html])vealed to beinvolved in CHDs; However, other mechanisms of pathogenesis, for example, promoterregion hypermethylation, may also play a important role. Therefore, in our study, pared the methylation status of the promoter region of MTHFR in children with CHDswith children without congenital birth defects. We did it in order to get the message of therelation of the methylation status of the promoter region of MTHFR and CHDs.Methods we collected periph(来源：淘豆网[/p-4733771.html])eral venous blood samples of 53 patients with CHDs and 80healthy children without congenital birth defects (controls), and abstracted DNA fromleukocytes. Then, the DNA were modified by sodium bisulfite and analyzed by MethylationSpecic PCR (MSP) amplication, which use primers that hybridize to the CpG islands inthe promoter region of MTHFR. And the relation of the methylation status of the promoterregion of MTHFR and CHDs was analyzed by case-contro(来源：淘豆网[/p-4733771.html])l study.Results In peripheral venous blood, the analysis result of MSP revealed that, pletemethylation ratio in case (2/53,3.77%) is slightly higher than control(2/80,2.50%); plete methylation ratio in case (13/53,24.53%) is also slightly higher than control华中科技大学硕士学位论文3(9/80,11.25%). But there is no statistical significance between them (p=0.110).Conclusions There is no differences between children with CHDs and children withoutcongenital birth def(来源：淘豆网[/p-4733771.html])ects about the methylation status of the promoter region of MTHFR,The causative mechanisms of CHDs is not due to the hypermethylation status of thepromoter region of MTHFR.Key words congenital heart diseases methylation MTHFR promoter独创性声明本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名:日期: 年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门(来源：淘豆网[/p-4733771.html])或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□,在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年月日日期: 年月日华中科技大学硕士学位论文4MTHFR 启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系前言新生儿先天性出生缺陷是全世界范围内面临的一个重大问题。据统计,我国每年新增先天性出生缺陷患儿超过 80 万,导致累计的残疾人的数量数千万,给家庭和社会带来了巨大的经济负担及精神压力, 直接影响着民族的兴旺和繁荣。其中影响最为严重者为先天性心脏病和神经系统缺陷如神经管畸形、痴呆、失聪、失明,而目前这些疾病大部分都无法有效治愈。先天性心脏病(congenital heart diseases, CHDs)是最常见的人类出生缺陷,它严重影响新生儿的健康状况,数千患有复杂 CHDs 的新生儿(来源：淘豆网[/p-4733771.html])在出生后第一年夭折,在引起新生儿死亡的多种出生缺陷或基因疾病中,CHDs 是最常见的死亡原因[1-4]。其发生率就全世界来讲,在活产婴儿中大约为 0.6-0.8%[5]。Kim Y[6]报道在美国活产婴儿 CHDs 发生率大约为 1%,在死产婴儿中的比例则更高,大约为10%。我国活产婴儿中 CHDs 的发生率为 0.7-0.8%,即我国每年大约有 10 万到 15 万的 CHDs 新增病例[7]。根据心脏异常发育类型 CHDs 主要分为室间隔缺损(ventricularseptal defect, VSD)、房间隔缺损(atrial septal defect, ASD)、动脉导管未闭(patent ductusarteriosus, PDA)、法洛四联症(tetralogy of Fallot, TOF)、肺动脉狭窄(pulmonary arterystenosis, PS)、大动脉转位(transposition of the great arteries, TGA)等症。Wren C 等(来源：淘豆网[/p-4733771.html])[8]在英国几个城市就 1985 年到 1997 年之间的人口做了相关调查,对 CHDs 各类型的发病率进行了数据统计,其中 VSD 的发生率最高(0.188%),具体见图 1。然而 CHDs 发病的原因和机制到目前还不明确,为临床预防、早期诊断和干预以及治疗等工作带来了很大的困难,因此阐明 CHDs 发病的原因和机制是当前儿科工作者的一项重要工作。目前研究认为,CHDs 的发病是多环境因素和多基因因素相互作用的结果。当前国内外研究的方向主要集中在父母 5, 10- 亚甲基四氢叶酸还原酶(etrahydrofolate reductase, MTHFR)多态性、母体孕产期补充叶酸和 VitB、母体血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度、宫内感染、孕妇体重及受教育水平等因素与 CHDs 的关系,以及作为一个疾病综合征的某个症状进行研究。还有研究人员对心脏发育的相关基因和华中科技大学硕士学位论文5蛋白的异常进行研究,但是还没有形成完整统一的结论。大量文献显示,母体孕期补充叶酸和 VitB 等营养因素对先天(来源：淘豆网[/p-4733771.html])性心脏病有保护作用的结论相对比较肯定。图 1. 包括解剖学和生理学两个层面的心脏畸形发病率[8]叶酸是甲硫氨酸再生成以及后续 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成的关键因子,而 SAM是 DNA 甲基化、生成嘌呤和嘧啶以及 DNA 合成与修复的甲基供体,因此叶酸的缺乏或者代谢异常将会通过核酸甲基化、DNA 的整合与修复等途径影响 DNA 的正常功能。MTHFR 是叶酸代谢的关键酶,它能够非可逆的催化 5,10-亚甲基四氢叶酸转化为 5-甲基四氢叶酸。其中,5,10-亚甲基四氢叶酸是叶酸代谢的中心产物;5-甲基四氢叶酸是 SAM 的前体,它是甲硫氨酸再生成的辅助因子和底物。如果 MTHFR 发生突变或者功能异常,就会导致合成的 5-甲基四氢叶酸相对于生成新的甲硫氨酸严重不足,这将引起基因组 DNA 和一些特殊基因的低甲基化,如 p53 基因[9,10]。有研究表明MTHFR 的功能异常与先天性神经管缺陷(NTDs)发生的高危险性和妊娠期并发症等有华中科技大学硕士学位论文6关系,也可能包括其他先天性出生缺陷[11],如 CHDs,可能会影响到心脏和血管系统发育相关基因的功能。MTHFR 不仅是脱氧尿苷一磷酸向胸腺嘧啶转化的辅助因子,而且对 DNA 的合成也至关重要[12,13]。可见,MTHFR 维持着核酸合成和甲硫氨酸合成对叶酸利用的平衡,因为它的底物和反应产物分别是胸腺嘧啶合成和同型半胱氨酸再甲基化为甲硫氨酸所必需的[14,15]见图 2[15]。MTHFR 是同型半胱氨酸再甲基化为甲硫氨酸所必需的,当 MTHFR 的功能发生异常时,就会引起血浆同型半胱氨酸水平的升高,进而出现同型半胱氨酸血症。Li DQ[16]等人通过动物模型发现,母体 MTHFR 功能缺陷而出现同型半胱氨酸可以导致胎儿流产、宫内发育迟缓和心脏缺陷。从大量文献可以看出,MTHFR 的功能缺陷,特别是在叶酸缺乏的条件下,会妨碍很多种类底物的正常甲基化,包括蛋白质、DNA、RNA 和组蛋白等等,原因就在于甲硫氨酸供给量下降。提示 MTHFR 可能在 CHDs 的发生中也占有很重要的地位。图 2. MTHFR 在叶酸代谢及甲硫氨酸循环中的作用[15]华中科技大学硕士学位论文7MTHFR 启动子区域甲基化和后续的基因表达调控下降是一种表观遗传改变,这种改变和基因突变一样可以导致疾病的发生[27]。DNA 甲基化(DNA methylation)是最早发现的修饰途径之一。大量研究表明,DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及 DNA 与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达,是基因调控的一种重要方式[17]。在甲基转移酶的催化下,DNA 的 CG 两个核苷酸的胞嘧啶被选择性添加甲基,形成 5-甲基胞嘧啶,常见于基因的 5'-CG-3'序列[18,19]。大多数脊椎动物基因组 DNA 都有少量的甲基化胞嘧啶,主要集中在基因 5'端的非编码区,并成簇存在。甲基化位点可随 DNA 的复制而遗传,因为 DNA 复制后,甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。环境、基因和表观遗传因素被认为是正常细胞发生转录变异的重要原因,到目前为止,研究 DNA 甲基化是了解疾病表观遗传改变的最好方法。研究发现人类基因组甲基化属共价键修饰,并且发生在 CpG 位点。CpG位点在人类基因组中的分布很不均一,而在基因组的某些区段,CpG 位点数量保持或高于正常概率,这些区段被称作 CpG 岛(CpG islands),平均大小在 1kb 以下。CpG岛主要位于基因的启动子和第一外显子区域,约有 60%以上基因的启动子含有 CpG岛。GC 含量大于 50%,长度超过 200bp 大小。在正常组织内大约有 30000 个 CpG 岛,它们最多占所有 CpG 位点的 7%,所有 CpG 位点的大部分是非甲基化的[20]。正常情况下,甲基化序列包括与 X 染色体、一些印记基因(imprint gene)和组织特殊基因相关的 CpG 岛,还有着丝粒旁的 DNA 序列、不编码的基因内区段、转座子等非 CpG 岛序列。基因的表达除了受到基因突变的影响外,正常甲基化或非甲基化外的基因序列发生异常甲基化将导致疾病的发生,且会随 DNA 甲基化状态的改变而发生改变[21]。已发现了两种异常的甲基化现象,首先是在 5-甲基胞嘧啶减少的条件下总体 DNA 的低甲基化,它将导致原癌基因的高表达和基因组的不稳定性[22,23];其次就是 CpG 岛的局部 DNA 超甲基化,特别是启动子区域的超甲基化将抑制基因的转录,导致基因沉默、抑癌基因失活和不正常的胚胎发育[24-26]。因此推测 CHDs 的发生可能与 MTHFR基因启动子区域超甲基化而影响胚胎发育有关。一些基因的表观遗传的修饰或改变,比如基因启动子区域甲基化和后续的基因表达下调,就像一些基因突变导致疾病发生一样,在疾病的发生中起着重要的作用[27]。华中科技大学硕士学位论文8综合国内外的文献发现,针对 CHDs 患儿本身的研究较少,目前尚未发现关于MTHFR 启动子区域甲基化状态与 CHDs 相互关系的研究。胎儿在宫内的发育不仅受到母体遗传因素和母体自身环境的影响,且受到胎儿自身表观遗传学基因调控机制(ic mechanism of gene regulation)的影响,而 DNA 甲基化就是这种机制之一。本课题拟通过采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测 MTHFR 基因启动子区域甲基化状态,旨在分析 MTHFR 基因启动子区域甲基化状态与先天性心脏病(CHDs)的关系,探索和进一步认识 CHDs 发病的原因和机制,为临床预防、早期诊断和干预提供理论依据。播放器加载中，请稍候...
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MTHFR启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系 华中科技大学硕士学位论文MTHFR启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系姓名:张文迪申请学位级别:硕士专业:儿科学指导教师:罗小平2010-05华中科技大学硕士学位论文1MTHFR 启动子区域甲基化状态与先天性心脏病的关系华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科硕士研究生:张文...
内容来自淘豆网转载请标明出处.& 一种用于定量分析ABO基因启动子区域甲基化水平方法的建立
一种用于定量分析ABO基因启动子区域甲基化水平方法的建立
摘 要：目的：建立重亚硫酸盐测序法（BSP法）定量分析ABO基因启动子区CpG岛的甲基化水平。方法：提取胃癌细胞株MKN45和KatoⅢ以及人全血基因组DNA,以重亚硫酸盐转化法修饰其DNA,应用Meth P
【题　名】一种用于定量分析ABO基因启动子区域甲基化水平方法的建立
【作　者】应燕玲 陶苏丹 和艳敏 许先国 朱发明 吕杭军 严力行
【机　构】浙江省血液中心 杭州310006 卫生部血液安全研究重点实验室 杭州310006
【刊　名】《中国卫生检验杂志》2011年 第1期 4-6页　共3页
【关键词】重亚硫酸盐直接测序法 甲基化 CpG岛 定量
【文　摘】目的：建立重亚硫酸盐测序法（BSP法）定量分析ABO基因启动子区CpG岛的甲基化水平。方法：提取胃癌细胞株MKN45和KatoⅢ以及人全血基因组DNA,以重亚硫酸盐转化法修饰其DNA,应用Meth Primer软件在ABO基因启动子区非CpG位点区设计4对特异性甲基化扩增引物,将ABO启动子附近区域的CpG岛分成4个片段分别扩增,优化PCR扩增条件后进行T-A载体克隆和测序分析,采用BiQ Analyzer软件分析ABO基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果：PCR扩增获得了约2kb的完整CpG岛片段,共包含191个CpG位点,测序图谱证实亚硫酸盐转化修饰完全。MKN28细胞株整个CpG岛内191个检测的CpG位点全部甲基化,细胞株KatoⅢ甲基化比例为8.9%,随机标本DNA甲基化比例为30.4%。结论：建立的方法可检测出ABO基因启动子区CpG岛所有CpG位点的甲基化状况,定量分析其甲基化水平。
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重亚硫酸盐直接测序法,甲基化,CpG岛,定量
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