（2013o台州）听长辈说制作生伴菜不能添加黄瓜，难道黄瓜能使蔬菜中的营养素流失吗？[查阅资料]青椒等蔬菜中含有大量的维生素C，且维生素C能使蓝色的淀粉碘溶液褪色．[实验操作]步骤一：淀粉碘溶液配制：取1克淀粉，加入100毫升水，搅拌均匀，再加入1毫升碘酒溶液；步骤二：分别榨取新鲜黄瓜汁与青椒汁．各取20毫升青椒汁分别倒入A、B两锥形瓶中，再分别加入黄瓜汁、蒸馏水各40毫升混匀，放置60分钟，中间每隔10分钟搅拌一次；步骤三：取等量蓝色淀粉碘溶液分别装入两个烧杯，分别倒入A、B两溶液，搅拌均匀，静置观察．[现象记录]实验操作实验现象淀粉碘溶液+青椒和黄瓜混合汁蓝色不消褪淀粉碘溶液+青椒汁和蒸馏水蓝色褪去根据上述过程回答下列问题：（1）科学实验需要控制变量．下列情况会影响测定结果的是A、B．A．混合液放置时间不同&&&&&&&B．被测混合液的体积不同&&&&&&&&C．锥形瓶的大小不同（2）在步骤二中每隔10分钟搅拌一次，其目的是使混合液充分接触，加快反应速度．（3）能证实黄瓜汁把维生素C分解了的实验现象是蓝色不消褪．（4）请指出该实验存在的缺陷：样本过于单一；没有重复实验等．
解：（1）控制变量以必须保证一个变量，其他条件相同，只有这样才能确定现象的不同是由此因素引起的．选项A．混合液放置时间不同，维生素含量受到影响，会影响到实验的结果；B．被测混合液的体积不同属于我们要研究的结果，这个数据结果恰好是我们所要的实验结果，所以滴入液体体积的不同不影响实验的结果；C．锥形瓶的大小不同也不会影响测定结果，因此对实验没有影响．（2）步骤二：分别榨取新鲜黄瓜汁与青椒汁．各取20毫升青椒汁分别倒入A、B两锥形瓶中，再分别加入黄瓜汁、蒸馏水各40毫升混匀，放置60分钟，中间每隔10分钟搅拌一次；在步骤二中每隔10分钟搅拌一次，其目的是使混合液充分接触，加快反应速度．&（3）淀粉碘溶液+青椒汁和蒸馏水，实验现象蓝色褪去，说明维生素C能使蓝色的淀粉碘溶液褪色；在淀粉碘溶液+青椒和黄瓜混合汁实验中，由于黄瓜能破坏蔬菜中的维生素C，因此能证实黄瓜汁把维生素C分解了的实验现象是蓝色不消褪．（4）该实验应多设几组进行重复实验，避免偶然性；同时多选取几种样品进行实验，这样实验结果更具有说服力．因此该实验存在的缺陷是没有重复实验；选取的样本过于单一等．故答案为：（1）A、B&&（2）使混合液充分接触，加快反应速度（加快反应速度、混合均匀）&&（3）蓝色不消褪&&（4）样本过于单一；没有重复实验等此题通过对比实验来研究黄瓜能破坏蔬菜中的维生素C．利用维生素C能使蓝色的淀粉碘溶液褪色的原理进行探究．由于是对比实验，作为对比实验时一定注意控制好变量，如果应该控制的不变的量不一样时，就会影响到测定结果．食品分析技术
食品分析技术
作者：admin
来源：admin
更新时间： 10:05:51]
&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&
&&& 609085978090678l73758789435912142.54.5
(GB/T5009.32003)
&& 1204014210g()95l0524h0.5h1h0.5h2mg
2& 1520h()
&&& 11.53.0g35g1520g
&&& 3h121313cm812
495105120130(5060)0.5h100105
&&& 311023h
&&& 6．在水分测定中，恒重的标准一般定为l3mg
&&& (25mL)()5075mL()
1 20g510g5g
(2)1107(8026925)
(Conway)Aw(Aw)(Aw)Aw
& 4&& & 0.0001g1& & 1&& 2528mm7mm4
1.000g5mL5.0g24()12AwAw 250.520.5 h
1& &1& & 1
(1+4)& &0.5& 6mol/L& 30%
(1+4)0.51h(500550)1h20030min(0.5mg)
(500550)()200
&&&&& ,& g
HHpHpHpH =Log ［H］20［H］ ［OH］ = 1014pH7pH7pH=7pH
&RCOOH + NaOHRCOONa+ H2O
0.0591 Log ［H］ = 0.0591pH
pH59.1mVpHpH
100mL 3&& 100mL 3
0.1molL NaOH(AR)120g250mL100mL5.6mL1000mL
0.6g (0.0001g)10511050mL2NaOH30
& 204.2, gmol
11g100mL95
()15mL CO2(89CO2)250mL75800.5h(1h)25mL
4030minCO2
4010g75mL 8016h
5l 0gCO2CO2250mL
50mL340.1molL NaOH 300.1molL NaOH mL
CNaOHmol /L
K= 0.075K= 0.0640.070()K= 0.067K= 0.090K= 0.0 60
l010015()pH
pH=6.8635minpH6.86
10.1mol /L NaOH5mL1015mL
2(NaOH )pH8.2
3CO2CO2100mL0.3m1NaOH23mL20m1CO2()
蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸碱平衡、水平衡的维持；遗传信息的传递；物质的代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养指标。
蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万～数百万，分子的长轴则长数 nm～100 nm，它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素。但含氮则是蛋白区别于其它有机化合物的主要标志。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。一般蛋白质含氮量为16%，即l份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值(6.25)称为蛋白质系数，不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、牛乳及其制品为6.38。
样品与浓硫酸、催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。
三、适用范围
此法可应用于各类食品中蛋白质含量的测定。
四、仪器试剂及玻皿配置
1. 凯氏烧瓶(500 mL)&& 2. 微量凯氏定氮装置&&& 3. 100mL容量瓶1个&
4. 150mL锥形瓶4个&& 5. 酸式滴定装置1套&&& 6. 分析天平（精确到0.0001g）
7. 浓硫酸&&&&&& 8. 硫酸铜&&&&&& 9. 硫酸钾&&& 10.40%氢氧化钠溶液
11.0.100 0 mol/L盐酸标准溶液：吸取8.4 mL浓盐酸，稀释至1000 mL。
盐酸标准溶液的标定：& 精密称取分析纯硼砂（Na2B4O7?10H2O）约1.9g，放入100 mL烧杯中，加入20～30 mL蒸馏水使其溶解（可置电炉上加热），转入100 mL容量瓶中，用少量蒸馏水淌洗烧杯3～4次，洗涤液一并转入容量瓶中，定容至100 mL，摇匀备用。&
准确吸取上述硼砂标准溶液20.00 mL，放入150 mL锥形瓶中，加入2～3滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用盐酸溶液滴定至恰好变为橙色即为终点。由消耗盐酸的体积，计算盐酸的准确浓度。&&&&&&&&&&&&&&&&&&
12. 4%硼酸吸收液：称取20 g硼酸溶解于500 mL热水中，摇匀备用。&&&& &&&&&&&&&&&&&&&
13. 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份0.2%溴甲酚绿95%乙醇溶液与l份0.2%甲基红乙醇溶液混合均匀。
五、操作方法
准确称取固体样品0.20 g～2.00 g(半固体样品2.00 g～5.00 g，液体样品10.00 mL～20.00 mL)，小心移入干燥洁净的500 mL凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5 g、硫酸钾10 g和浓硫酸20 mL，轻轻摇匀后，安装好消化装置，于凯氏瓶口放一小漏斗，并将其以 45°角斜支于有小孔的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30 min。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。装好微量定氮装置，准确移取消化稀释液10 mL于反应管内，经漏斗再加入10 mL 40%氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸汽蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10 mL 4%(或2%)硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10 min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1 min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。馏出液用0.010 00 mol/L HCl标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白试验。
六、结果计算
1.盐酸准确浓度的计算：
式中：Cmol /L
W硼砂 硼砂的质量，g；
VHCl ――消耗盐酸的体积，mL；
0.1906――与1.00mL盐酸标准溶液［c(HCl)＝1.000 mol/L］相当的硼砂的质量，g。
2.计算样品中粗蛋白的含量
蛋白质（%）＝ & &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&× F × 100
盐酸标准溶液的浓度，mol/L；
V1 ―― 滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；
V2 ―― 滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL ；
m ―― 样品质量，g；
M氮―― 氮的摩尔质量，14.01 g/mol；
F ―― 氮换算为蛋白质的系数。
1.所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
2.消化时不要用强火，应保持和缓沸腾；在消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。
3.样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫。为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不时摇动；或者加入少量消泡剂如辛醇、液体石蜡、硅油，同时注意控制热源强度。
4.当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL后再继续加热消化。
5.若取样量较大，如干试样超过5 g,可按每克试样5 mL的比例增加硫酸用量。
6.蒸馏装置不能漏气,蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。
7.硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。
8.蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。
9. 蒸馏前，在硼酸吸收液中加入甲基红－溴甲酚绿混合指示剂2滴，混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。
H2NCONH2 + H2NCONH2 &H2NCONHCONH2 + NH3当脲（尿素）被小心地加热至150℃～160℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲(也叫双缩脲)，反应式如下：
双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，又称为双缩脲反应。
由于蛋白质分子中含有肽键(-CO-NH-)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560 nm。
三、方法特点及应用范围
本法灵敏度较低，但操作简单快速，生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。还可适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。
四、主要仪器试剂及玻皿配置
&&& 1. 分光光度计&&&&&&& 2. 离心机(4000r/min)&&& 3. 50 mL纳氏比色管（9支）
4. 四氯化碳(CCl4)&&&& 5. 碱性硫酸铜溶液&&& ①以甘油为稳定剂，将10 mL10 mol/L氢氧化钾和3.0 mL甘油加到937 mL蒸馏水中，激烈搅拌，同时慢慢加入50 mL 4%硫酸铜(CuSO4?5H2O)溶液。&& ②以酒石酸钾钠作稳定剂，将10 mL 10 mol/L氢氧化钾和20 mL 25%酒石酸钾钠溶液加到930 mL蒸馏水中，激烈搅拌，同时慢慢加入40 mL 4%硫酸铜溶液。
配制试剂时，在加入硫酸铜溶液时必须激烈搅拌，否则将生成氢氧化铜沉淀。
五、操作方法
&&& 1.标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、110 mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50 mL纳氏比色管中，然后各加入1 mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液(①或②)准确稀释至50 mL，振摇10 min，静置1h，取上层清夜离心5 min，取离心分离后的透明液于比色皿中。在560 nm波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。
&&& 2.样品的测定：准确称取样品适量(即使得蛋白质含量在40 mg～110 mg之间)于50 mL纳氏比色管中，加1 mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质 mg数，进而由此求得蛋白质含量。
六、结果汁算
蛋白质(mg／100g)＝
式中:& c ―― 由标准曲线上查得的蛋白质 mg数；
&&&&&& m ―― 样品质量，g。
七、说明及注意事项
1.蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。
2.标准曲线作完整之后，无需每次再作标准曲线。
3.含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。
4.样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，可预先将蛋白质抽出后再进行测定。
5.当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。
&& 氨基酸具有酸性的-C00H基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-C00H基，并用间接的方法测定氨基酸总量。
三、仪器试剂及玻皿配置
仪器：5mL20mL移液管各1支& 分析天平（精确到0.0001g） 碱式滴定装置1套
试剂： 40%中性甲醛溶液&& &0.1%百里酚酞乙醇溶液&&&& 0.1%中性红50%乙醇溶液&&
&0.100 0 mol/L氢氧化钠标准溶液&&& 250mL锥形瓶2个 &&100mL量筒1个
四、操作方法
移取含氨基酸约20 mg～30 mg的样品溶液2份，分别置于250 mL锥形瓶中，各加50 mL蒸馏水，其中l份加入3滴中性红指示剂，用0.100 0 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20 mL，摇匀，静置1 min，用0.100 0 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的碱液体积。
五、结果计算
& 氨基酸态氮(%)＝ ×100
式中:& c ―― 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；&
V1 ―― 用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL ；
V2 ―― 用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL ；
&&& &&m ――测定用样品溶液相当于样品的质量，g；
0.014 ――氮的毫摩尔质量，g/mmol。
六、说明及注意事项
1.此法适用于测定食品中的游离氨基酸。
2.固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5 h即可。
&&& 3.若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。
2.与本法类似的还有单指示剂(百里酚酞)甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-C00H基时的pH为8.5～9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。
& ()() 100g(g)()90.366.639.220.20.20.90.20.8382530
3762KJ (9kcal)
1. 111&&&& 2.&
3. ()& &&&&&&&&&4.&
5. 分析天平（精确到0.0001g） 6. 干燥箱
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
23(5570)612h
12mL1001052h30min
&&& () = 100
七、注意事项及说明
4. 6mL2mL 101min
5. 60701012
(1) Cu2SO4 2 NaOH = 2 Cu(OH)2 Na2SO4
(2) Cu(OH)2KNaC4H4O6 = KNaC4H2O6Cu 2H2O
(3) C6H12O66KNaC4H2O6Cu6H2O = C6H12O76KNaC4H4O63Cu2O H2CO3
1mol6mol Cu2Cu+()
1. & 2. && 3.
4. 10.6 5. &
6.& 2& &7.& 100mL250mL1000mL1&&&&&
8. &5.0mL4 &9.& 25mL100mL1&& 10. 250mL4
11.& 800W1&&& 12. && &13.& 1&&&&
14. & &15. & 16. 0.0001g
210g5200mL,100150mL4545min250mL5mL5mL30min1520mL
5mL150mL10mL39mL2min3021310mL
&&& F = CVS
5.00mL150mL10mL32min3021
5.00mL150mL31mL2min30213
2.(Cu2+)Cu2+Cu2+
3. Cu2+Cu2+Cu2+&
8. ( 1mg/mL)10mL1mL1mL1min
9. 800w2 min0.1mL
1. 356.5g& 351000mL2mol/L325mL45g1000mL
2.& 25mL9&& 3.& 1 mL7&&& 4.& 2 mL1
5.& &&&&&&& 6.& 1000 mL1& 7.& 100 mL2
8.& 100mL1&&& &9. &0.0001g10.&
0 1 2 3 4 56 7mgmL1mL1mL(34mg)25mL352mL5min25mL540nm
1. 192219793510g1000mL2mol/L NaOH200mL300g1000mL
&, o:p&, &
2. 0.10.1g70100mL
4. 0.11051.0526g100mL(11)5mL687015min230NaOH1000mL1mg
2.50mL100mL5mL(11)687015min230% NaOH
1.&& && 2.&& 85
3. 0.50.5g100m1()
4. 3.6g20mL1.3g, 100mL
25g(0.5g)50mL5100mL 8550 mL250 mL
15min6020mL55601 h116020 mL 250 mL
50 mL250mL5 mL (11)1 h220100 mL 100 mL
1. & 2. 85&&& 3. ( 11)&&& 4. 40
5. 10&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2&& 7. pH
8. 20&& 9. 10&
25g (0.5g)4030 mL 150 mL 85100mL250 mL
1:1510g(0.5g)250 mL 30 mL 30 mL 150 mL 85100 mL 250 mL
250 mL 30 mL ( 11)2h40(11)10pHpH720 mL 201020 mL 10500 mL
100mL30 mL(11)250 mL
1. 0.1M AgNO3&&&&&&&&&&&& 2.& NaCl&&&&&&& 3.& 5% K2CrO4&
4. && 5.& &&& 6.& &&&&&& 7.&
四、测定方法
2.00 mL100 mL
15.00 mL250 mL80 mL5%1 mL0.1M AgNO3AgNO3V1
80 mL5%1 mL0.1M AgNO3AgNO3V0
4.0.1M AgNO3
981020.5850g100 mL100 mL23
20.00 mL250 mL80 mL5%1 mL0.1M AgNO3AgNO3V2
520g250 mL80150 mL909830 min100250 mL
20%1520 mL10%10~20 mL909830 min100250 mL
1520 mL25.0 mL250 mL1%340.1M5%1 mL, 0.1M AgNO3
五、结果计算
1. 0.1M AgNO3
C――硝酸银溶液的准确浓度；
C――硝酸银溶液的准确浓度；
&&&&& V1mL
&&&&& V0mL
六、注意事项
1.在酸性溶液中滴定，由于生成的铬酸银会溶解在酸中而使AgNO3耗量增大，结果偏高；而在碱性溶液中滴定，银离子将形成Ag2O沉淀，同样使AgNO3的耗量加大，结果偏高。因此样液的pH值应调节到7～10之间，如有铵盐存在，则pH值应调节到6.5～7.2之间。
2.蛋白质能吸附银的化合物而影响结果，因此高蛋白的样品溶液应除去蛋白质再进行氯化钠的测定。
3.由于滴定时生产的氯化银沉淀容易吸附溶液中的氯离子，使溶液中的氯离子浓度降低，终点提前到达，故滴定时必须剧烈摇动，使被吸附的氯离子释放出来以减少误差。
4.不能在含有氨或其他能与银离子生成配合物的物质存在下进行滴定，以免AgCl和Ag2CrO4的溶解度增大而影响测定结果。
七、思考题
1.若样品色泽过深，终点不易辨认，应采取什么措施使测定得以进行？
亚硝酸盐作为一种发色剂，在肉制品加工中应用较多，但是过多地使用对人体产生毒害作用。亚硝酸盐与仲胺反应生成具有致病作用的亚硝胺。过多地摄入亚硝酸盐会引起正常血红蛋白(二价铁)转变成正铁血红蛋白(三价铁)而失去携氧功能，导致组织缺氧。以亚硝酸钠计ADI 0～0.2 mg/kg，以硝酸钠计ADI 0～0.5 mg/kg。我国卫生标准规定：亚硝酸钠的使用限于肉类制品及肉类罐头中，亚硝酸钠最大使用量为0.15 g/kg, 残留量以亚硝酸钠计，肉类罐头不超过0.05 g/kg，肉制品不超过0.03 g/kg。
样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长为538 nm，可测定吸光度并与标准比较定量。
&&& 1. 亚铁氰化钾溶液：称取106.0 g亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6?3H20］溶于水，并定容至1 000 mL。
&&& 2. 乙酸锌溶液：称取220.0 g乙酸锌［Zn(CH3COO)2?2H20］加30 mL 冰乙酸，溶于水并定容至1 000 mL。
&&& 3. 饱和硼砂溶液；称取5.0 g硼酸钠(NaB4O7?10H20)溶于100 mL 热水中，冷却备用。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".4%对氨基苯磺酸溶液：称取0.4 g对氨基苯磺酸溶于100 mL 20%盐酸中，置棕色瓶中，避光保存。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2%盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2 g盐酸萘乙二胺，以水定容100 mL，避光保存。
&&& 6. 氢氧化铝乳液：溶解125.0 g硫酸铝［Al2(S04)3?18H20］于1 000 mL重蒸馏水中，使氢氧化铝全部沉淀(溶液呈微碱性)，用蒸馏水反复洗涤，真空抽滤，直至洗液分别用氯化钡、硝酸银检验不发生混浊为止。取下沉淀物，加适量重蒸馏水使呈稀浆糊状，捣匀备用。
&&& 7. 果蔬提取剂：50.0 g氯化镉与50.0 g氯化钡溶于l000 mL重蒸馏水中，用浓盐酸(2 mL左右)调整到pH为l。
&&& 8. 亚硝酸钠标准溶液：精密称取0.100 0 g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠( G.R.)，加水溶解移入500 mL容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于200μg亚硝酸钠。
9. 亚硝酸钠标准使用液：吸取标准液5.00 mL于200 mL容量瓶中，用重蒸馏水定容。此溶液含5.0μg/mL亚硝酸钠，临用时配制。
仪器： 小型绞肉机，组织捣碎机&& 分光光度计& &50 mL比色管或容量瓶10个
& 50mL烧杯2个&& 100mL、500mL的容量瓶各1个&&& 5mL移液管2支&&&&&&&&&& &1mL、2mL、20mL移液管各1支&&& 25mL、100mL量筒各1个
漏斗、滤纸及过滤装置&&& 温度计 1支&& 分析天平（精确到0.0001g）
四、测定方法
&&& 1.试样中硝酸盐和亚硝酸盐的提取
&&& ①肉类制品(红烧类除外)；称取经搅碎混合均匀的试样5.0 g于50 mL烧杯中，加硼砂饱和溶液12.5 mL，搅拌均匀，以70℃左右重蒸馏水约300 mL将其洗入500 mL的容量瓶中，置沸水浴中加热15 min，取出，一边转动，一边加入5 mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL乙酸锌溶液以沉淀蛋白质。定容，混匀，静置0.5 h，除去上层脂肪，过滤，弃去初滤液30 mL，收集滤液备用。
②红烧类肉制品：前面部分同肉类制品。取其滤液60 mL于100 mL容量瓶中，加氢氧化铝乳液至刻度，过滤，滤液应无色透明。
&&& ③果蔬类：称取适量样品用组织捣碎机捣碎，取适量匀浆于500 mL容量瓶中，加200 mL水，加入果蔬提取剂100 mL(如滤液有白色悬浮物，可以适当减少加入量)，振摇1 h。加2.5 mol/L氢氧化钠溶液40 mL，用重蒸馏水定容后立即过滤。然后取60 mL滤液于100 mL容量瓶中，加氢氧化铝乳液至刻度。用滤纸过滤，滤液应无色透明。
&&& 2.标准曲线绘制
&&& 吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亚硝酸钠标准使用液(相当于0，1，2，3，4，5，7.5，10，12.5μg亚硝酸钠)，分别置50 mL带塞比色管中。各加入0. 4%对氨基苯磺酸2 mL，混匀，静置3 min～5 min后各加入1.0 mL0.2%盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度、混匀，静置15 min，用2 cm 比色杯，以零管调节零点，于波长538 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
&&& 3.样品测定
&&& 吸取40.0 mL样品提取液于50 mL比色管中，按绘制标准曲线同样方法操作，于波长538 nm处测吸光度，从标准曲线上查出测定用样液中亚硝酸钠的含量(μg/mL)。
五、结果计算
& 肉制品中亚硝酸盐含量(g/kg)＝
& 红烧类和果蔬类中亚硝酸盐含量(g/kg)
&&&&&&&&&&&&&&&& ＝
式中：c ―― 测定用样液中亚硝酸盐含量，μg/mL；
&&& &&m ―― 样品质量，g。
1. 亚铁氰化钾和乙酸锌溶液在此作为蛋白质沉淀剂，使产生的亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀。也可采用硫酸锌(30%)溶液作为蛋白质沉淀剂。
&&& 2. 饱和硼砂溶液有两个作用：一是亚硝酸盐提取，二是蛋白质沉淀剂。
3. 本实验用水应为重蒸馏水，以减少误差。
七、思考题
1. 显色时应先加入对氨基苯磺酸溶液，后加入盐酸萘乙二胺溶液，两者的秩序能否颠倒？
我国国家标准规定：残留量以SO2计：竹笋、蘑菇残留量不得超过25 mg/kg；饼干、食糖、罐头不得超过50 mg/kg；赤砂糖及其他不得超过100 mg/kg。
亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色物质，其色泽深浅与亚硫酸含量成正比，可比色测定。
三、仪器试剂及玻皿配置
1.四氯汞钠吸收液：称取13.6 g氯化高汞及6.0 g氯化钠溶于水中并稀释至1 000 mL。放置过夜，过滤备用。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".1%盐酸副玫瑰苯胺溶液：称取0.1 g盐酸副玫瑰苯胺(C19H18N2Cl?4H2O)于研钵中，加少量水研磨使溶解并稀释至100 mL。取出20 mL，移入l00 mL容量瓶中，加入盐酸(1＋1)，充分摇匀后使溶液由红变黄，如不变黄再滴加少量盐酸至出现黄色，再加水至刻度，混匀备用(如无盐酸副玫瑰苯胺可用盐酸品红代替)。
&&& 盐酸副玫瑰苯胺的精制方法：称取20 g盐酸副玫瑰苯胺于400 mL水中，用50 mL盐酸(1＋5)酸化，徐徐搅拌，加4 g～5 g活性炭，加热煮沸2 min。将混合物倒入大漏斗中，过滤(用保温漏斗趁热过滤)。滤液放置过夜，出现结晶，然后再用布氏漏斗抽滤，将结晶再悬浮于1 000 mL乙醚-乙醇(10＋1)的混合液中，振摇3 min～5 min。再用乙醚反复洗涤至醚层不带色为止。于硫酸干燥器中干燥，研细后贮存于棕色瓶中。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2%氨基磺酸铵溶液：称取1.2 g氨基磺酸胺于50 mL烧杯中，用水转入100 mL容量瓶中，定容。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".2%甲醛溶液：吸取0.55 mL无聚合沉淀的甲醛(36%)，加水定容至100 mL，混匀。
&&& 5.亚铁氰化钾溶液：参见比色法则亚硝酸盐试剂①。
&&& 6.乙酸锌溶液：参见比色法测亚硝酸盐试剂②。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".05 mol/L碘溶液：称取12.7g碘用水定容至1 000 mL，混匀。
&&& 8.0.100 0 mol/L硫代硫酸钠标准溶液。
&&& 9.二氧化硫标准溶液：
&&& ①配制：称取0.5 g亚硫酸氢钠，溶于200 mL四氯汞钠吸收液中，放置过夜，上清液用定量滤纸过滤，备用。
&&& ②标定：吸取l0.0 mL亚硫酸钠-四氯汞钠溶液于250 mL碘量瓶中，加水100 mL，准确加入20.00 mL 0.05 mol/L碘溶液，5 mL冰乙酸，摇匀，放置于暗处,2 min后迅速以0.1000 mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡黄色，加0.5 mL淀粉指示剂，继续滴至无色。量取100 mL水，准确加入20.0 mL 0.05 mol/L碘溶液，5 mL冰乙酸，按同一方法作空白试验。&&&&&&
计算：SO2标准溶液浓度(mg/mL)＝
式中：V1 ― 测定用亚硫酸氢钠-四氯汞钠溶液消耗硫代硫酸钠溶液体积，mL；
V2 ― 空白消耗硫代硫酸钠标准溶液体积，mL；
C ― 硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度，mol/L；
64.06 ― 二氧化硫的摩尔质量，g/mol。
&&& 10.二氧化硫标准使用液：取二氧化硫标准液，用四氯汞钠吸收液稀释成2μg/mL二氧化硫的溶液，临用时配制。
&&& 11.淀粉指示剂：称取1 g可溶性淀粉，用少许水调成糊状，缓缓倾入100 mL沸水中，随加随搅拌，煮沸，放冷备用(此溶液临用时现配)。
12．0.5 mol/L氢氧化钠溶液。&&&& 13. 硫酸（1＋71）。
仪器： 50mL烧杯2个&&&& 100mL、500mL、1000 mL的容量瓶各1个&&& 1mL移液管4支&&&&& 2mL、5mL、20mL移液管各1支& 25mL、100mL量筒各1个&&&&
25mL带塞比色管9个&&&& 250 mL碘量瓶&&&&& 分析天平（精确到0.0001g）
四、测定步骤
&&& 1.样品处理
&&& ①水溶性固体样品：称取约10.00 g均匀试样(试样量可视SO2含量高低而定)，以少量水溶解，移于100 mL容量瓶中，加入0.5 mol/L氢氧化钠4 mL，5 min后加入4 mL硫酸（1＋71），然后再加入四氯汞钠吸收液20 mL，用水定容。
&&& ②淀粉类样品：称取5.0 g～10.0 g研磨均匀的样品，以少量水湿润并转入l00 mL容量瓶中，然后加入四氯汞钠吸收液20 mL，浸泡4 h以上，若上层液不澄清，要加入亚铁氰化钾及乙酸锌溶液各2.5 mL，然后用水定容，过滤备用。
&&& ③液体样品：直接吸取样液5.0 mL～10.0 mL，移入100 mL容量瓶中，加入四氯汞钠吸收液20 mL，用水定容，摇匀，必要时过滤，备用。
&&& 2.测定&&&&& ①标准曲线绘制：吸取二氧化硫标准使用液：0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00 mL(相当于0、0.4、0.8.1.2、1.6、2.0、3.0、4.0μg二氧化硫)，分别置于25 mL带塞比色管中，加入四氯汞钠吸收液使体积达10 mL，然后各加入l mL 1.2%氨基磺酸铵，1 mL 0.2%甲醛溶液及1 mL 0.1%盐酸副玫瑰苯胺溶液，摇匀，静置20 min，用1 cm比色杯，以零管调零，于波长550 nm处测吸光度，绘制标准曲线。
&&& ②样品测定：吸取样品处理液0.50mL～5.0 mL(视含量而定)置于25 mL带塞比色管中，以下按标准曲线绘制操作步骤进行，从标准曲线上查得样品处理液中二氧化硫的含量。
&& 二氧化硫(g/kg)＝
& 式中： c ―― 样品处理液中二氧化硫含量，μg；
m ―― 样品质量，g；
&&&&& &&&V ―― 测定用样液体积，mL；
&&&&&&&& 100 ―― 样品液体积，mL。
&&& 1.颜色较深样品，需用活性炭脱色。
&&& 2.样品中加入四氯汞钠吸收液以后，溶液中的二氧化硫含量在24 h之内稳定，测定需在24 h内进行。
&&& 3.亚硫酸易与食品中的醛(乙醛)、酮(酮戊乙酸、丙酮酸)及糖(葡萄糖、单糖)等结合，形成结合态亚硫酸，样品处理时加入氢氧化钠是为使结合态亚硫酸释放出来。
&&& 4.亚硝酸对反应有干扰，加入氨基磺酸铵是为了分解亚硝酸，反应式为：
&&& HNO2 ＋ NH2SO3NH4 → NH4HS04 ＋ N2↑ ＋ H2O
&&& 5.盐酸副玫瑰苯胺加入盐酸调节成黄色，必须放置过夜后使用，以空白管不显色为宜，否则需重新用盐酸调节。
&&& 6.盐酸副玫瑰苯胺中盐酸用量对显色有影响，加入量多，显色浅，加入量少，显色深，对测定结果有较明显的影响，因此需严格控制。
7.显色反应的最适温度为20℃～25℃，温度低，灵敏度低，因此样品管和标准管应在相同温度条件下进行。
(NH4)2C2O4CaC2O42NH4C1
&CaC2O4H2SO4CaSO4H2C2O4
&5H2C2O42KMnO43H2SO4K2SO42MnSO410CO28H2O
仪器试剂及玻皿配置
1.& (1+4)&&&& 2.& 0.1&& 3.& (1+4)
4. 2NH4OH&&&&& 5.& (1+4) NH4OH&&&&&&& 6.& 2mol/L H2SO4
0.02mol/L KMnO4
7. (NH4)2C2O4& 8.& 250mL3&&&& 9.& 25mL
2mL5mL10mL2&& 50mL2& &3000r/min&&
&&& && (0.0001g)&& &
KMnO413030minNa2C2O4 0.150.20g,3(0.0001g)250mL40mL10mL 2molL7080KMnO430KMnO4mLV
&&& C KMnO4 =
1.(1+4)5mL5mL(1+4)25mL
2.5mL(110mg)50mL142mL(1+4)0.5mL(1+4)1 h3000r/min15min2NH4OH10mL 2NH4OH20min2mL 2mol/L70800.02mol/L30
(mg/100g) =& &&&&&&&&&&&&&&l 00
CKMnO4mol /L
&40.08,& g /mol
&200015mg20 mg
pH 29508nm
Fe2+3C12H8N2Fe(C12H8N2
& 4Fe32NH2OHHCl 4Fe24HN2OH2O2C1&&&
仪器试剂及玻皿配置
1.& 10(NH2OHHCl)&& 2.& 0.12()
3.& 10&&&&&&&&&&&&&&&&& 4.&& 1mol /L
5. 0.4979g(FeSO4 7H2O)100mL5mL100mL21000mLFe3+ 100g10mL100mLm1Fe3+ 10g
6.& 100mL1000 mL&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 7.& 50mL8
8.& 1mL2mL5mL3&&&&&&&&&&&&&&&& 9.& 100 mL 2
10.& &&&&&&&&&&&&& 11.& &&&&&&&& 12.&
13.& (0.0001g)& 14.& &&&&&& 15.&
1. 10.0g2mL(1+1)5mL100mL
10gmL() 0.0,& 0.5,& 1.0,& 2.0,& 3.0,& 4.0,& 5.0 mL50m11mol /L1mL101mL0.121mL105mL15min510nml cm
3. 510mL()50mL(g)
Fe (mg/kg) =
1. Cu2+Ni2+Co2+Zn2+Hg2+Cd2+Mn2+EDTA
&&& Cr2O726I14H2Cr3+3I27H2O
1.& 10mol /L KOH&& 2.& 0.02mol/L K2Cr2O7&& 3.& && 4.& H2SO4
5. 0.1308g1051 h1000mLmL100g, 10g/mL
6.& 50 mL100mL1000 mL&&&&&&&&&&&&& 7.& 125mL8
8.& 1mL2mL5mL3&&&&&&&&&&&&&& 9.& 25mL100 mL1
10.& &&&&&&&&&&&&& 11.& &&&&&& 12.&
13.& (0.0001g)& 14.& &&&&&& 15.&
1.23g5mL 10mol /L KOH46050010mL50mL30mL
2.10g/mL1.0,& 2.0,& 4.0,& 6.0,& 8.0,& 10.0 mL125mL40mLH2SO4 2mL0.02mol/L K2 Cr2O715mL30min10mL1min1cm510nm
3.125mL(g)
&&& (g100g) =&&&&& 100
二乙胺基二硫代甲酸钠法
&&& 样品经消化后，在碱性溶液中(pH9～11)铜离子与二乙胺基二硫代甲酸钠(DDTC-Na)生成棕黄色络合物，溶于四氯化碳，与标准系列比较定量。
三、仪器试剂及玻皿配置
&&& 1.柠檬酸铵、乙二胺四乙酸二钠溶液：称取20 g柠檬酸铵及5 g乙二铵四乙酸二钠溶于水中，加水稀释至100 mL。
&&& 2.铜试剂溶液：称取0.1 g二乙胺基二硫代甲酸钠，溶于水并稀释至100 mL，贮于冰箱中。
3.铜标准溶液：精密称取1.000 0 g金属铜(99.99%)，分次加入硝酸(4＋6)溶解，总量不超过37 mL，移入1 000 mL容量瓶中，用水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1.0 mg铜。临用时用硫酸溶液(1＋17)配制成每毫升相当于10μg铜的标准溶液。
4.& 50 mL100mL1000 mL&&&&&&&&&&&&& 5.& 125mL8
6.& 1mL2mL5mL3&&&&&&&&&&&&&&& 7.& 25mL100 mL1
8.& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 9.& (0.0001g)&
四、测定步骤
&&& 样品用硝酸-硫酸法消化或干法灰化后定容至一定体积。吸取10.0 mL消化液和同量的试剂空白液，分别置于125 mL分液漏斗中，加水稀释至20 mL。吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL铜标准溶液(相当于0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0u g铜)，分别置于125 mL分液漏斗中，各加硫酸(1＋17) 至20 mL。于上述各分液漏斗中，各加5 mL柠檬酸铵、乙二胺四乙酸二钠溶液和3滴酚红指示液，混匀，用氨水(l＋1)调至红色。各加2 mL铜试剂溶液和10.0 mL四氯化碳，剧烈振摇2 min，静置分层后，四氯化碳层经脱脂棉滤入2 cm比色杯中，以四氯化碳调节零点，于波长440 nm处测吸光度，标准各点吸光值减去零管吸光值后，绘制标准曲线。
式中： x ―― 样品中铜的含量，mg/kg或mg/L；
A1 ―― 测定用样品消化液中铜的含量，μg；
A2 ―― 测定用试剂空白消化液中铜的含量，μg；
m ―― 样品质量(体积), g（ mL）；
V1 ―― 样品消化液的总体积，mL；&
V2 ―― 测定用样品消化液的体积，mL。
&&& 1.二乙胺基二硫代甲酸钠(NaDDTC)可与多种金属离子起络合反应，其金属螯合物一般都不溶于水，易溶于有机溶剂。NaDDTC为白色晶体，在酸性溶液中易缓慢分解，生成乙二胺及二硫化碳；而在碱性溶液中则相当稳定。
&&& 2.一般含量不高的铅、锌、铁、锡、汞(Ⅱ)等金属离子对铜的测定无干扰。但若铁含量超过铜含量50倍时，铁络合物的棕色可掩盖铜络合物的颜色，镍、钴、锰等有干扰。这些干扰离子均可用柠檬酸铵、乙二胺四乙酸二钠络合剂掩蔽。
3.本法应用很普遍，也是国标法。测定的适宜范围为4μg～20μg。
七、思考题
1. 二乙胺基二硫代甲酸钠（铜试剂）法测定食品中铜含量时，如何消除共存的铁、铝、钙、镍、钴等金属的干扰？
砷的化合物具有强烈的毒性，三价砷的毒性大于五价砷，无机砷大于有机砷，食品中的砷主要来自原料。砷常用于制造农药、染料和药物，是水产品和其他食品砷污染的重要来源。砷中毒可引起多种病变，严重时甚至导致死亡。食品卫生标准中对砷的规定（以总As计）为：蔬菜、水果、肉、蛋、淡水鱼、发酵酒Q0.5mg/kg；牛乳、乳制品（按牛乳折算）Q0.2mg/kg。
&&& 样品经消化后，以碘化钾、氯化亚锡将高价砷还原为三价砷，然后与锌粒和酸产生的新生态氢生成砷化氢，再与溴化汞试纸生成黄色至橙色的色斑，与标准砷斑比较定量。
AsH3十3HgBr2 → As(HgBr)3十3HBr
2As(HgBr)3十AsH3 → 3AsH(HgBr)2
As(HgBr)3十AsH3 → 3HBr十As2Hg3
三、主要试剂、仪器及玻皿配置
&&& 1.5%溴化汞乙醇溶液和溴化汞试纸：称取5 g溴化汞溶于l00 mL 95%乙醇中。将剪成直径2 cm 的圆形滤纸片于已配好的上述溶液中浸渍1h以上，保存在冰箱中，临用前取出置暗处晾干备用。
&& &2.15%碘化钾溶液：贮存在棕色瓶中。
&&& 3.酸性氯化亚锡溶液：称取40 g氯化亚锡(ＳnＣl２?２Ｈ２Ｏ),加盐酸溶解并稀释至100 mL，加入数粒金属锡粒。
&&& 4.10%乙酸铅溶液和乙酸铅棉花：用10%乙酸铅溶液浸透脱脂棉花，压除多余溶液，并使疏松，在100℃以下温度干燥后贮于玻璃瓶中。
5.砷标准溶液：精密称取0.132 0 g在硫酸干燥器中干燥过的或在100℃干燥2h的三氧化二砷，加5 mL20%氢氧化钠溶液，溶解后加25 mL硫酸(6＋94)，移入1 000 mL容量瓶中，加新煮沸冷却的水稀释至刻度，贮于棕色瓶中，此溶液每毫升相当于0.10 mg砷。使用时吸取此溶液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加1 mL硫酸(6＋94)，加水至刻度，此溶液每毫升相当于1.0μg砷。
6. 50 mL100mL1000 mL&&&&&&&&&&& 7. 1mL2mL5mL3
8.& 25mL100 mL1&&&&&&&&&&&&&&&& 9. 7
10.& (0.0001g)&&&&&&&&&&&&&&&& 11.
四、测定步骤
样品用硫酸-高氯酸-硝酸法消化或硝酸-硫酸法消化，消化液加适量水煮沸，除尽残余的硝酸后定容至50 mL或100 mL，控制定容后的溶液每10 mL相当于1 g样品，相当加入硫酸量1 mL。样品也可用灰化法处理，加氧化镁和硝酸镁助灰化，残渣用盐酸(1＋1)溶解后定容，控制定容后的溶液每l0 mL相当于1 g样品，相当于加入盐酸量1.5 mL(中和需要量除外)。
吸取一定量的样品消化后定容的溶液及同量的试剂空白液分别置于测砷瓶中，加5 mL15%碘化钾溶液，5滴酸性氯化亚锡溶液及5 mL盐酸(样品如用湿法消化，则要减去样品中硫酸毫升数；如用灰化法消化液，则要减去样品中盐酸毫升数)，再加适量水至35 mL。
&&& 吸取0.0，0.5，2.0 mL砷标准溶液(相当0，0.5，2.0μg砷)，分别置于测砷瓶中，各加5 mL15%碘化钾溶液，5滴酸性氯化亚锡溶液及15 mL盐酸，各加水至35 mL。
于以上各测砷瓶中各加3 g锌粒，立即塞上预先装有乙酸铅棉花及溴化汞试纸的测砷管，于25℃放置1 h，取出溴化汞试纸，将样品及试剂空白与标准砷斑比较。
五、计算&&
式中：x ―― 样品中砷的含量，mg/kg或mg/L；
A1 ―― 测定用样品消化液中砷含量，μg；
A2 ―― 试剂空白液中砷含量，μg；
m ―― 样品质量(体积)，g( mL)；
V1 ―― 样品消化液的总体积，mL；
V2 ―― 测定用样品消化液的体积，mL。
&&& 1.H2S对本法有干扰，遇溴化汞试纸亦会产生色斑。乙酸铅棉花应松紧合适，能顺利透过气体又能除尽H2S。
&&& 2.锑、磷等都能使溴化汞试纸显色，鉴别方法是采用氨蒸薰黄色斑，如果先变黑再褪去为砷，不变时为磷，变黑时为锑。
3.同一批测定用的溴化汞试纸的纸质必须一致，否则因疏密不同而影响色斑深度。制作时应避免手接触到纸，晾干后贮于棕色试剂瓶内。
七、思考题
1. 测砷时，在测砷管中塞入乙酸铅棉花有什么作用？
2. 测砷时，滴加氯化亚锡的目的是什么？
在pH约1. 5溶液中，2，3－二氨基萘选择性地与四价硒离子反应，生成4，5-苯并吡硒脑绿色荧光物质，用环已烷萃取。在激发光波长为376nm，发射光波长为520nm条件下测定荧光强度，从而计算出试样中硒的含量。反应式如下：
三、主要仪器和试剂及玻皿配置
荧光分光光度计，回流消化装置
1.5%EDTA?2Na溶液。
2. l0%盐酸羟胺溶液。
&&& <st1:chsdate w:st="on" IsROCDate="False" IsLunarDate="False" Day="30" Month="12" Year=".1%2，3-二氨基萘溶液：称取0.1 g 2，3-二氨基萘［C10H8(NH2)3，简称DAN］溶于100 mL 0.1 mol/L盐酸中，移入250 mL分液漏斗内，振摇10 min，使完全溶解，加入约20 mL环已烷，萃取振摇5 min，弃去环己烷层，再重复萃取2～3次。将下层溶液用玻璃棉过滤，收集于棕色瓶中，加入一层环已烷(约0.5 cm )，贮于冰箱中备用。
&&& 4. 硒标准溶液：精确称取0.100 0 g硒，置于50 mL小烧杯中，加入10 mL盐酸(1＋1)，加热溶解，冷却并移至100 mL容量瓶中，用10%硝酸溶液洗小烧杯并合并洗液于容量瓶中，然后用10%硝酸稀释至刻度，此溶液每毫升含1 mg硒。使用时用0.1 mol/L盐酸稀释成每毫升含lμg硒。
5. 混合消化液：发烟硝酸-高氯酸-硝酸(10＋4＋5)。
6.& 50 mL100mL1000 mL&&&&&&&&&&&&& 7.& 150mL锥形瓶8
8.& 1mL2mL5mL10mL&&&&&&&&&&&& 9.& 25mL100 mL
10.& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 11.& (0.0001g)
12.& 烧瓶&&&&&&&&&& 13.& 50mL小烧杯&&&&&& 14.& 分液漏斗8个
15. 恒温水浴锅&&&&&&&&& 16.精密pH试纸
四、测定步骤
&&& 称取适量样品于圆底烧瓶中，加入20 mL混合消化液回流煮沸消化至无色透明，冷却后加入2 mL5%EDTA?2Na溶液，作为样品测定液。同时作试剂空白。
&&& 吸取硒标准溶液0.0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL(相当于0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25μg硒)分别置于150 mL锥形瓶中，加入10 mL混合消化液，按样品处理过程消化，冷却，加入20 mL水，EDTA?2Na溶液2 mL。将消化后的样品溶液，试剂空白液和硒标准溶液分别用氨水(1＋1)调节至pH1.5，各加10%盐酸羟胺溶液1 mL，放置2 min，再各加入2，3-二氨基萘溶液3 mL，于50℃水浴上保温30 min，冷却。分别移入分液漏斗中，用10 mL环己烷萃取，振摇2 min，分层后弃去水相，环己烷层通过无水硫酸钠过滤于小试管中，在激发光波长376 nm，发射光波长520 nm处测荧光强度，绘制标准曲线。
式中： x ―― 样品中含硒量，mg/kg或mg/L；
A1 ―― 测定用样品消化液中硒的含量，μg；
A2 ―― 试剂空白液中硒的含量，μg；
m ―― 样品质量，g。
&&& 1.本测定中所用的环己烷不得有荧光物质，不纯时可重蒸后使用。
&&& 2.消化不同类样品，使用的混合酸不同，一般都不用硫酸，因市售硫酸中硒含量很高，否则必须用氢溴酸除硒。
2.本法最低检测量为0.005μg硒。
黄曲霉毒素(Aflatoxins，简写AFT)是黄曲霉、寄生曲霉及温特曲霉等产毒菌株的代谢产物(后者产量较少)，是一群结构类似的化合物。目前已发现17种黄曲霉毒素，根据其在波长为365 nm紫外光下呈现不同颜色的荧光而分为B、G二大类，其中B大类在氧化铝薄层板上于紫外光照射下呈现蓝色荧光；而 G大类则呈绿色荧光(高纯的 G类中也有个别例外而呈蓝色荧光)。B大类中有AFT B1、B2、B3、M1、M2、B2a、H1、Q1、P1、2-甲氧基B2、2、3-环氧B1、3-甲氧基B2、2-乙基B2等。 G大类中有AFT G1、G2、G2a、GM1、2-乙基 G2等。
&&& AFT属剧毒物质，其毒性比氰化钾还高，也是目前最强的化学致癌物质。其中AFT B1的毒性和致癌性最强，故其在食品中允许量各国都有严格规定。FAO/WHO规定食品中AFT B1＜15ppb，美国Q20ppb，日本Q10ppb，以色列与瑞典规定不得检出。我国规定玉米、花生中AFT B1＜20ppb。
在AFT中，由于AFT B1毒性大、含量多，且在一般情况下如未检查出AFT B1，就不存在AFTB2、Gl等，故食品中污染的AFT含量常以AFT B1为主要指标。
&&& 样品中AFT B1经有机溶剂提取、净化、浓缩并经薄层色谱分离后，在波长365 nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量来测定AFT B1含量。
三、特点及适用范围
&&& 本法采用单向展开分离，以目测比较样品与标准的AFT B1斑点荧光强度来定量，灵敏度可达1 PPb～5 PPb，回收率在75%以上，适用于各类食品中AFT B1的测定。
四、主要仪器
1.小型粉碎机。2.电动振荡器。& 3.分样筛。 4.全玻璃浓缩器。
5.玻璃板：5 cm×20 cm。 6.薄层板涂布器。
7.色谱展开槽：内长25 cm，宽6 cm，高4 cm。
8.紫外光灯：100 w～125 w，带有波长365 nm滤光片。
9.微量注射器或血色素吸管。
&&& 下面有机溶剂1～7必要时应重蒸，并应经检验对薄层色谱测定无干扰。
&&& 1.三氯甲烷(A.R.)。
2.正己烷(A.R.沸程30℃～60℃)或石油醚(沸程60℃～90℃)。
&&& 3.甲醇(A.R.)。 4.苯(A.R.)。 5.乙腈(A.R.)。
6.无水乙醚(A.R.)或乙醚，经无水硫酸钠脱水。
7.丙酮(A.R.)。
8.苯-乙腈(98＋2)混合溶液；量取98 mL苯，加2 mL乙腈,混匀。
9.甲醇-水（55＋45）溶液：量取55 mL甲醇，加45 mL蒸馏水，混匀。
10.三氟乙酸(A.R.)。11.氯化钠(A.R.)。 12.无水硫酸钠(A.R.)。
13.硅胶 G：薄层色谱用。
&&& 14.5%次氯酸钠溶液：称取l 00 g漂白精，加入500 mL水，搅匀。另将80 g工业用碳酸钠(Na2CO3?10H2O)溶于500 mL温水中，倒入上述溶液中，搅匀，澄清、过滤后贮存于带橡皮塞的玻璃瓶中，作为AFT消毒剂。
15.黄曲霉毒素B1标准贮备液：用百万分之一的微量分析天平精密称取1 mg～1.2 mgAFT B1标准品，先加入2 mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100 mL，避光置于4℃冰箱中保存。先用紫外分光光度计测定配制的AFT B1标准贮备液浓度，再用苯－乙腈混合液调整其浓度为10μg/mL。在350 nm，AFT B1在苯-乙腈溶液(98＋2)中的摩尔消光系数为19800。
&&& 16.黄曲霉毒索B1标准应用液I(1μg/mL)：精密吸取1.0 mL 10μg/mLAFT B1标准溶液于10 mL容量瓶中，加苯-乙睛混合液至刻
度，混匀。此液含AFT B1为1μg/mL。
&&& 17.黄曲霉毒素B1标准应用液Ⅱ(0.2μg/mL)：精密吸取1.0 mL 1μg/mLAFT B1标准应用液I于5 mL容量瓶中，加苯－乙睛混合液至刻度，摇匀。此液含AFT B1为0.2μg/mL。
&&& 18.黄曲霉毒素B1标准应用液Ⅲ(0.04μg/mL)：精密吸取1.0 mL 0.2μg/mLAFT B1标准应用液Ⅱ于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，摇匀。此液含AFT B1为0.04μg/mL
六、操作方法
1.样品预处理(提取、净化与浓缩)
&&& ①玉米、大米、麦类、面粉、薯干、豆类、花生、花生酱等
&&& Ⅰ法：称取20.00 g粉碎过筛样品(面粉、花生酱不需粉碎)，置于250 mL具塞锥形瓶中，加30 mL正已烷或石油醚和100 mL甲醇-水(55＋45)溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。振荡30 min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，等下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶中，取20.00 mL甲醇水溶液提取液(相当于4 g样品)置于另一个125 mL分液漏斗中,加20 mLCHCl3，振摇2 min，静置分层(如出现乳化，则可滴加甲醇促使分层)，放出CHCl3层，经盛有约l0 g预先用CHCl3湿润的无水硫酸钠的慢速定量滤纸过滤于50 mL蒸发皿中，分液漏斗中再加5 mL CHCl3重复振摇提取，CHCl3层一并滤于蒸发皿中，最后用少量CHCl3洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。在通风柜中，将蒸发皿于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2 min～3 min后，准确加入1 mL苯-乙腈混合液，用带橡皮头滴管的管尖将残渣充分混合，若有苯的结晶析出，将蒸发皿从冰盒上取下，继续溶解、混合，晶体即消失，再用此滴管吸取上清液转移于2 mL具塞试管中。
&& &Ⅱ法(限于玉米、大米、小麦及其制品)：称取20.00 g粉碎过筛样品于250 mL具塞锥形瓶中，加6 mL水使样品湿润，准确加入60 mL CHCl3，振摇30 min，加l2 g无水硫酸钠，振摇后，静置30 min，用叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于100 mL具塞锥形瓶中，取12 mL滤液(相当于4 g样品)于蒸发皿中，在通风柜内于65℃水浴上通风挥干，准确加入1 mL苯-乙腈混合液，以下自“用带橡皮头滴管的管尖……”起同甲法操作。
&&& ②花生油、香油、菜油等：称取4.00 g混匀的样品于小烧杯中，用20 mL正己烷或石油醚，将其转移至125 mL分液漏斗中，用20 mL甲醇-水溶液分数次洗烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇2 min，静置分层后，将下层甲醇－水溶液移入第二个分液漏斗中，再用5 mL甲醇-水溶液重复振摇提取一次，提取液一并转移入第二个分液漏斗中，在第二个分液漏斗中加入20 mL CHCl3，以下自“振摇2 min，静置分层……”起同①中甲法操作。
&&& ③酱油、醋：称取l 0.00 g样品于小烧杯中，为防止提取时乳化，加0.4 gNaCl，移入分液漏斗中，烧杯用15 mLCHCl3分次洗涤，洗液并入分液漏斗中。以下自“振摇2 min，静置分层……”起同①中甲法操作。最后加入2.5 mL苯-乙腈混合溶液，此溶液每 mL相当于4 g样品。
&&& 或称取10.00 g样品，置于分液漏斗中，再加12 mL甲醇(以酱油体积代替水，故甲醇与水的体积比仍约为55＋45)，用20 CHCl3提取，以下自“振摇2 min，静置分层……”起同①中甲法操作。最后加入2.5 mL苯-乙腈混合溶液，此溶液每 mL相当于4 g样品。
&&& ④干酱类(包括豆豉、腐乳制品等)：称取20.00 g 研磨均匀的试样，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL正己烷或石油醚与50 mL甲醇水溶液。振摇30 min，静置片刻，以叠成折叠式快速定性滤纸过滤，滤液静置分层后，取24 mL甲醇水层(相当于样品8 g,其中包括8 g干酱类样品本身约含有4 mL水的体积在内)置于分液漏斗中，加入20 mL CHCl3，以下自“振摇2 min，静置分层……”起同①中甲法操作。最后加入2 mL苯-乙腈混合液。此溶液每毫升相当于4 g试样。
⑤发酵酒类；提取方法同③(酱油、醋)，但不加氯化钠。
2.样品测定(单向展开法)
&&& ①薄层板的制备：称取约3 g硅胶 G，加相当于硅胶量2～3倍左右的水，用力研磨l min～2 min，至成糊状后，立即倒入涂布器内，推铺成5 cm×20 cm、厚度约0.25 mm的薄层板三块。于空气中干燥约15 min后，在100℃下活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2天～3天，若放置时间较长，可再干燥活化后使用。
&&& ②点样：将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板底端3 cm的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块薄板可点4个样点，点距边缘和点间距约为1 cm，样点直径约3 mm，要求同一块板上样点大小相同，点样时可用电吹风冷风边吹边点。四个样点如下：
第一点：10μL 0.04μg/mL AFT Bl标液
第二条：20μL样液
第三点：20μL样液＋10μL 0.04μg/mL AFT Bl标液
第四点：20μL样液＋10μL 0.2μg/mL AFT Bl标液
③展开与观察：在展开槽内加10 mL无水乙醚，预展12 cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10 mL丙酮－三氯甲烷(8＋92)溶剂,展开10 cm～12 cm，取出在紫外灯下观察结果，方法如下：a.第一点滴加了10μL AFT Bl标液(0.04μg/mL)，其中含AFT Bl0.000 4μg，作为最低检出量，同时可检验薄层板好坏及色谱条件是否合适，若展开后此点无荧光，则可能是薄层板未制好或色谱条件有问题。b.由于在第三点和第四点的样液点上滴加了AFT Bl标准液，可使样点中AFT Bl荧光点重叠。其中第三点主要用类检查在样液内AFT Bl最低检出量是否正常出现，若第, 一点有荧光点，第三点无荧, 光点则表示样液中可能有荧光卒灭剂，此时应改进样品提取等方法。第四点中AFT Bl为0.002μg，主要起定位作用，在上述色谱条件下，AFT Bl之Rf值约在0.6左右。c.若第二点(样点)在与AFT Bl标准点相应位置(Rf≈0.6)无蓝紫色光点，而其他点均有荧光点，则表示样品中AFT Bl含量在5ppb以下，若第二点在其相应位置有蓝紫色荧光点，则需进行确证实验。
④确证实验：为了证实薄层板上样液荧光确系由AFT Bl所产生，于样点上滴加三氟乙酸(TFA)，使其与AFT Bl反应，产生AFT Bl的衍生物AFT B2a，展开后，AFT B2a的Rf值约在0.1左右。方法是：于薄层板左边依次点二个样：
&&& 第一点：10μL 0.04μg/mL AFT Bl标液
&&& 第二条：20μL样液
于以上两点各加一小滴TFA盖于其上，反应5 min后，用电吹风吹热风2 min，使热风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板右边滴加以下二个点：
第三点： 10μL 0.04μg/mL AFT Bl标液
&&& 第四点：20μL样液
&&& 同③展开后，于紫外光下观察样液是否产生与AFT Bl标准点相同的衍生物(Rf＝0.l左右)。未加TFA的第三、第四两点，可分别作为样液与标准的衍生物空白对照。
&&& ⑤稀释定量：样液中(4 g样品/mL，点样20μL) AFT Bl荧光点的荧光强度如与AFT Bl标准点的最低检出量(0.000 4μg)的荧光强度一致，则样品中AFT Bl含量即为5ppb；如样液中荧光强度比最低检出量强，则根据其强度估计减少点样μL数或将样液稀释后再点不同μL数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止，点样形式如下：
&&& 第一点：10μL 0.04μg/mLAFT Bl标准液
&&& 第二点：根据情况点10μL样液
&&& 第三点：根据情况点15μL样液
&&& 第四点：根据情况点20μL样液
&&&&&&& &&&&&x=0.0004× ×1 000
式中：x ―― 样品中AFT Bl的含量，μg /kg或ppb；
V1 ―― 稀释前样液的总体积，mL；
V2 ―― 出现最低荧光时滴加样液的体积，mL；
D ―― 样液的稀释倍数；
m ―― 稀释前样液总量相当的样品质量g；
&&&&& 0.0004 ―― AFT Bl最低检出量，μg。
&&& 1.本法是测定AFT Bl的国家标准方法，其最低检出量0.000 4μg是各实验室所公认的。
&&& 2.由于食品中AFT分布很不均匀，特别是颗粒样品可靠的分析结果，采样时必须注意以下几点：
①根据规定检取有代表性样品。
②分析所用的样品应取大样，经粗碎并连续多次用四分法缩减至0.5 kg～1 kg然后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，混匀；花生样品全部通过10目筛，混匀；花生油和花生酱等样品不需制备，但取样时，应搅拌均匀。
&&& ③对局部发霉变质的样品检验时，应单独取样。
&&& 3. AFT Bl标准贮备液应密封于具塞试管中，于4℃冰箱中避光贮存。保存期间，若体积明显减少，应及时补充溶剂。使用前，用紫外分光光度计检测其浓度，再稀释成所需浓度的应用液。
&&& 4.薄层板制备时，用0.3%羧甲基纤维素钠代替水，可增加薄层板强度，易于点样，且对分离效果无不良影响。
&&& 5.因苯属致癌物，国际上在溶解AFT时，有用甲苯-乙腈混合液(98+2)替代苯-乙腈(98+2)混合液，经实验比较，用甲苯与用苯得到相同的结果。
&&& 6.由于AFT是一剧毒且强致癌性物质，使用时应特别小心。应按以下规定进行实验操作和实验后的清洗消毒工作。
&&& ①实验时应戴口罩；配标准溶液时戴手术手套。
&&& ②若衣服被污染，须用5%次氯酸钠溶液浸泡15 min～30 min后，再用清水洗净。
&&& ③对于剩余的AFT标液或阳性样液，应先用5%次氯酸钠处理后方可倒到指定的地方。
&&& ④实验中所用的或被污染的玻璃器皿须经5%次氯酸钠溶液浸泡5 min再清洗之。
⑤实验完毕应用5%次氯酸钠清洗消毒实验台等。
&&& ⑥万一手皮肤被污染，可用次氯酸钠溶液搓洗，再用肥皂水洗净。
附录二& 常用酸碱指示剂（以变色pH范围为序）
1.10 g ? L11 g90 mL10 mL
2.5 g ? L10.5 g5 mL100 mL
3.0.5 g100 mL
4.1 g ? L10.1 g60 mL100 mL
5.1 g ? L12 g ? L10.1 g0.2g60 mL100mL
6.0.5 g ? L10.05 g100 mL
7.1 g ? L12 g ? L10.1 g0.2g100 mLф20%
8.30 mL2 g ? L120 mL1 g ? L1
9.T 1 gT100 g5g ? L10.5 gT10 mL90 mL
10.2 g100 g1g ? L15g ? L1T
指示剂组成
1份0.1%甲基黄―乙醇溶液
1份0.1%亚甲兰―乙醇
1份0.1%溴甲酚绿―水溶液
1份0.02%甲基橙―水溶液
3份0.1%溴甲酚绿―乙醇溶液
1份0.2%甲基红―乙醇溶液
1份0.2%甲基红―乙醇溶液
1份0.1%亚甲兰―乙醇溶液
1份0.1%中性红―乙醇溶液
1份0.1%亚甲兰―乙醇溶液
1份0.1%中性红―乙醇
1份0.1%溴百里酚兰―乙醇
1份0.1%溴百里酚兰水溶液
1份0.1%酚红―水溶液
pH7.2 暗绿
1份0.1%百里酚兰―50%乙醇
3份0.1%酚酞―50%乙醇
配&&&& 制&&&& 方&&& 法
NaCH3COO.3H2O 8克，溶于适量水中，加6N乙酸134毫升，稀至500毫升
NaCH3COO.3H2O 20克,溶于适量水中，加6N乙酸134毫升，稀至500毫升
NaCH3COO.3H2O 32克,溶于适量水中，加6N乙酸68毫升，稀至500毫升
NaCH3COO.3H2O& 50克,溶于适量水中，加6N乙酸34毫升，稀至500毫升
NaCH3COO.3H2O 100克,溶于适量水中，加6N乙酸13毫升，稀至500毫升
NH4CH3COO& 77克, 用水溶解后, 稀至500毫升
NH4Cl& 60克,溶于适量水中,加15N氨水1.4毫升，稀至500毫升
NH4Cl& 50克,溶于适量水中,加15N氨水3.5毫升，稀至500毫升
NH4Cl& 40克,溶于适量水中,加15N氨水8.8毫升，稀至500毫升
NH4Cl& 35克,溶于适量水中,加15N氨水24毫升， 稀至500毫升
NH4Cl& 30克,溶于适量水中,加15N氨水65毫升， 稀至500毫升
NH4Cl& 27克,溶于适量水中,加15N氨197毫升， 稀至500毫升
NH4Cl& 9克,溶于适量水中,加15N氨水175毫升，稀至500毫升
NH4Cl& 3克,溶于适量水中,加15N氨水207毫升，稀至500毫升
0.01N 氢氧化钠溶液
0.1N& 氢氧化钠溶液
试 剂 名 称
乙二胺四乙酸二钠
C10H14N2O3Na2?2H2O
苯二甲酸氢钾
K2C2O4.H2O
(NH4)C2O4.H2O
(NH4)2C2O4
（在酸性中氧化还原Cr+6→ Cr+3）
（在酸性中氧化还原Mn+7→Mn+2）
硫代硫酸钠
Na2S2O3.5H2O
ZnSO4.7H2O
磷酸二氢钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
磷酸氢二钾
上一条：下一条：}