blot，简称WB）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，根据蛋白的大小不同迁移速率不同，经PAGE将蛋白样本分开，通过转膜将蛋白样本转移到固相载体（例如PVDF膜、NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的一抗、二抗起免疫反应，再经底物显影检测蛋白的表达情况。

简单分为如下几个流程:

众所周知，WB实验步骤繁多且复杂耗时，相应产生的问题也多如牛毛，每一步的操作都会对最终的曝光结果产生影响，那么我们怎样才能做出完美条带呢？下面给大家汇总了WB的问题已及建议和方法：

1.条带相连且长度相差较大

a. 配胶问题：浓缩胶和分离胶未充分凝结，样本容易漏串到其他泳道

b. 上样问题：上样量太大或各孔间的上样量差异较大。

解决方法：将聚丙烯酰胺凝胶充分凝结，室内温度较低时应相应增加凝胶时间，凝固不充分的胶会导致后续实验条带相连无法使用；上样时应等体积上样，如无法避免上样量体积不均一，要用1*loading补齐，以保持各胶孔上样体积一致。

2.条带断裂且最后一个泳道扭曲

a. 配胶问题：浓缩胶和分离胶未充分凝结，配胶时制胶液未充分混匀，造成胶不均一。

b. 电泳电压不均一或温度较高，泳道边缘效应，造成边缘泳道条带扭曲且有弥散现象。

解决方法：尽量避免边缘泳道进行蛋白待测样本上样。

a. 抗体稀释液问题：抗体稀释液浓度太高或不适合，不同厂家的抗体选择不同的稀释液（例如ABclonal的一抗用3%的封闭液进行稀释效果最好）。

b. 封闭液问题：配制封闭液所用的脱脂奶粉应选用无防腐剂的实验专用脱脂奶粉。

c. 一抗、二抗浓度配比不合适：杂带多，大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。

4.条带出现一头大一头小、条带不均一

a.转膜问题：转膜夹子不紧，转膜滤纸或海绵由于使用消耗，滤纸及海绵变薄，海绵弹性不足，建议及时更换转膜滤纸和海绵。

b.一抗孵育问题：抗体孵育不充分或抗体稀释液放入过少、摇床不合适，建议增大抗体稀释液用量、更换跷跷板类型的摇床将膜完全进入抗体稀释液中。

对于分子量稍大的蛋白转膜时间过长，转膜装置产热过多，无法维持转膜时的低温环境，造成条带扭曲。这里我们建议在条件允许的情况下直接在4℃中进行转膜，将冰更换为冰水混合物，及时更换转膜液并将转膜液放入4℃中提前预冷。

总而言之，WB实验细节众多，遇到的问题也多不胜数，希望大家在遇到问题时不要慌乱，找到适合自己的解决方法。天津舍为斯生物技术有限公司，可以为大家提供专业优质的WB实验服务，保证数据结果真实可信，并提供完美的售后服务，欢迎大家来电咨询。

注：来源于科教小站公众号整理。

University（美国华盛顿州立大学），清华大学，中国科学院和中国农业科学院团队创立，专注于新一代基因组学技术在生命科学研究和人类医学健康两大领域的产业化应用。为生命科学科研工作者提供系统化解决方案，同时努力发展临床医学及健康相关领域精准基因检测、辅助诊疗业务。安山生物立足于先进的基因组学技术，提供新一代测序技术服务，已与多家高校院所和研发机构开展科研合作，为生命科学研究提供优秀的技术解决方案。目前，安山生物正努力把先进技术应用于医学研究、医学诊断及临床治疗，包括病原