由体细胞建立诱导性多潜能干细胞系(iPS)的成功证明重新编程在干细胞生成中的重要作用,引发对白血病干/祖细胞起源的思考。白血病干/祖细胞的起源和演化是白血病发生发展的核心。白血病有两类不同类型,真正的白血病(bona fide leukemia)和非真正的白血病(non-bona fide leukemia),不同类型的白血病有不同起源的白血病干/祖细胞,近年来的研究进展表明它们受起源细胞的重新编程状态影响。

PPP2R5C是蛋白磷酸酶2A的调节性亚单位中一个家族成员,它在调节细胞增殖、分化和转化等方面具有重要作用,其作用主要通过对P53蛋白某些位点氨基酸的去磷酸化而实现。近期研究提示,PPP2R5C基因表达模式的改变与细胞恶性转化相关;此外,有研究发现PPP2R5C可以作为B-CLL病情进展的相关标记。本文就PPP2R5C基因结构、生物学功能及PPP2R5C基因与肿瘤发生发展的关系进行了探讨。

为研究混合谱系白血病(MLL)蛋白和多发性内分泌癌蛋白(Menin)的亚细胞定位情况,探究两者之间的相互关系是否存在,分别构建了pcDNA3.1-myc-MLL和pCMV-flag-Menin重组真核表达载体。在HEK293T细胞中,分别或者同时表达Menin和MLL蛋白,通过细胞免疫荧光方法检测两种蛋白在细胞内的分布与共存关系;利用通过免疫共沉淀(Co-IP)并结合Western blot方法检测两种蛋白间的相互作用。结果表明:MLL蛋白与Menin蛋白主要在细胞核中表达,共聚焦显微镜观察显示两蛋白部分共存;Co-IP与Western blot结果显示,MLL蛋白可以在FLAG抗体的免疫沉淀物中检测出来,MYC抗体的免疫沉淀物中也能检测到蛋白Menin。结论:Menin与MLL2种蛋白在细胞中主要分布于胞核内,具有相同定位,并且存在相互作用关系。

本研究探讨新的白血病相关基因zo-1在白血病细胞中的作用及其初步机制。应用甲基化PCR方法验证THP-1等白血病细胞中基因zo-1甲基化与白血病的关系,用甲基化PCR及RT-PCR方法验证THP-1等白血病细胞系中基因zo-1甲基化与基因表达的关系。选择基因zo-1高表达的THP-1细胞,用脂质体Oligofectamine将针对基因zo-1的小干扰RNA转染THP-1细胞,RT-PCR方法验证抑制效率,AnnexinV和PI观察细胞凋亡率,PI检测细胞周期,CCK-8检测细胞增殖。结果表明:急性白血病人中基因zo-1呈高甲基化状态,健康人群中基因zo-1不发生甲基化。基因zo-1未甲基化的THP-1细胞系高表达基因zo-1;基因zo-1高甲基化的Molt4及HL-60细胞系中不表达基因zo-1。脂质体Oligofectamine转染针对zo-1的小干扰RNA成功地抑制了THP-1细胞基因zo-1的表达,而不影响THP-1细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡。结论:基因zo-1为白血病相关基因,急性白血病中基因zo-1高甲基化,基因zo-1的甲基化状态调控基因zo-1表达。THP-1细胞中基因zo-1表达缺失不影响细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡。

本研究检测急性髓系白血病(AML)患者外周血血浆游离DNAFLT3内部串联重复序列(internal tandem duplication,ITD)并探讨其临床意义。提取235例AML患者血浆游离DNA并以PCR扩增看家基因globin作为判定标准,通过PCR方法检测FLT3-ITD,并与骨髓或外周血白血病细胞DNA检测结果进行比较。结果表明:235例AML患者中,190例患者血浆游离DNA扩增出globin基因。188例初诊、复发或难治患者中,血浆游离DNA发生FLT3-ITD突变35例(19%,35/188),与病人白血病细胞DNA检测结果完全一致。47例临床缓解患者中,有2例血浆游离DNA扩增出globin基因并检出FLT3-ITD突变,而其细胞来源DNA均为阴性。2例患者均早期复发。与FLT3-野生型(wt)相比,FLT3-ITD突变患者白细胞计数、CD7、CD56表达等明显升高,CR率降低。结论:AML患者血浆中可以检测出白血病细胞特异性的血浆游离DNA,与直接检测白血病细胞结果一致。对骨髓缓解期病人残留白血病(MRD)的检测,血浆游离DNA具有更高的敏感性。FLT3-ITD的检测对AML患者的预后及疗效判断有重要意义。

抵抗素(resistin)自2001年被发现以来,人们对其生物学功能尚不清楚。本研究目的是通过抵抗素的组织表达分布以探讨人抵抗素的生物学功能、表达及与白血病发病的相关性。选择152例无炎症并发症的白血病病人作为实验组,100例健康志愿者作为对照组,采集静脉血血样,采用半定量PCR方法检测抵抗素在组织中的表达分布并比较抵抗素与内参基因表达的相对值,进行统计学分析。结果表明:抵抗素在正常人骨髓、胎儿肝脏,脐带血以及外周血细胞中有高水平表达,而在脂肪、脐带、胎盘以及成人肝脏组织中尚没有扩增出目的基因。实验发现,实验组抵抗素表达率为21%,对照组抵抗素表达率为27%,经卡方检验,χ2=0.84,差异不显著。对实验组与对照组抵抗素表达水平比较结果进行了统计学分析,差别无统计学意义(p>0.05)。结论:抵抗素在正常人骨髓、胎肝、脐血及外周血细胞中有高表达,此结果表明人抵抗素的表达与正常造血相关,但其表达率和表达水平与白血病无明显相关性。

本研究探讨超表达LRP16基因对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响。采用RT-PCR法扩增人LRP16基因开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,将其连接到pGEM-T质粒以构建LRP16基因ORF-pGEM-T重组载体。再将测序鉴定过的LRP16基因ORF插入pcDNA3.1+质粒以构建LRP16基因ORF-pcDNA3.1+重组表达质粒,转染K562细胞,建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系。用MTT法测定细胞存活率并绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果表明:成功扩增出人LRP16基因ORF片段,并构建LRP16基因ORF-pcDNA3.1+重组表达质粒;建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系;超表达LRP16基因具有促进K562细胞增殖的作用,且这种促增殖作用部分是通过促进细胞由G0期进入S期而实现的。结论:超表达LRP16基因可促进K562细胞增殖。

为了解慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者外周血免疫球蛋白(Ig)异常与年龄、性别、疾病分期及预后的关系,运用免疫速率比浊法测定83例CLL患者血清中IgG、IgA和IgM水平,用多参数流式细胞术(FCM)检测患者外周血CD38、ZAP-70表达水平。结果表明:83例CLL患者中IgG减低12例(14.5%);IgA减低26例(31.3%),IgM减低34例(41.0%)。BinetC期组Ig减低发生率明显高于BinetA和B期组(p=0.011),Rai分期高危组的Ig减低发生率明显高于低危组(p=0.011)。Ig减低组CD38和ZAP-70表达阳性率明显较Ig正常组高(p=0.033和p=0.038)。CD38和ZAP-70在疾病晚期患者表达阳性率更高,其中BinetC期组ZAP-70表达阳性率明显高于BinetA和B期组(p=0.047)。而年龄和性别与Ig异常没有明显相关性(p>0.05)。结论:CLL患者体液免疫功能与疾病分期密切相关,检测CLL患者外周血Ig水平的变化,对了解CLL患者免疫功能状态,从而判断病情及预后具有重要作用。

本研究采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术建立不同预后tel/aml1阳性儿童ALL白血病细胞的蛋白质表达谱,探讨此临床亚型儿童ALL的发生发展机制。根据初诊时白细胞数、早期治疗反应及临床预后将tel/aml1(+)儿童ALL分为3组:早期复发组、高白细胞组和标危组。取初诊患者骨髓提取蛋白,通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行细胞蛋白质凝胶电泳,对组间差异蛋白进行图像分析。结果显示:不同组间将tel/aml1(+)儿童蛋白表达谱存在显著差异(大于2倍或小于0.5倍),具有统计学意义(p<0.05)。早期复发病例与标危病例及初诊时高白细胞(>100×109/L)病例相比,有71个蛋白点表达消失,93个新蛋白点出现,37个蛋白点表达上调,23个蛋白点表达下调;标危病例与初诊时高白细胞病例比较,有6个蛋白点表达消失,56个新蛋白点出现,7个蛋白点表达上调,19个蛋白点表达下调。结论:早期复发组病例蛋白表达谱与其他组别存在显著性差异,部分蛋白在儿童ALL的发生发展过程中具有重要作用,可能成为个体化治疗的新的分子指标和药物靶点。

本研究探讨psma6、slc25a4基因在急性单核细胞白血病(AML-M5)患者中的表达水平,并分析其与临床特征和预后的关系。应用实时荧光定量RT-PCR方法检测psma6、slc25a4在AML-M5患者白血病细胞、正常人血细胞以及非白血病患者血细胞中的表达水平并加以比较,同时对于psma6编码的蛋白P27K进行免疫组化分析。结果表明:psma6mRNA在AML-M5患者白血病细胞的表达低于正常人血细胞、非AML-M5白血病细胞以及非白血病患者血细胞。免疫组织化学检测结果与之相一致。psma6表达在AML-M5化疗缓解组高于未缓解组;在AML-M5和AL中P27K蛋白表达水平与外周血白细胞计数、乳酸脱氢酶(LDH)含量有关。slc25a4mRNA在AML-M5患者白血病细胞中高表达,而slc25a4mRNA表达在缓解组和未缓解组无显著差异。结论:psma6表达水平可能作为AML-M5的预后指标之一;slc25a4可能是一个AML-M5新肿瘤抗原基因。

本研究对192例急性髓系白血病(AML)患者进行免疫表型检测,并探讨其与细胞遗传学改变和临床特征的关系。应用流式细胞术及一组系列相关单克隆抗体对192例AML患者骨髓进行免疫表型分析,用染色体G显带技术对其中的125例进行核型分析。结果显示,髓系抗原CD13、CD33、MPO、CD117表达最常见于AML。CD117表达于84.6%AML-M3病例中;较强的自发荧光、CD34与HLA-DR双阴性、表达相关髓系抗原CD13、CD33和MPO对于AML-M3诊断具有一定参考价值。CD14仅在AML-M4和AML-M5中表达;CD64和CD15同时强阳性伴HLA-DR高表达提示AML-M5可能性大。192例AML中,有47.9%伴淋系抗原表达,其中以CD7(20.8%)和CD56(26.0%)最常见,其次为CD19(9.9%)和CD2(7.3%)。125例AML中核型异常者76例(60.8%)。17例伴t(8;21)的AML-M2患者CD19、CD56、CD15表达均明显增加。另外28例t(15;17)均见于M3;2例inv(16)见于M4EO。LymAg+组CD34阳性患者比例(77.2%)明显高于LymAg-组(48.0%)。结论:免疫表型对AML的诊断与分型至关重要,免疫表型与患者的异常核型改变及临床特征关系密切。本研究结果提示综合细胞形态学、遗传学及免疫表型分析,对AML患者诊断、分型及预后评估有重要意义。

本研究旨在探讨汉防己甲素(TET)对人慢性髓系白血病(CML)急性红白血病细胞株K562/A02多药耐药的逆转作用,及其逆转耐药与细胞周期依赖性激酶抑制因子(p21)、P糖蛋白(P-gp)及其基因的关系,为TET的临床应用提供新的理论基础。K562/A02细胞实验分组为:①单用柔红霉素(DNR)对照组;②DNR+TET0.5mg/L组;③DNR+TET1.0mg/L组;④DNR+TET2.0mg/L组。采用Westernblot法检测实验各组K562/A02细胞P21的表达。采用流式细胞仪(FCM)检测实验各组细胞P-gp的表达,采用半定量PCR(RT-PCR)测定细胞MDR1基因mRNA表达水平。结果表明:K562/A02细胞中P21蛋白的表达随着TET浓度的增加而增强,P-gp蛋白的表达随着TET浓度的增加而减低。K562细胞中mdr1基因几乎无表达,K562/A02细胞中mdr1基因高表达,随着TET浓度的增加K562/A02细胞mdr1基因表达不断降低。结论:TET对K562/A02耐药具有逆转作用且呈浓度依赖性,其逆转耐药可能与其上调P21蛋白的表达、下调mdr1及P-gp的表达有关。

本研究旨在探讨5-溴汉防己甲素(BrTet)和汉防己甲素(Tet)对K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用。采用MTT法检测阿霉素(ADM)联合应用BrTet、Tet,对K562/A02细胞和K562细胞增殖的影响;采用流式细胞术(FCM)检测细胞内ADM浓度和P糖蛋白(P-gp)的表达;采用RT-PCR测定细胞mdr1基因mRNA表达水平。建立裸鼠皮下移植瘤模型,比较BrTet、Tet在体内的逆转耐药作用。结果发现,BrTet在0.25、0.5以及1μmol/L浓度条件下对K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用呈剂量依赖性。流式细胞术检测提示,BrTet显著增加K562/A02细胞内ADM浓度,并呈剂量依赖性,同时抑制P-gp的表达,下调mdr1mRNA的表达。在荷瘤鼠模型中,BrTet明显增加ADM对K562/A02移植瘤的抗肿瘤作用,从单用ADM的5.8%上升至26.1%,而在K562移植瘤中没有显著差异。结论:BrTet在体内体外试验中均显示出显著的逆转MDR作用,其活性可能与抑制P-gp的过度表达和增加抗肿瘤药物的积聚有关。

CI)诱导慢性髓性白血病(CML)细胞分化成树突状细胞(DC)的作用,了解诱导产生P210蛋白的情况和刺激自身T细胞产生针对CML细胞的细胞毒作用。用CI和粒-单集落刺激因子(GM-CSF)联合诱导CML病人骨髓来源的单个核细胞,通过倒置显微镜和电子显微镜观察细胞的形态变化和超微结构,用流式细胞仪检测细胞表面分化抗原的变化和变化过程;用Western blot检测CML特异的肿瘤标志物P210蛋白在DC中的表达;通过乳酸脱氢酶(LDH)实验评估CI诱导的CML-DC刺激自身T细胞产生抗CML细胞的细胞毒作用。结果表明: CML细胞经CI和GM-CSF联合诱导96小时后在倒置显微镜和电子显微镜下观察到DC典型的形态结构;流式细胞仪检测显示CD83、CD86、CD80、HLA-DR、CD40等细胞表面分化抗原的表达显著提高;Western blot实验表明,生成的CML-DC有P210蛋白的表达,与未经诱导的CML单个核细胞比较,用CI和GM-CSF联合诱导生成的CML-DC的P210蛋白表达水平降低;LDH实验表明,这些CML-DC刺激的自身T细胞对CML细胞的杀伤率显著高于用CML细胞刺激的自身T细胞。结论: CI和GM-CSF联合能快速诱导CML细胞分化成DC,这些CML-DC表达CML细胞特异的肿瘤标志物P210蛋白,但其表达水平较未经诱导的CML单个核细胞低;CML细胞经诱导生成的CML-DC能够刺激自身T细胞产生抗白血病细胞毒性。

本研究探讨中药黄芩苷对耐阿霉素人髓系白血病细胞株HL-60/ADR增殖、凋亡的影响。应用MTT法绘制细胞生长曲线,观察黄芩苷对HL-60/ADR细胞增殖的影响;应用Annexin V FITC/PI双染流式细胞术、DNA片段化、TdT酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;RT-PCR检测黄芩苷作用不同时段后c-myc、bcl-2等凋亡相关基因mRNA的表达水平;Western FITC/PI法检测到早期凋亡细胞、DNA片段化,TUNEL法检测到晚期凋亡细胞,细胞凋亡率呈浓度依赖性(20、40、80μmol/L)。黄芩苷作用HL-60/ADR细胞不同时段(12、24、48小时)后c-myc、bcl-2基因mRNA的表达,并随着作用时间的延长而逐渐减弱,C-MYC、BCL-2、procaspase-3、PARP(116kD)蛋白的表达逐渐下降,PARP(85kD)及BAD蛋白表达逐渐增强,呈时间依赖性。结论:黄芩苷能有效抑制HL-60/ADR细胞增殖,诱导其凋亡,上述凋亡相关基因及信号通路相关蛋白可能参与了黄芩苷抑制HL-60/ADR细胞增殖和诱导凋亡的过程。

本研究探讨中药大黄素(emodin)对T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株增殖、凋亡的影响及其作用机制。应用MTT法检测细胞增殖能力;DNA片段化检测和末端缺口原位标记(TUNEL)法分析细胞凋亡;蛋白印迹法(Western blot检测结果显示,BCL-2、C-MYC和hTERT蛋白在大黄素作用后表达水平下降,caspase家族的蛋白前体procaspase-3、8、9表达均下降,而激活后的活性片段caspase-3则表达上调。结论:大黄素能有效抑制Jurkat细胞增殖,诱导其凋亡。其机制可能与下调BCL-2、C-MYC、hTERT等凋亡相关蛋白表达,激活caspase家族特别是caspase-3活性片段蛋白表达有关。

本研究探讨苦参碱诱导T淋巴细胞白血病JM细胞凋亡相关基因的表达变化,并进一步分析其机制。用0.4mg/ml苦参碱诱导JM细胞4天,分别提取对照组及苦参碱诱导组细胞总RNA,采用凋亡相关基因Atlas cDNA Expression ArrayKit筛选出苦参碱诱导JM细胞前后差异表达的凋亡相关基因,并用Western blot验证部分基因表达变化。结果表明,JM细胞经苦参碱诱导后,基因芯片杂交结果显示31个基因有差异表达,其中caspase8表达上调达5倍以上。Western blot证实caspase8表达变化与苦参碱作用时间呈正相关。结论:苦参碱可诱导JM细胞多个凋亡基因差异表达,其中caspase8表达上调较为显著。

本研究探讨新型共刺激分子CD137(4-1BB)在人T淋巴细胞上的表达特点及其单克隆抗体hCD137mAb在刺激T淋巴细胞增殖、促进细胞因子分泌、增强细胞杀伤作用的抗白血病功能。应用FACS及间接免疫荧光法分别检测正常人T淋巴细胞上加入植物血凝素(PHA)前后不同时相CD137的表达。在HL-60细胞和T淋巴细胞体外培养体系中,用MTT比色法测定hCD137mAb、PHA对T淋巴细胞增殖作用的影响,用FACS及间接免疫荧光法检测其对T细胞表面上IFN-γ和IL-4分泌水平的影响。在体外混合淋巴细胞肿瘤细胞培养(MLTC)体系中,研究不同效靶比例时hCD137mAb增强T细胞杀伤白血病细胞的抗白血病作用。结果表明:①T细胞未经PHA刺激几乎不表达hCD137,经PHA活化后开始表达,且随着时间延长表达率逐渐增高,第7天为高峰(FACS法为56.4%±1.98%,间接免疫荧光法为52.8%±2.01%)。②MTT法检测提示,单独使用hCD137mAb不能刺激T细胞增殖(增殖指数1.002±0.011),但其与PHA伍用可增强后者刺激活性(增殖指数2.161±0.102)约2倍(增殖指数4.705±0.133)。③在PHA存在时,hCD137mAb可使IFN-γ在T细胞上表达增加到大约2倍,而对IL-4几无影响。④hCD137mAb明显增强T细胞对白血病细胞株HL-60的杀伤活性,且共刺激活性在40:1效靶比时最强,杀伤百分比增加到大约2倍。结论:新型共刺激分子CD137具有显著的抗白血病作用,应用hCD137mAb是一种有效排斥白血病的免疫策略,且安全、简便,本研究为其用于临床免疫治疗提供了实验依据。

acid,SAHA)对T淋巴瘤细胞株Jurkat和Hut78的协同诱导凋亡作用,以及两药联合对蛋白聚集体形成的影响。硼替唑米(10nmol/L)单药或硼替唑米(10nmol/L)联合SAHA(2μmol/L)处理Jurkat和Hut78细胞,应用台盼蓝拒染法计数细胞生长抑制率;细胞涂片观察细胞形态学改变;流式细胞术检测细胞凋亡变化;透射电子显微镜观察细胞凋亡和聚集体形成的超微结构特征。研究结果表明,与对照组和单用硼替唑米组比较,两药合用能够显著抑制Jurkat和Hut78细胞生长,促进细胞凋亡。流式结果显示,两药合用组的Jurkat和Hub78细胞凋亡细胞比例分别为(41.8±4.7)%和(72.7±11.7)%,显著高于对照组[(3.6±1.3)%和(7.0±1.9)%]和单用硼替唑米组[(6.3±2.3)%和(18.7±9.2)%](p均<0.01)。超微结构显示,单用硼替唑米组细胞内多为典型的聚集体结构,两药合用组细胞内聚集体密度降低,数量减少甚至消失,且凋亡细胞明显增多。结论:蛋白酶体抑制剂联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂能有效诱导T淋巴瘤细胞凋亡,两药具有协同作用。硼替唑米促进聚集体形成,SAHA能破坏聚集体结构,是增强硼替唑米促凋亡效应的可能机制之一。

本研究通过腹腔注射N-甲基亚硝基脲(MNU)建立小鼠胸腺淋巴瘤动物模型。第0、8周2次给C57BL/6小鼠腹腔注射MNU诱导液50mg/kg体重注射后观察动物一般情况;第22周处死全部小鼠,解剖检查胸腺肿瘤的发生及其他脏器情况。结果表明:第22周时67.5%(27/40)实验小鼠产生胸腺淋巴瘤。不同性别对成瘤率影响无明显差异。结论:腹腔分次注射MNU可以诱导小鼠建立胸腺淋巴瘤动物模型,其生物学行为与人类相似。

为了探讨白桦脂酸对多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226的诱导凋亡作用,用MTT、Annexin-V/PI双标记流式细胞术、PI单标记流式细胞术和Hoechst33258染色分别检测白桦脂酸对RPMI-8226增殖抑制、凋亡诱导、细胞周期的作用和形态学变化。用RT-PCR技术检测加药后RPMI-8226凋亡相关基因bcl-xl和caspase3的表达的变化。结果表明:白桦脂酸对RPMI-8226作用24和48小时的IC50值分别为10.156±0.659和5.434±0.212μg/ml,在一定浓度范围内,白桦脂酸对其增殖的抑制作用呈时间和剂量依赖性。RPMI-8226细胞的凋亡率随药物浓度的增加而增加。细胞周期测定显示,随药物浓度的增加G0/G1期的细胞比例增高,处于S期的细胞比例减低,药物对G2/M期细胞影响不明显。Hoechst33258染色在荧光显微镜下可见药物处理组和对照组之间细胞形态的显著变化。RT-PCR测定示,随加药浓度的增加,bcl-xl基因的表达呈降低趋势,而caspase3基因的表达呈增高趋势。结论:在一定的浓度范围内,白桦脂酸可诱导RPMI-8226发生凋亡且呈时间剂量依赖性,该过程可能与其上调caspase3和下调bcl-xl基因的表达有关。白桦脂酸还可以影响RPMI-8226细胞系的G1/S期,使细胞阻滞在G0/G1期。

本研究旨在建立骨髓涂片间期荧光原位杂交(I-FISH)的实验方法,为检测多发性骨髓瘤(MM)分子细胞遗传学提供新方法。以骨髓涂片为载体,通过一系列的处理,固定及消化后,用8号染色体着丝粒探针行I-FISH分子细胞遗传学的检测,并比较该方法与常规I-FISH结果的差异。结果表明:两种方法分析非恶性血液病标本的各个信号比例无统计学差异(p>0.05)。骨髓涂片I-FISH研究中,19例MM患者中8例(42.1%)有8号染色体异常,其中8号染色体单体(-8)5例(26.3%),8号染色体三倍体(+8)3例(15.8%)。结论:骨髓涂片I-FISH具有操作简便、经济、准确的特点,可用于MM分子遗传学异常的研究。

本研究探讨基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOFMS)检测多发性骨髓瘤(MM)jak2基因的单核苷酸多态性(SNP)的实用性。用PCR扩增出含jak2基因2个SNP(C428T和C643T)位点的DNA片段作为模板,产物纯化后利用MALDI-TOFMS检测5例MM和5例健康对照者样本的jak2基因多态性。结果表明:C428T和C643T位点基因型在多发性骨髓瘤病例与健康对照组的分布无差异,均为T/T纯合子。结论:本实验建立的基于MALDI-TOFMS与引物延伸技术检测jak2基因多态性的方法是一个快速、准确和可靠的检测方法。

为了观察C反应蛋白(CRP)对人骨髓瘤细胞系U266细胞增殖活性的作用机制,将液氮冻存的U266细胞复苏后,悬浮培养,第3天收集细胞备用,分别以不同浓度CRP(0、5、10、20mg/L)培养24小时,采用血液分析仪检测细胞增殖情况,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测凋亡相关蛋白survivin和HSP90α的表达。结果发现:CRP处理的细胞组增殖率及survivin、HSP90α的表达量均高于对照组(p<0.05),20mg/LCRP组作用最显著;survivin、HSP90α之间表达具有显著相关性(r=0.737,p<0.0001)。结论:CRP是通过调节凋亡抑制蛋白Survivin及HSP90α的表达发挥促进U266细胞增殖的作用。

本研究探讨初诊急性髓系白血病(AML)患者骨髓中树突状细胞(dendritic cells,DC)亚群数量的变化特点。采用直接免疫荧光标记法,对30例健康志愿者和77例初诊AML患者的骨髓进行髓样DC(myeloidDC,mDC)和浆细胞样DC(plasmacytoid DC,pDC)标记,用流式细胞仪进行检测,并用4色与传统3色两种设门方法进行分析。结果表明:与正常人骨髓中mDC与pDC的数量相比,4色设门方法分析显示,在77例初诊AML患者中:mDC数量减低、正常与增高的患者分别占74.0%(57例)、6.5%(5例)和19.5%(15例),pDC数量减低、正常与增高的患者分别占90.9%(70例)、7.8%(6例)与1.3%(1例);3色设门方法分析显示,mDC数量减低、正常与增高的患者分别占58.4%(45例)、19.5%(15例)和22.1%(17例);pDC数量减低、正常与增高的患者分别占46.8%(36例)、26.0%(20例)与27.3%(21例)。两种设门方法所得结果,有统计学差异(p<0.05)。在AML-M2、M3与M4/M5几个亚型中,4色设门方法分析显示:mDC数量减低患者所占比例分别为81.4%、100%与42.1%;pDC数量减低患者所占比例分别为88.4%、100%与89.5%。M4/M5型与M2、M3型相比,mDC数量正常或增高的患者较多,差异有统计学意义(p<0.05);pDC在各亚型中的数量变化无统计学差异(p>0.05)。结论:4色设门方法比传统3色设门方法更适用于初诊AML患者骨髓中mDC与pDC数量的研究;大部分初诊AML患者表现为mDC与pDC数量的减低;M4/M5型与M2、M3型相比,mDC数量正常或增高的患者较多,而pDC在各亚型之间未见明显差别。

本研究应用流式细胞仪采用两种四色抗体组合检测并计数国内健康个体骨髓和外周血树突状细胞DC亚群。检测35例健康骨髓中Lin-HLA-DR+CD11chiBDCA1+的mDC和Lin-HLA-DR+CD123hiBDCA2+的pDC数量,并与普遍采用的Lin-HLA-DR+CD11chi的mDC和Lin-HLA-DR+CD123hipDC的三色设门方法进行比较。结果表明:骨髓中DC亚群的绝对计数和pDC的相对计数均随年龄的增加而降低;男性DC亚群的绝对计数值高于女性(p<0.05)。三色和四色设门方法均显示健康个体骨髓和外周血DC亚群的分布不同(p<0.05)。外周血中mDC含量较高,两种方法检测的mDC与pDC的比值分别为2.70和2.31;骨髓与外周血截然不同,骨髓中含有大量pDC,mDC与pDC的比值分别为0.90和0.71。三色和四色的流式分析方法显示具有很好的相关性(相对计数mDCr=0.86;pDCr=0.96,绝对计数mDCr=0.95;pDCr=0.98)。两种方法检测的DC亚群计数除在外周血pDC检测无明显差异外,外周血中的mDC和骨髓中mDC与pDC计数均明显不同(p<0.001),三色方法确定的值明显高于四色方法,因三色方法确定的mDC与pDC中分别存在一定比例的Lin-HLA-DR+CD11chiBDCA1-细胞和Lin-HLA-DR+CD123hiBDCA2dim/-细胞,在骨髓中这些细胞比例较高。结论:标本来源,性别,年龄和有核细胞计数是健康人DC绝对计数的影响因素(p<0.05)。四色抗体组合可以界定更加严格意义的骨髓DC亚型。骨髓和外周血的DC分布不同,外周血含有大量的mDC,而骨髓中以pDC为优势群体。

typing,SBT),分析无法判读的原因。结果显示:311份脐血样本中99.4%样本不能判定是因为当时HLA分型方法本身的限制性所造成的,0.6%样本不能判定的原因怀疑是脐血中存在母血污染所致。结论:HLA基因分型方法中序列特异性寡核苷酸探针杂交法(sequence-specific oligonucleotide probe hybridization,SSO)探针设计不足及PCR-SSP等位基因特异性引物的缺乏是影响HLA分型结果无法判读的主要因素。

本研究旨在建立从全血EDTA抗凝样本中高通量提取基因组DNA的有效方法,以常规应用于Luminexr SSO HLA流式磁珠基因分型。使用2ml深孔板和TECAN DNA全自动工作站,从288份骨髓捐献者样本中提取基因组DNA;提取的DNA样本用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,并采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性;DNA样本用Onelambdar SSOHLA-A、B和DRB1基因分型试剂盒进行PCR扩增、分子杂交和Luminex流式磁珠分析仪检测,统计分析每一DNA样本HLA-A、B和DRB1基因扩增产物经DNA探针分子杂交后的阳性磁珠和阴性磁珠的荧光信号强度。结果表明:从400μl全血中提取了基因组DNA,288份样本的DNA产量平均为3.217±0.715μg,A260/A280值平均为1.710±0.103,A260-A320/A280-A320值平均为1.761±0.151;用琼脂糖凝胶电泳法测得DNA的分子量均大于15kb;每一样本HLA-A、-B和-DRB1杂交后的阳性磁珠的荧光信号强度均>600RFU,而阴性磁珠的荧光信号强度<50RFU。结论:本方法适用于从大量全血样本中快速提取基因组DNA,所得的基因组DNA适用于高通量中华骨髓捐献者样本的HLA流式磁珠基因分型等下游的移植免疫学与分子生物学实验。

本研究制备凋亡相关蛋白PNAS-2的单克隆抗体,并对其进行初步鉴定,为PNAS-2蛋白功能研究提供必需工具。以PNAS-2的合成肽为免疫原,通过动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗PNAS-2蛋白的单克隆抗体,并用Western blot、免疫荧光、ELISA实验对单克隆抗体的特异性、效价、亚型进行了检测。结果表明:获得了稳定的分泌型杂交瘤细胞株S-31-7,属IgG1λ亚型,腹水效价为1:8000;Western blot测得分子量为28kD的单条特异性条带;免疫荧光实验显示胞浆中有阳性反应。结论:制备的单克隆抗体特异性好、效价高,能够作为深入研究PNAS-2蛋白功能的有利工具。

本研究探讨一氧化氮在骨髓间充质干细胞(MSC)抑制淋巴细胞增殖中的作用及机制。从人骨髓中分离培养MSC,预先接种在培养板上,建立混合淋巴细胞培养(MLC)体系,利用CCK-8法检测淋巴细胞增殖情况,并用Griess法检测培养体系NO的产生,real-timePCR检测淋巴细胞FOXP3mRNA表达水平。结果表明:MSC干预组淋巴细胞增殖活性下降,其OD值为0.49±0.03,NO含量明显升高为(21.05±1.14)μmol/L,淋巴细胞FOXP3mRNA表达水平为(1.56±0.34)%,而无MSC的MLC组NO含量为(3.30±0.36)μmol/L,FOXP3表达水平为(0.74±0.15)%,两组相比具有显著性差异。结论:MSC产生的NO上调淋巴细胞FOXP3mRNA的表达水平,从而抑制淋巴细胞增殖。

近年来发展了一些质粒载体介导shRNA的转录,然后在细胞酶的作用下加工成功能性的siRNAs。虽然这些载体较化学合成的siRNA有更多的优点,但仍存在相当多的缺点,如转染效率低和不能在体内使用。本研究建立一种没有上述缺点的腺病毒递送BmihRNAs系统,设计靶向人Bmi-1的载体。以pAdTrackCMV质粒为模板扩增CMV-GFP表达盒,从pGE1BMIhRNA质粒上酶切下U6-BMI-1shRNA表达盒,克隆它们入穿梭质粒pShuttle中,然后与pAdEasy-1质粒基因重组产生腺病毒质粒pAd-BMIhRNA-CVM-GFP,转染293A包装细胞,收获病毒。病毒感染K562细胞后,在mRNA和蛋白水平上分别用RealTime-PCR和Westernblot检测BMI的表达水平。结果表明:成功构建了pGE1BMIhRNA腺病毒质粒并有效包装出病毒。感染BmihRNA腺病毒的K562细胞在mRNA和蛋白水平上均显著下调了Bmi-1的表达,而对照病毒没有明显的效果。结论:腺病毒是一种有效递送siRNA入哺乳动物细胞的载体。腺病毒递送siRNA载体可能成为siRNA药物的基因治疗载体。

reaction,PCR)方法检测601例ALL患儿中MLL基因重排的发生率,通过对PCR产物的测序,分析融合基因的亚型及特点;比较分析重排阳性的22例患儿与同期未检出任何融合基因的随机抽取的30例ALL患儿及43例pro-B-ALL患儿初诊时免疫表型特点。结果表明:MLL基因重排阳性的ALL患儿检出率为3.66%,占pro-B-ALL的29.9%。20例MLL基因重排阳性的B-ALL患者全部为CD10-,表达CD13、CD33和CD34的例数较pro-B-ALL对照组低,CD20、CD22、CD2、CD5、CD7的表达则无差异。共检出4种MLL基因的伙伴基因AF4、AF9、AF10和ENL。MLL基因融合位点主要位于第6、7、8外显子,同一患者可同时存在多种MLL基因融合位点;而其伙伴基因的融合位点相对单一。1例患儿MLL-AF10融合转录本存在随机插入序列。结论:MLL基因重排的发生率低,重排形式多样,阳性ALL患儿在免疫表型及融合转录本的表达方面具有独特的生物学特征。

A,ConA)诱导的小鼠急性肝损伤模型。在ConA静脉注射后立即给予MSC静脉输注,24小时后进行小鼠血清转氨酶、肝脏组织病理学和原位细胞凋亡检测,并用实时定量RT-PCR的方法检测小鼠肝脏组织内炎症介质表达变化。结果显示,ConA静脉注射后立即给予MSC静脉输注,小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanine

本研究分离鉴定人骨髓和脐带来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC),比较两种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。用密度梯度离心或酶消化方法分离骨髓和脐带间充质干细胞,通过贴壁培养的方法进一步纯化MSC。检测骨髓和脐带MSC的表型以及成脂、成骨分化潜能。通过LTC-IC(long-termculture-initiatingcells)实验,检测骨髓和脐带间充质干细胞体外支持长期造血的能力,并在培养的第3、5、7周分析两种MSC组悬浮细胞的表型。结果表明,骨髓和脐带间充质干细胞体外培养时均呈纺锤形、贴壁生长,2种MSC均表达CD90、CD105、CD73、CD29、CD54、CD166和HLA-ABC,不表达HLA-DR、CD34和CD45。化学染色证实,2种MSC体外能分化为脂肪细胞和成骨细胞。LTC-IC实验第5周脐带间充质干细胞组CFC(colony cell)的产率与骨髓间充质干细胞组比较无统计学差异(p>0.05);第6、7、9周,脐带MSC组CFC的产率均低于骨髓MSC组(p<0.05)。第3、5、7周悬浮细胞表型检测结果显示,随着培养时间的延长,2种MSC组CD34和CD117的阳性率均明显下降,而CD33、CD13、CD11b的阳性率逐渐上升。结论:从人骨髓和脐带组织中成功分离并鉴定出间充质干细胞,脐带间充质干细胞能够在体外支持长期造血,但其造血支持能力弱于骨髓间充质干细胞。

本研究通过Transwell细胞隔离培养体系探讨骨髓源间充质干细胞(MSC)对脐血(CB)来源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)/自然杀伤细胞(NK)CD69的表达以及对培养体系中CD4+CD25+T调节(Treg)细胞量比的影响。利用聚碳酯膜孔径0.4μm的Transwell隔离细胞培养系统将实验组分为隔离培养(Transwell)组和直接混合(mix-ture)培养组;将MSC和CIK/NK细胞按1:20、1:50和1:100的比例分别在Transwell组和mixture组中进行隔离和直接混合培养,每组6个重复孔;培养48小时后通过流式细胞术检测各组CIK/NK细胞上CD69的表达以及培养体系中CD4+CD25+细胞量比的变化。结果显示:加入MSC的实验各组CB-CIK细胞和NK细胞上表达的CD69比例均显著低于对照组(p值均<0.001).Transwell组中的CIK和NK细胞上表达的CD69,在MSC的高浓度组(1:20组)均显著低于低浓度组(1:50组和1:100组),其中CIK细胞组间的p值分别为0.046、0.020;NK细胞组间的p值均为0.000。mixture组中不同比例组间CIK细胞上表达的CD69无显著性差异,而NK细胞上CD69的表达在MSC的高浓度组(1:20组)均显著低于低浓度组(1:50组和1:100组)。加入MSC的CB-CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+细胞的量比不论在Transwell还是mixture组中均显著高于对照组(p值均<0.01);在Transwell组中,CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+细胞的量比在1:20组、1:50组均显著高于1:100组;在mixture各组中,CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+T调节细胞的量比均有显著性差异。MSC的高浓度组(1:20组),CIK/NK细胞体系中的CD4+CD25+细胞量比在mixture组显著高于Transwell组;而在MSC的低浓度组(1:50组和1:100组),2组体系中的CD4+CD25+细胞量比无显著性差异。结论:MSC能以直接接触或间接作用的方式抑制异基因CIK/NK细胞的活化,这可能与MSC能上调培养体系中的CD4+CD25+Treg细胞量比有关,且这种作用与MSC的数量呈浓度依赖关系。

以间充质干细胞(MSC)为基础的细胞治疗已进入临床试验阶段,用于多种组织修复,而移植细胞体内存活是影响疗效的重要因素。为了体内示踪MSC,构建了萤火虫荧光素酶基因(fluc)逆转录病毒表达载体pL(fluc)SN,并筛选出稳定表达fluc的GPE+86细胞克隆。将逆转录病毒上清转染C57小鼠来源的MSC,经G418筛选后得到稳定表达fluc的MSC。将2×106个标记好的细胞注射正常骨骼肌,应用生物发光技术检测移植后不同时间细胞的存活情况。结果表明,随着时间的延长,细胞存活数目逐渐减少;移植后1天细胞死亡率高达(43.2±11.7)%,3天后细胞存活(8.6±2.5)%,6天后仅为(5.4±3.1)%,10天时未检测到荧光信号。结论:生物发光成像技术可用于移植的MSC体内示踪,但是即使将MSC植入正常的骨骼肌组织,大部分注入的MSC也将在短期内死亡。

本研究探讨胎儿肺部组织来源的间充质干细胞在无血清条件下体外对脐血单个核细胞诱导扩增为巨核细胞的影响。取脐血单个核细胞,在TPO,IL-l1,肝素的扩增体系中分为2组培养。第1组为脐血单个核细胞单独培养,第2组脐血单个核细胞与间充质干细胞共培养,在第7,10,14天时进行活细胞计数,用流式细胞仪分析CD41a和CD61的表达情况。采用免疫组织化学和透射电子显微镜观察第14天细胞的形态与结构,用流式细胞仪分析细胞DNA含量。结果表明,第2组在第10天时获得的CD41+细胞和CD61+细胞数量最多,分别为第1组的4.5倍和4.7倍;但免疫组织化学和电子显微镜显示,2个组的CD41a+和CD61+细胞的核发育不成熟。结论:胎肺间充质干细胞能有效刺激CD41a+和CD61+细胞生成,但不能促进幼巨核细胞核的发育。

本研究主要探讨人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对骨髓采集物记忆T细胞上黏附分子表达的调节作用。采用流式细胞仪检测稳态骨髓(SS-BM)和rhG-CSF预激的骨髓(G-BM)中CD4+、CD8+T细胞百分比及其记忆细胞表面黏附分子CD49d、CD54、CD62L和CD11a的表达。结果显示:rhG-CSF应用后骨髓采集物中CD4+、CD8+T细胞在淋巴细胞中的比例明显降低(p<0.001),记忆T细胞的比例没有明显变化;CD49d在CD4+和CD8+T细胞的表达百分比显著下降(p<0.05),但在记忆T细胞的表达百分比没有明显的变化;CD54在CD4+及其记忆T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的表达百分比明显降低(p<0.05),而在CD8+记忆T细胞的表达百分比没有明显变化;CD62L在CD4+、CD8+及其记忆T细胞的表达百分比显著下降(p<0.01);CD11a在CD4+及其记忆T细胞的表达百分比明显降低(p<0.05),而在CD8+及其记忆T细胞的表达百分比没有明显变化。结论:rhG-CSF部分下调骨髓中CD4+、CD8+以及相应的记忆T细胞上黏附分子表达。

本研究探讨异基因造血干细胞移植患者早期TNF-α、IL-1β、IFN-γ的变化规律,分析其在预处理过程中的改变情况及其与移植相关并发症之间的关系。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测95例异基因造血干细胞移植患者(其中aGVHD组43例,血栓组5例,感染组31例)预处理前后以及移植后各周内血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平的动态变化,以20例健康成人作为正常对照,观察预处理前后细胞因子的改变,探讨细胞因子和各并发症之间的关系。结果表明:预处理前TNF-α水平在aGVHD组已较正常升高(p(0.01),在其他患者中未见明显改变。在预处理第4天后所有患者TNF-α水平都较预处理前明显升高(p(0.05),预处理结束时TNF-α水平较预处理前降低。发生aGVHD、血栓或感染时,TNF-α水平均明显升高,以aGVHD组升高更为明显,血栓组TNF-α升高水平大于感染组(p(0.05)。血栓和aGVHD组的TNF-α水平在发病前2周即有升高,感染组病人在发病前未见改变。IL-1β在移植患者预处理各阶段未见明显变化,发生aGVHD、血栓、感染时IL-1β水平均有升高,以血栓组升高更明显,aGVHD组较感染组也明显升高(p(0.01)。IL-1β水平在血栓患者发病前2周见明显升高,而aGVHD组于发病前1周升高。IFN-γ水平在移植患者预处理过程中未见明显改变,在各并发症组之间变化不明显。结论:异基因造血干细胞移植过程中细胞因子存在着一系列改变,预处理可造成细胞因子TNF-α释放增加。在aGVHD发生时血清TNF-α水平明显升高,且较血栓患者升高更突出;在血栓发生时,血清IL-1β含量明显升高,并高于aGVHD患者。TNF-α、IL-1β水平的升高和移植相关并发症aGVHD及血栓性疾病的发生关系密切。动态监测TNF-α、IL-1β水平可预测aGVHD及血栓性病变的发生。

为了探讨单倍体相合外周血造血干细胞移植(hi-PBSCT)治疗恶性血液病的疗效和相关并发症,对15例高危患者进行体外不去除T细胞的hi-PBSCT。预处理采用改良的Bu/Cy或TBI/Cy方案,用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、环孢素A(CsA)、霉酚酸酯(MMF)和短程甲氨蝶呤(MTX)预防移植物抗宿主病(GVHD),4例加用抗CD25单克隆抗体。回输G-CSF动员的外周血干细胞,输注MNC中位数为8.16(3.92-10.86)×108/kg,CD34+细胞中位数为4.51(1.27-5.95)×106/kg。结果显示:所有患者均植入成功,ANC≥0.5×109/L的中位时间为14(11-19)天,Plt≥20×109/L的中位时间为22(11-52)天。Ⅰ-Ⅱ度急性GVHD6例,慢性GVHD2例。移植后100天内均出现感染,病原学确诊为细菌感染8例,CMV感染6例。5例患者出现复发。中位随访213(42-589)天,死亡8例,存活7例。结论:hi-PBSCT治疗无HLA相合供者的恶性血液病患者是可行而且有效的,进一步降低移植相关并发症是主要问题。

本研究探讨(G-CSF)动员骨髓加外周血联合进行单倍体相合造血干细胞移植(hiBM+PBSCT)治疗白血病的可行性及疗效。125例白血病患者接受了单倍体相合未去T细胞的造血干细胞移植。所有供者应用G-CSF5μg/(kg.d),皮下注射,连用7天。实验组(A组)29例患者在供者动员的第7、8天分别接受1次hiBMT+PBSCT移植;对照组(B组)96例仅接受1次单倍体相合骨髓造血干细胞移植(hiBMT)。对两组患者应用相同的免疫抑制剂预防急性GVHD,观察临床的移植效果。结果表明:除hiBMT组有1例慢性髓系白血病合并骨髓纤维化患者移植失败外,其余全部患者移植后经检测证实为完全供者造血,hiBM+PBSCT组和hiBMT组中性粒细胞数>0.5×109/L的中位时间分别为15(10-23)天和19(11-26)天;血小板数>20×109/L时间分别为18(9-33)天和23(13-35)天。hiBM+PBSCT组和hiBMT组急性Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的累计发生率分别是31.03%和12.5%,二者差异有显著性意义(p<0.05),但急性Ⅲ-Ⅳ度aGVHD的发生率分别是13.79%和10.41%(p>0.05)、aGVHD相关死亡率分别为3.45%和5.21%(p>0.05),差异均无显著性意义。骨髓联合外周血移植组和单纯骨髓移植组慢性GVHD的累计发生率分别是48.2%和35.4%(p>0.05),二者差异无显著性意义。广泛型慢性GVHD发生率两组分别为23.3%和15.6%(p>0.05),差异无显著性意义。骨髓联合外周血移植组和单纯骨髓移植组疾病复发率分别是6.8%(2/29)和18.7%(18/96)(p<0.05),二者差异有显著性意义。结论:G-CSF动员骨髓联合外周血单倍体相合造血干细胞移植后造血重建更快,急性Ⅲ-Ⅳ度GVHD发生率和死亡率无明显增加,高危白血病的复发率下降,可以有效安全应用于临床。

本研究探讨以大剂量阿糖胞苷(Ara-C)联合氟达拉滨(Flud)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)即FLAG方案巩固治疗急性髓系白血病(AML)对自体造血干细胞动员的影响。对15例AML患者在诱导缓解后采用FLAG方案巩固治疗(氟达拉滨,50mg/d,第1-5天;Ara-C2g/(m2.d),第1-5天;G-CSF300μg/d,皮下注射,化疗前1天至中性粒细胞>1.0×109/L)。15例中男10例,女5例,中位年龄36(14-51)岁,13例为初发AML,2例为复发难治AML。12例FLAG巩固2个疗程,3例巩固3个疗程。动员方案为:9例为FLAG,6例大剂量足叶乙甙(VP16)+G-CSF。结果表明:15例患者中11例(73.3%)被证实有足够的造血干细胞(CD34+细胞(2.0×106/kg),CD34细胞中位数为3.52×106/kg[(2.2-4.6)×106/kg]。在4例仅采集到足够的单个核细胞(MNC),而CD34+细胞含量却较低。结论:2个疗程的FLAG巩固治疗对AML患者的造血干细胞影响不明显,毒副作用不明显且不影响自体外周血造血干细胞的动员。

为了探讨异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后并发诺卡尔菌病的诊治及疗效,回顾分析了2例移植后发生诺卡尔菌病患者的临床、实验室检查特征、治疗经过及结局。结果发现,2例患者分别于移植后170、15天出现发热、胸痛,胸部CT片提示双肺结节影,经痰培养、肺泡灌洗液(BAL)及脓液培养确诊为诺卡尔菌病。给予复方新诺明(TMP-SMZ)为主的联合方案治疗半年,2例均获治愈。结论:诺卡尔菌病是allo-HSCT后少见并发症,主要累及肺部,严重者危及生命;BAL培养有助于诊断;复方新诺明为主的方案联合治疗有较好疗效。

迄今对于难治或复发急性髓系白血病(AML)尚未取得共识的有效治疗方案。本研究评价环磷酰胺、阿糖胞苷和拓扑替康联合组成的CAT方案治疗37例难治、复发AML患者的疗效和安全性,其具体化疗方案为:环磷酰胺300mg/m2,静脉滴注,每12小时1次,第1至第3天;拓扑替康,1.25mg/(m2.d),静脉滴注,第2至第6天,阿糖胞苷,500mg/(m2.d),静脉滴注,第2至第6天。结果表明:37例患者均完成1疗程化疗,完全缓解(CR)12例(32.4%),部分缓解(PR)2例(5.4%),总有效率达37.8%,其余23例未缓解(NR)(62.2%)。在18例复发病例中,CR6例(33.3%),PR2例(11.1%),NR10例(55.6%)。19例原发难治性AML患者中,6例获CR(31.6%),NR13例(68.4%)。复发组和原发难治组患者的治疗有效率分别为44.4%、31.6%,其差别无统计学意义(p=0.42)。大部分患者经历了Ⅲ-Ⅳ度血液学毒性,最常见的严重非血液学毒性(Ⅲ-Ⅳ度)是感染和口腔黏膜炎,发生率分别达到86.5%和37.8%。观察期(停化疗28天)内死亡1例。中位随访时间为4(0-33)月,总体中位生存时间4(1.8-6.2)月,有效患者和无效患者的中位生存期分别为9(5.7-12.3)月、2(0-5.0)月(p=0.00)。结论:CAT方案治疗难治、复发AML疗效确切,患者耐受性良好,值得进一步扩大临床试验。

killer,NK)/T细胞淋巴瘤是一类罕见淋巴瘤,起源于活化的NK细胞或活化的T细胞。它通常为结外病变,往往表现为位于面部中线组织的破坏性病灶。NK/T细胞淋巴瘤常见于鼻腔及鼻窦,此外其他结外器官如咽部、胃肠道、睾丸等部位的侵犯也有报导,也有一些罕见的表现为胸腔积液的报导。本文中报道了1名以胸腔积液为首发症状的NK/T细胞淋巴瘤。这名患者在外院通过对胸膜活检组织病理学及免疫组化染色误诊为B细胞型非霍奇金淋巴瘤。入院后通过对胸水细胞形态学(morphologic C)及分子生物学(molecular,M)(MICM)联合检测。结果表明,形态学检测证实有幼稚淋巴细胞,流式细胞术检测发现这些细胞表达胞浆CD3(cCD3)及CD56,分子生物学检测有克隆性T细胞受体γ(TCR-γ)基因重排,从而纠正误诊而正确将其诊断为NK/T细胞淋巴瘤,并成功地进行了异基因造血干细胞移植。结论:对这罕见病例应强调MICM联合诊断技术对诊断的重要性,另外,此罕见疾病有特殊临床表现,能够对其进行成功的治疗。

本研究分析淋巴瘤相关性噬血细胞综合征(LAHS)患者的临床特征和诊疗手段,为进一步提高LAHS诊断率、选择及时有效的治疗方案提供临床依据。收集2005年6月至2008年5月经首都医科大学附属北京友谊医院确诊的LAHS患者14例,回顾性分析其原发病、临床特征、实验室检查指标、治疗与转归,探讨疾病特点,并比较LAHS患者在确诊前后各项诊断标准的符合情况,了解各项诊断指标在疾病诊断中的意义。14例患者确诊后均采用FDIg方案(氟达拉滨,甲基强的松龙,丙种球蛋白)治疗,观察治疗效果。结果表明,14例LAHS患者的NK细胞活性、sCD25水平在疾病早期100%出现异常,而骨髓中噬血现象仅见于不到40%的患者,即使在确诊后,也只有不到50%患者出现了噬血。经FDIg方案治疗的14例患者其中9例(64.3%)病情好转;5例(35.7%)死亡。结论:NK细胞活性、血清sCD25水平的检测对于LAHS的早期诊断可能具有重要的意义,而噬血现象在疾病的诊断中并不一定起主要作用。以氟达拉滨联合激素和免疫球蛋白的治疗方案(FDIg方案)为早期有效治疗LAHS提供新思路。

本研究探讨获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)肝功能损害的临床特点。对18例获得性HLH合并肝功能损害患者的临床资料进行初步分析,了解肝功能损害的特点,以及肝功能损害与获得性HLH病因和预后之间的关系。结果表明:获得性HLH患者肝功能损害的特点为乳酸脱氢酶(LDH)及门冬氨酸转氨酶(AST)升高、低蛋白血症和黄疸。非肿瘤继发HLH组患者门冬氨酸转氨酶(AST)和直接胆红素(DBil)水平均明显高于肿瘤继发组HLH患者(p<0.05)。门冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)增高提示预后不良(p<0.05)。结论:肝功能损害是获得性HLH常见的器官功能障碍,其肝功能损害程度可能与获得性HLH病因和预后相关。

本研究观察了原发性血小板增多症(primary thrombocytosis,PT)患者临床血栓发生率及其与血小板功能变化的关系,探讨PT患者预防性应用血栓素A2抑制剂对其血小板活性的影响及其对血栓的预防和治疗的临床效果。以流式细胞术测定血小板表面的CD62P、PAC-1水平;ELISA方法测定血浆血栓素A2(TXA2)代谢产物TXB2和前列环素(PGI2)代谢产物6-K-PGF1α水平;观察和比较各组血小板功能的变化及其与血栓形成的关系。结果表明:奥扎格雷钠干预治疗前合并血栓组TXB2、CD62P、TXB2/6-keto-PGF1α比值均比未合并血栓组高,统计学差异具有显著性(p<0.01);奥扎格雷钠干预治疗后2组各项血小板功能指标除6-keto-PGF1α外,均较治疗前有明显降低(p<0.01),且合并血栓组在奥扎格雷钠治疗后除CD62P仍较未合并血栓组高(p<0.05)以外,其余指标均与未合并血栓组无显著性差异(p>0.05)。结论:PT合并血栓者血小板多项功能指标均较未合并血栓者异常升高,血小板功能活化也是PT患者血栓发生的高危因素。奥扎格雷钠均可使2组患者血小板活化指标明显降低,体内TXA2的生成减少和TXA2/PGI2的比值改善。奥扎格雷钠不但具有治疗血栓作用,而且还有较好的预防血栓效果。

本研究目的是建立孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术,用于ABO血型不合引起的新生儿溶血病的产前诊断。根据ABO血型基因DNA全序列和mRNA序列设计4对引物,选择20例健康供者血浆,提取血浆中DNA进行扩增,探索最佳的血浆DNA提取及PCR扩增条件,初步建立单人ABO血型基因分型技术。将O型血浆DNA与A型或B型血浆DNA按1:1、2:1、4:1、8:1、10:1、20:1、40:1、100:1进行混合,模拟孕妇外周血胎儿与孕妇自身ABO基因混合状态,建立混合ABO血型基因分型技术。选取14例孕30周以上的孕妇外周血标本,进行胎儿ABO血型基因型鉴定,并对孕妇进行追踪,尽量获取胎儿出生以后的外周血标本进行ABO血型鉴定,以评价孕妇外周血胎儿ABO血型基因分型技术的灵敏度与准确性。结果表明:单人血浆进行准确血型鉴定的最少模板DNA量约为0.625ng,500μl血浆提取的DNA量即可达到PCR扩增要求;当混合血浆中O型DNA所占比例≤10时,可以准确检测出非O基因的存在;14名O型孕妇外周血标本中9例标本扩增出非O型基因,5例未扩增出非O基因;通过血清学方法对5例胎儿出生后外周血进行ABO血型鉴定,其中A型3例,B型1例,O型1例,与其基因分型结果一致,符合率100%。结论:本研究建立的孕妇外周血胎儿ABO血型基因提取、分型技术,可以对妊娠中晚期胎儿ABO血型基因型进行准确鉴定,从而为新生儿溶血病的产前诊断与预防提供指导意见。

本研究探讨不同红细胞冻干保护剂配方及浓度的变化对红细胞冻干-复水后回收率的影响。应用一系列不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、海藻糖及不同渗透性保护剂组成的红细胞冻干保护剂保护冻干红细胞并检测冻干红细胞复冰后红细胞及血红蛋白的回收率。结果显示:荷载海藻糖的红细胞在添加不同浓度保护剂保护下各组的红细胞损失率差异具有显著性(p<0.05或p<0.01),其中以有PVP360的保护液组中的细胞损失最大(0.24%),含有PVP40且胞外海藻糖浓度为150mmol/L时,红细胞的损失最小(0.02%)。海藻糖浓度为150mmol/L与海藻糖浓度为50mmol/L的保护剂组之间存在统计学差异(p<0.01)。冻干红细胞在添加不同PVP40浓度的冻干保护剂作用再水化后红细胞和血红蛋白回收率也不相同。15%PVP40+150mmol/L海藻糖+2%BSA在红细胞冻干中的保护效果最好,红细胞和血红蛋白回收率分别为(61.29±4.93)%,(62.49±5.91)%,与其它各组间存在显著差异(p<0.01)。含有甘油的冻干保护液对红细胞冻干过程中的保护效果最好,红细胞和血红蛋白回收率分别为(65.97±4.52)%和(67.24±5.94)%,与其它渗透性保护剂组相比存在显著性差异(p<0.01)。结论:红细胞冻干保护剂为0.8mol/L甘油+15%PVP40+150mmol/L海藻糖+2%BSA是最佳保护剂浓度配方。

本研究观察二甲亚砜(DMSO)与海藻糖联用对冷冻保存血小板的保护效果。实验分设空白组、海藻糖组、DMSO组、5%DMSO加海藻糖联用组、2.5%DMSO加海藻糖联用组。各组血小板置-80℃冰箱保存,37℃水浴融化。采用血细胞计数仪测定血小板回收率和MPV值、电子显微镜观察血小板超微结构变化和流式细胞仪测定血小板的CD41、CD42b、CD61及CD62p的表达水平。结果表明:海藻糖单独应用对提高回收率的保护作用不强,但海藻糖处理后冷冻保存的血小板的形态接近正常。DMSO在保证冷冻保存血小板的回收率和血小板整体完好性方面作用较为突出,但其血小板形态偏向于肿胀,仍有部分血小板呈异形性改变。DMSO和海藻糖合用对维持血小板外部形态和内部结构接近正常稳态方面具有保护作用,同时保证冷冻保存血小板具有理想的回收率和较高的CD41、CD42b、CD61、CD62p表达水平。结论:DMSO和海藻糖联合应用对冷冻保存血小板具有协同保护作用,但DMSO和海藻糖单用或合用都较难抑制冷冻保存血小板的活化,两者合用作为血小板冷冻保护剂有望促使冷冻保存血小板临床输注效果的进一步提高。

Notch信号通路是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一,调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化,是造血微环境调节造血细胞增殖与分化的重要信号通路,与多种血液系统恶性肿瘤的发病有关。多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是以浆细胞克隆性增殖为特征的B系肿瘤。由于骨髓瘤细胞的增殖比例低及多药耐药的形成,因此其对常规剂量的化疗药耐药,使得MM的临床治疗仍十分困难。近年来的研究发现,多发性骨髓瘤病人肿瘤细胞和骨髓瘤细胞株都大量表达Notch的配体Jagged-2,而正常的浆细胞或是其它恶性疾病来源的病人肿瘤细胞低量表达Jagged-2。Jagged-2可诱导基质细胞分泌白介素6(IL-6)、血管内皮生长因子(vascular factor1,IGF-1)。Notch信号通路激活后可通过与NF-κB,C-myc的相互作用,调节细胞的增殖,促进骨髓瘤细胞的生长,从而抑制骨髓瘤细胞的凋亡,它与骨髓瘤的发生和耐药有关。抑制Notch信号通路能诱导骨髓瘤细胞的凋亡,增强化疗药的细胞毒作用。研究表明,单独使用Notch信号通路的特异性化学抑制剂γ-分泌酶抑制剂(γ-secretase inhibitors,GSI)可通过特异性阻滞Notch信号通路从而诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并且与传统化疗药物联合应用可以增强骨髓瘤细胞对化疗药的敏感性。本文就Notch信号通路的组成、Notch信号通路的作用机制及Notch信号通路与多发性骨髓瘤的关系进行综述。

B细胞产生抗体需要T细胞辅助。最近研究发现一种命名为滤泡辅助T细胞(TFH)的T细胞亚群,它们被认为是B细胞最主要的辅助细胞,是淋巴组织中最常见和最重要的效应T细胞亚群之一。TFH与Th1和Th2存在明显差别,其趋化因子受体表达为CXCR5,定位和迁移于B细胞滤泡,具有辅助B细胞功能。TFH细胞分泌辅助细胞因子IL-21,通过与B细胞上IL-21R结合,使之分化为产生抗体的细胞。TFH细胞功能调节异常或TFH细胞相关分子表达异常,可能与某些自身免疫性疾病、免疫缺陷病和恶性肿瘤的发病机制有关。本文就CXCR5和TFH细胞的发现、TFH细胞的起源与TFH细胞功能相关的细胞因子,TFH效应细胞和记忆细胞的迁移和定位、TFH细胞异常与疾病等问题进行了综述。

淋巴瘤是发生于淋巴造血系统的恶性肿瘤。建立成熟稳定的动物模型在淋巴瘤病变机理前瞻性研究及进行有效临床治疗的药理研究中占据十分重要的地位。现对淋巴瘤各类动物模型的建立方法、模型特点及其应用等方面进行综述。

DNA甲基化是一种在DNA序列不变情况下的DNA生物修饰方式。一般来说,基因表达水平与DNA甲基化呈负相关,异常CpG岛的甲基化可诱导基因沉默。去甲基化治疗就是用药物清除启动区的甲基,使因高甲基化而关闭的抑癌基因重新表达,达到治疗肿瘤的目的。去甲基化治疗作为一种新的治疗途径可能对防止恶性血液病化疗耐药及复发有一定作用。本文对DNA甲基化的机制、DNA甲基化异常与恶性血液病的关系、DNA去甲基化治疗的机理以及恶性血液病(急性、慢性白血病、淋巴瘤以及骨髓增生异常综合征)去甲基化治疗的研究进展进行了综述。