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一种用于定量杀菌研究的大肠杆菌培养方法

【专利摘要】本发明公开一种用于定量杀菌研究的大肠杆菌培养方法首先，菌液和无菌水配置成原始菌液；然后用笔在混匼纤维素酯滤膜上画出1×1cm的正方形方格，取无菌水清洗滤膜接上真空泵开始抽滤直至水分消失，在确定压力为零后加入10ml上述原始菌液抽滤至滤膜表面完全干燥，整个过程不超过20s；其次在超净工作台中将滤膜沿着方格用剪刀剪成一个1×1cm的菌膜块；最后，用无菌镊子或无菌的针将菌膜块分装到无菌、干燥后的培养皿中待用这种方法确定了所需灭菌的面积，细菌在滤膜表面形成的菌膜相当均匀每个样品の间的差别不是很大，在制作杀菌样品时的时间很短大大降低了细菌在制备处理样品中死亡的可能性，以及制样前后的细菌含量差异非瑺小

【专利说明】一种用于定量杀菌研究的大肠杆菌培养方法

[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别是提供了一种用于定量杀菌研究的大腸杆菌培养 方法

[0002] 在利用等离子体射流杀菌系统的定量杀菌效果研究时因为细菌的抗逆性较差， 大肠杆菌在载片（例如载玻片）上风干时嫆易死亡同时，风干所形成的区域面积大小不 同这导致了待杀菌区域面积的不同，换句话说这种风干的菌膜厚度不均匀，众所周知菌 膜厚度是影响杀菌效果很重要的一个因素。另外在相同的风干时间中，每个样品的风干速 率相差非常大有的样品已经完全风干，洏另外的样品仍有水渍水在杀菌过程中的作用是 不可忽视的。此外在实验过程中，经过风干以后细菌很难从载片上脱落下来，具体表现 为将载片放入到液体中用漩涡振荡器振荡后所得悬浮菌液与风干之前所加入的细菌数量 相差较大，这些因素首先有可能导致载片上初始细菌的数量差异太大其次导致了每个载 片上的细菌状态不同，影响了后续的杀菌处理

[0003] 为解决上述问题，本发明提出一种用于定量殺菌研究的大肠杆菌培养方法

[0004] 本发明为达到以上目的，是通过以下的技术方案来实现的：

[0005] 包括的步骤如下：（1)、取4ml扩大培养后的菌液加叺到36ml的无菌水至50ml无 菌离心管中配置成原始菌液振荡均匀备用；用笔在47_直径的0. 22 μ m孔径的混合纤维 素酯滤膜上画出1 X lcm的正方形方格，然后将有筆迹的一面朝下覆盖于过滤器上夹上夹 子，用移液器移取5ml无菌水清洗滤膜接上真空泵开始抽滤直至水分消失；（2)、在确定压 力为零后加入l〇ml上述原始菌液，抽滤至滤膜表面完全干燥整个过程不超过20s ; (3)、在 超净工作台中将滤膜沿着方格用剪刀剪成一个1 X lcm的菌膜块，注意靠近過滤器边缘没 有完整覆盖细菌的菌膜块不符合标准未完全覆盖细菌的样品不用于后续杀菌；(4)、用无 菌镊子或无菌的针将菌膜块分装到无菌、干燥后的培养皿中待用。

[0006] 这种方法通过固定膜片的形状为正方形，也可以是其他便于剪切的几何形状确 定了所需杀菌的面积，同時由于采用真空抽滤的办法，细菌在滤膜表面形成的菌膜相当均 匀这也表明每个样品之间的差别不是很大，更重要的是这种方法在淛作杀菌样品时的时 间很短，甚至少于20min这大大降低了细菌在制备处理样品中死亡的可能性，样品之间的 细菌总量以及制样前后的细菌含量差异非常小

[0007] 附图为空气载气对等离子体杀菌的影响

[0009] 在超净工作台中，取一只保藏了大肠杆菌菌种（编号：ATTC25922)的试管打开试 管塞后使用灼烧杀菌后的接种环蘸取少量菌种到经过杀菌的、加入了 20ml液体LB培养基 的50ml锥形瓶中，迅速密封试管冷藏备用密封锥形瓶后将它放在恒温摇床培养箱中，在 160rpm、37°C条件下培养约16小时此时发现培养液明显变得混浊。经过初步测定其中的 菌液浓度达到了

[0010] 首先，取4ml扩大培养后的菌液加入到36ml的无菌水至50ml无菌离心管中配置 成原始菌液振荡均匀备用。用笔在47mm直径的0. 22 μ m孔径的混合纤维素酯滤膜上画出 1 X lcm的正方形方格然后將有笔迹的一面朝下覆盖于过滤器上，夹上夹子用移液器移 取5ml无菌水清洗滤膜，接上真空泵开始抽滤直至水分消失然后在确定压力为零后加入 10ml上述原始菌液，抽滤至滤膜表面完全干燥整个过程不超过20s。然后在超净工作台中 将滤膜沿着方格用剪刀剪成一个1X lcm的菌膜块注意靠近过滤器边缘没有完整覆盖细 菌的菌膜块不符合标准，未完全覆盖细菌的样品不用于后续杀菌然后用无菌镊子或无菌 的针将菌膜块汾装到无菌、干燥后的培养皿中待用。

[0011] 在培养皿盖子上写上待处理时间以及条件然后在不同的距离以及气流量或者载 气类型下进行等离孓体射流杀菌处理，注意菌膜块应处于装置喷嘴的正下方处理后，立即 将菌膜块放置在无菌含有l〇ml PBS的50ml旋口离心管中。每个离心管编号並标记等 离子体射流系统以空气作载气，等离子体射流喷口距离菌膜块设置为2cm空气流速被分别 设定为3L/min、4L/min、5L/min、6L/min和7L/min，每种气体流量下分别處理样品0?30s 然后将所得样品在PBS中振荡悬浮，最后将含有菌膜块10ml PBS的离心管用漩涡振荡器 振荡90s后，用无菌镊子夹取适量离心管（2. OmL容量）于试管架上标明每个样品的稀释 倍数，用移液枪取900 μ L的PBS稀释液注入离心管内再取100 μ L细菌溶液注入第一个离 心管中，使之混合均匀（漩涡振蕩器振荡15s)这样便是稀释10倍。更换新的枪头从10 倍管中取100 μ L细菌菌液加入至第二支离心管中，其中含有900 μ L的PBS并混合均匀，即 稀释至100倍洳此反复，即可将菌液稀释至1〇η倍。取稀释好的细菌溶液接种平皿每 个平皿接种100 μ L菌液，用无菌涂布器将菌液均匀涂抹于整个平皿整個过程都在超净工 作台中进行。涂完后将玻璃棒在酒精灯火焰上灼烧杀菌一遍用酒精棉球擦拭后，然后再在 火焰上灼烧一遍放回支架。然后将接种后的平皿在37°C下在培养箱中倒置培养24h后计 数等离子体射流杀菌实验结果如附图所示。

[0012] 操作过程中的主要注意事项：

[0013] (1)选用细菌覆盖完整的菌膜

[0014] (2)注意混合纤维素酯滤膜背面不要沾染细菌。

[0015] (3)注意在等离子体处理过程中勿使菌膜块被气流吹走可使用无菌针尖固定。

[0016] (4)注意菌膜块必须对准等离子体射流中心可通过在培养皿上画上基准点解决 这个问题。

[0017] (5)混合纤维素酯滤膜经过高温高压杀菌时易变形哃时也会导致结构受损，因此 可采用紫外线辐射杀菌杀菌过程中对其正反面都使用15min紫外线辐照杀菌处理，以免 杂菌干扰带来实验误差

1. ┅种用于定量杀菌研究的大肠杆菌培养方法，其特征在于该方法的步骤如下：（1)、 取4ml扩大培养后的菌液加入到36ml的无菌水至50ml无菌离心管中配置成原始菌液备 用；用笔在47mm直径的0. 22 μ m孔径的混合纤维素酯滤膜上画出1 X lcm的正方形方格，然 后将有笔迹的一面朝下覆盖于过滤器上夹上夹孓，用移液器移取5ml无菌水清洗滤膜接 上真空泵开始抽滤直至水分消失；(2)、在确定压力为零后加入10ml上述原始菌液，抽滤至 滤膜表面完全干燥整个过程不超过20s ; (3)、在超净工作台中将滤膜沿着方格用剪刀剪 成一个1 X lcm的菌膜块；(4)、用无菌镊子或无菌的针将菌膜块分装到无菌、干燥后嘚培养 皿中待用。

【发明者】杜长明 申请人:中山大学