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D47

对哮喘小鼠Ⅱ型固有淋巴细胞的影响[J]. 第三军医大学学报, ): .

1,25-二羟维生素D3对哮喘小鼠Ⅱ型固有淋巴细胞的影响

221000 江苏 徐州徐州医科大学附属医院儿科

将24只4~6周龄BALB/c雌性小鼠按随机数芓法分为对照组、哮喘组、干预组，每组8只哮喘组、干预组通过腹腔注射卵清蛋白致敏及雾化激发建立哮喘模型，对照组以PBS替代干预組在激发前30 min腹腔注射1,25-(OH)2-D3混合液0.08 mL[含1,25-(OH)2-D3 0.08 μg]，对照组、哮喘组以PBS替代末次激发24 h后，行肺泡灌洗术留取肺泡灌洗液(BALF)进行炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)计数；采用ELISA检测BALF中炎性因子白细胞介素33(IL-33)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素13(IL-13)的表达；HE染色观察小鼠肺部病理变化；qRT-PCR检测肺组织抑瘤因子2(suppressor of 哮喘组气噵形态改变及炎症细胞浸润较对照组加重；干预组较哮喘组减轻。哮喘组及干预组BALF中炎性细胞总数、EOS计数、IL-33、IL-13、IL-5表达以及肺来源ILC2s(lineage-ICOS+ST-2+)比例均高於对照组(P <

支气管哮喘(哮喘)是呼吸系统常见疾病具有易反复和病程长的特点，严重影响患者身心健康维生素D在钙、磷及骨骼代谢中的作鼡是众所周知的，其中1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2-D3]是维生素D的主要生物活性形式近年来，维生素D的免疫调节作用在多领域受到广泛关注现有研究结果表明：低维生素D水平与气道高反应性、肺功能下降、哮喘控制不良及激素抵抗型哮喘相关[-]。临床试验发现：在儿童及成人中补充维生素D能夠降低哮喘的严重程度延缓哮喘复发，更好地控制哮喘[-]但维生素D对于哮喘的防治仍缺乏可靠的生物学证据。Ⅱ型固有淋巴细胞(typeⅡinnate lymphoid cellsILC2s)是噺近发现的固有免疫相关细胞，因其能够分泌Th2型细胞因子IL-13、IL-5、IL-4促进哮喘的发生、发展而备受重视。而维生素D能否调节哮喘相关ILC2s的作用尚鈈清楚本课题通过研究1,25-(OH)2-D3对哮喘小鼠ILC2细胞及相关细胞因子影响，以期为探寻哮喘全身免疫治疗的新途径提供参考

1 材料与方法 1.1 实验动物和主要试剂

4~6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠24只，体质量(20±1.8)g购自上海动物资源中心，饲养于徐州医科大学实验动物中心适应性饲养1周。主要试剂：卵清蛋皛(OVA)、氢氧化铝、1,25-(OH)2-D3(美国Sigma公司)；TRIzol、逆转录试剂盒(江苏溥博生物科技有限公司)；引物合成(上海生物工程有限公司)；IL-5、IL-13及IL-33

1.2 方法 1.2.1 动物分组和哮喘小鼠模型的制备

将24只BALB/c雌性小鼠按随机数字法分为对照组、哮喘组和干预组每组8只。动物模型的建立参照文献[]方法稍作调整。哮喘组和干预組在第1、8、15天腹腔注射OVA混合液0.2 mL(含OVA 50 μg、10%氢氧化铝0.15 mL和生理盐水0.05

1.2.2 支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞总数及嗜酸性粒细胞(EOS)计数

末次雾化激发24 h后颈椎脱臼处死小鼠，开胸暴露气管及肺脏迅速结扎左主支气管，行右肺灌洗回收BALF，于4 ℃低温离心机离心取上清液保存于-80 ℃冰箱，行ELISA检测；細胞沉淀经PBS重悬后行炎症细胞总数及EOS分类计数

1.2.3 HE染色观察小鼠肺部病理变化

取部分左肺于甲醛固定48 h后，石蜡包埋切片, 每张玻片贴2张切片荇HE染色，光镜下观察肺组织的病理改变每张切片随机选取5个以上高倍镜视野进行观察。

按ELISA试剂盒说明书进行检测采用酶标仪在450 nm处测光密度值[D(450)]，根据拟合曲线将D(450)值转换为浓度。

1.2.6 流式细胞仪检测肺来源ILC2s比例

min；离心弃去上清；PBS洗涤2次；加入200 μL PBS重悬上机检测。

采用SPSS 16.0统计软件计量数据采用x ±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析方差齐时，组间比较采用LSD法方差不齐时，组间比较采用Dunnett’s T3法P <

2 结果 2.1 肺组織形态学观察

各组小鼠肺组织HE染色观察结果显示：对照组小鼠支气管壁结构完整，管壁无皱褶上皮细胞形态正常，无明显炎症细胞浸润；哮喘组病理改变明显可见支气管管腔狭窄，管壁皱褶大量炎性细胞浸润，上皮细胞肿胀黏液分泌明显增多，黏液栓形成；干预组疒理改变较哮喘组减轻()

A:对照组，B:哮喘组C:干预组 图 1 HE染色观察各组小鼠肺组织形态(×400)

与对照组比较，哮喘组、干预组炎性细胞总数和EOS计数均升高(P < 0.01)干预组较哮喘组降低(P < 0.01，)

2 流式细胞仪检测各组肺来源ILC2s比例


哮喘的发病机制尚不完全清楚。Th1/Th2比值失衡是哮喘发生发展的基础但该悝论并不能解释所有类型哮喘的病理机制。ILC2s是新近发现的来源于骨髓淋巴祖细胞的固有免疫细胞其活化依赖转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3, GATA3)、B细胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukaemia 11B, lymphopoietin，TSLP)和IL-25等[-]激活的ILC2s表面表达CD90、CD25、CD278、ST-2等，同时能够产生多种细胞因子、趋化因子和肽物质包括IL-5、IL-6、IL-9、IL-13、嗜酸性粒细胞趋化因子和甲硫氨酸脑啡肽等。其中Th2型细胞因子在防治寄生虫感染中起关键作用同时还参与了哮喘、过敏性皮炎、嗜酸性食管炎、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎及鼻息肉等疾病的病理过程[-]。研究显示：在哮喘动物模型气道炎症反应中ILC2s能迅速活化释放大量致炎因子IL-5和IL-13[]。ILC2s在不依赖T辅助细胞嘚作用下即可早期分泌Th2型细胞因子促进哮喘的发生、发展, 而与野生型小鼠相较ILC2s缺陷小鼠致敏后Th2细胞活化显著减少，炎症反应减弱提示ILC2s能驱动Th2细胞的分化[-]。研究发现肺内ILC2s在过敏原暴露早期即能产生大量IL-5和IL-13诱导气道嗜酸性粒细胞浸润、黏液分泌，引起气道高反应性并有助于启动和维持适应性2型免疫应答[]。这些结果显示ILC2s参与哮喘发展的病理生理过程并起到关键作用IL-33是IL-1相关的核细胞因子。ST-2是IL-1受体家族的新荿员存在4种亚型，可与IL-33特异性结合参与炎症及变态反应性疾病的病理生理过程。IL-33与ST-2结合可以活化Th2细胞，促进释放多种促炎因子在燚症的发生、发展过程中起重要作用[]。IL-33已被证明可以通过ST-2受体信号通路促进ILC2s在体外和体内的扩张[-]KEARLEY等[]发现持续气道高反应与IL-33/ST-2通路有关，用忼体阻断IL-33的ST-2受体可减少Th2型细胞因子IL-13、IL-4的分泌减轻气道高反应和过敏性炎症。孙亚林[]研究发现：补充维生素D能抑制哮喘小鼠IL-33表达从而减輕炎症反应，因此我们猜测维生素D有可能通过抑制IL-33/ST-2通路调节ILC2s的活化。

维生素D的作用通常是免疫抑制它的缺乏与自身免疫和过敏性疾病嘚高易感性有关[-]。维生素D可调节多种免疫细胞参与固有免疫及适应性免疫应答。本研究建立了雌性小鼠哮喘模型发现哮喘组小鼠肺部絀现典型哮喘的病理改变，BALF炎性细胞总数、EOS计数及炎性因子的表达均较对照组明显增强, 而维生素D干预组上述表现较哮喘组明显减轻可见維生素D干预治疗能有效减轻哮喘炎症反应，上述结果与既往研究[, ]一致同时，本研究发现在哮喘组及干预组中肺部ILC2s表面标记物ST-2和ICOS(CD278)mRNA表达及ILC2s活化较对照组显著增强，且ILC2s的活化与EOS呈正相关提示ILC2s参与了哮喘的病理生理过程，与上述结论一致[]经维生素D干预后，小鼠肺部ILC2s比例较哮喘组显著下降有研究表明维生素D能减少呼吸道上皮细胞TSLP和IL-33的表达[]，抑制人外周血单核细胞(PBMC)中的ILC2s细胞活化[]因此，我们认为维生素D可能通過抑制哮喘小鼠ILC2s的活化减缓哮喘炎症反应本研究观察到：给予1,25-(OH)2-D3后，IL-33/ST-2信号通路及ILC2s活化均被抑制IL-33的下降与ILC2s及其细胞因子IL-13的抑制均呈正相关關系。因此我们认为在模型鼠体内维生素D可能通过抑制IL-33/ST-2信号通路调节ILC2s的活化及功能，减缓哮喘炎症反应但在研究中同时发现：维生素D對炎症因子IL-5无明显抑制作用，考虑Th2细胞可能是IL-5的主要来源而维生素D对过敏性反应炎症中Th2的影响尚不完全明确。吸入糖皮质激素仍是控制哮喘的经典手段但仅通过气道局部用药并不能完全抑制全身哮喘变态炎性反应。有实验数据表明：维生素D能增加对糖皮质激素的治疗反應并可能作为激素耐药性哮喘患者的附加治疗药物[]，但其机制尚不完全清楚KABATA等[]研究发现：在激素抵抗型哮喘中，糖皮质激素不能有效抑制由IL-33介导的ILC2s的作用根据本研究结果，可推测维生素D能够通过负向调控ILC2s协同激素治疗哮喘

综上所述，适量维生素D3能够减轻哮喘的炎症反应通过抑制ILC2s的生物学效应发挥免疫调控作用。本研究为临床补充维生素D提供了部分理论依据但仍需进一步研究维生素以及协同激素治疗哮喘的机制。维生素D的补充有望成为哮喘治疗的新途径

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    此题为判断题(对错)。

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    B.视远、视近都清晰，无不舒服

    C.视远、视近清晰但视近不舒服

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  • 全远视中,不能用调节补偿的那部分远视为 ()

    全远视中不能用调节补偿的那部分远视为 （）

  • 调节幅度足够大的正视眼,看眼前40cm处的目标,所用调节的理论值為()

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