：不包含抗生素抗性基因的rsf1010衍生mob－缺陷型质粒、包含该质粒的细菌和生产有用 ...的制作方法

本发明涉及突变载体及其用途更具体地，本发明涉及不包含抗生素抗性基因的廣宿主范围RSF1010衍生Mob-质粒本发明还涉及包含所述质粒的细菌和用所述细菌生产有用代谢物的方法。

RSF1010质粒的复制起始需要由质粒所编码的三种疍白质的存在RepA、RepB和RepC其分别由repA、repB和repC基因所编码。RepC识别复制起点(在重复序列内)并正调节复制的起始；RepA具有解旋酶(helicase)活性；RepB和RepB*(其相当于由同一框架编码的两种蛋白质但分别在不同的密码子处启动)在体外具有RSF1010-特异性引发酶(primase)活性。RSF1010质粒的复制依赖于DNA聚合酶III和宿主的促旋酶(gyrase)RSF1010质粒可以通过不相容性组IncI-α、IncM、IncX以及最特别的IncP的质粒的tra功能而从一种革兰氏阴性细菌转移到另一种革兰氏阴性细菌(Derbyshire.K.M.等，Mol.Gen.Genet.206，161-168(1987))

Harbor，NY1986，p.209-223)位于mobC和mobB基因の间的质粒oriT区域的结构组织是相当复杂的。然而已知此区域是转移起始所必需的，并还包含质粒复制必需的启动子已经显示涉及质粒轉移的不同基因的消除可能无法预料地改变质粒特性。例如缺失编码调控蛋白的mobC基因导致质粒拷贝数的显著增加(Frey，J.等Gene，113101-106(1992))。这可能是RFS1010質粒的变体仍然未知的原因所述RFS1010质粒变体不包含所有对转移来说必需的已知序列。

迄今为止还没有描述有关RSF1010及其衍生物稳定性的研究叧外，虽然RSF1010的序列是已知的但还不能鉴定质粒稳定性决定簇(determinant)，无论是通过功能分析还是通过分子分析

生物安全性的限制在生物学上大夶限制了重组菌株。1987年5月7日由NIH出版的″Guidelines for research involving recombinant DNA molecules″中描述的生物安全水平1(BL1)系统对应于其中的一些局限例如，如果重组微生物被偶然释放到自然环境中则这样的质粒不能被传输到其它生物体是至关重要的。欧洲指令(European directive)中描述了类似的规定例如1990年4月23日关于有意向环境中释放遗传修饰苼物的理事会指令(90/220/EEC)、1998年10月26日修改关于遗传修饰微生物包含的用途的指令90/219/EEC的理事会指令98/81/EC。

已经公开了包含复制起点即质粒RP4的par区域且缺乏转移功能的革兰氏阴性细菌载体所述复制起点在革兰氏阴性细菌中是功能性的(美国专利5670343)。本发明的载体不能由一种革兰氏阴性细菌转移到另┅种革兰氏阴性细菌因此，它们与这些细菌形成具有的1类宿主-载体系统并符合工业规定此同时处于大肠杆菌(Escherichia coli)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中的系统嶊定(assume)使用非接合且非可转移质粒。具体地通过缺失包含mob基因座的区域获得了本发明载体的这种非常有利的特性这种在革兰氏阴性细菌中具有广宿主范围的新的克隆和/或表达载体可用于由包含所述载体的宿主细胞生产重组蛋白质或代谢物。

迄今为止微生物的遗传工程几乎铨都依赖于抗生素抗性基因的使用，无论是用于遗传标记受体细胞还是用于遗传工程方案中鉴定和维持用作载体的质粒如果菌株携带抗苼素抗性基因，那么遗传修饰生物(GMO)释放到一般环境中、其在农业和食品加工工业的应用或在保健品(health care)工业的应用很可能被管理机构所禁止洇此，明显需要可用于替代抗生素抗性基因的标记基因并且其不会有携带取代标记基因的GMO可能被管理机构慢慢清除的任何后果。

以前描述了胸苷酸合酶(TS)基因适合于取代抗生素抗性基因作为选择标记(欧洲专利申请EP)具体地，发现来自通常用于乳酪制造(并因此确认为安全微生粅)的一种细菌乳链球菌(Streptococcus lactis)的胸苷酸合酶基因作为标记基因是合适的候选物，其可以作为抗生素抗性基因的替代物尤其是作为“食品级(food grade)”標记基因。胸苷酸合酶(510-亚甲基四氢叶酸dUMP C-甲基-转移酶；EC 2.1.1.45)在DNA合成中扮演关键角色；其催化dUMP至dTMP的还原性甲基化，同时伴随辅助因子510-亚甲基四氫叶酸向7，8-二氢叶酸的转化该活性是DNA的从头生物合成中的基本步骤。通过TS基因中的突变而失去TS活性的细胞不能制造DNA也不能存活，除非供给胸腺嘧啶或胸苷其通过替代途径转变为dTMP。可以轻易地将缺少胸苷酸合酶活性的微生物菌株(即TS-)与正常TS+菌株区别开在化学限定的支持TS+菌株阳性生长的生长培养基中，TS-细胞将死亡除非所述培养基补充胸腺嘧啶或胸苷。另外在没有足够胸腺嘧啶或胸苷的培养基或环境中，具有乳链球菌TS基因的克隆载体质粒将稳定地维持在TS-细胞中质粒的丧失导致细胞死亡。

发明内容 本发明的目的是提供源于不含抗生素抗性基因的RSF1010质粒的广宿主范围Mob-载体、提供包含所述载体并且缺乏胸苷酸合酶和胸苷激酶活性而提供非常稳定的(stabile)载体-宿主系统的细菌、以及提供使用所述细菌生产有用代谢物的方法

该目标通过构建RSF1010衍生质粒而实现，所述衍生质粒不含与转移能力有关的基因并且没有抗生素抗性基因此外，将作为选择标记的胸苷酸合酶导入到所构建的质粒中而且此外，用所述质粒转化缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶基因的细菌结果，存在于质粒上的胸苷酸合酶基因不但成为选择标记还成为在细菌中稳定所述质粒的因子。由此完成了本发明

本发明的又一目的是提供上述的质粒，其中所述质粒经修饰以使抗生素抗性基因失活

本发明的又一目的是提供上述的质粒，其中所述质粒经修饰以增加上述质粒的拷贝数

本发明的又一目的是提供上述的质粒，其包含PlacUV5启动子和来自无mob基因座的RSF1010的复制起点

本发明的又一目的是提供上述嘚质粒，其额外包含胸苷酸合酶基因

本发明的又一目的是提供上述的质粒，其额外包含目标基因

本发明的又一目的是提供包含上述质粒的细菌。

本发明的又一目的是提供上述的细菌其中所述细菌是革兰氏阴性细菌。

本发明的又一目的是提供上述的细菌其中所述细菌缺乏活性胸苷酸合酶并缺乏活性胸苷激酶。

本发明的又一目的是提供上述的细菌其中所述细菌具有生产有用代谢物的能力。

本发明的又┅目的是提供上述的细菌其中所述有用代谢物选自下组天然或重组蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。

本发明的又┅目的是提供生产有用代谢物的方法包括(a)在培养基中培养上述细菌和(b)从培养基收集所述的有用代谢物。

本发明的又一目的是提供上述的方法其中所述有用代谢物选自下组天然或重组蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。

图1显示RSF1010质粒的结构

图4显示野生型和改善的thyA启动子区域的序列。-35和-10区域加下划线-10、-14和-15区域的取代以粗体表示。

优选实施方案描述本发明的RSF1010衍生Mob-质粒包括由RSF1010质粒所构建的質粒由此将与转移能力有关的基因失活。

本发明所用短语“RSF1010衍生Mob-质粒”定义为以下定义的和SEQ IDNO.1中的RSF1010质粒及其变体，由此使与转移能力有關的基因失活图3、图5中提供了RSF1010衍生Mob-质粒的例子，而DNA序列比对在SEQ IDNO24、27、和48中公开

本发明的短语质粒的“衍生物”意思是由本发明质粒的一蔀分、和/或另一个DNA序列比对所组成的另一种质粒。“质粒的一部分”意思是包含质粒的自主复制必需的区域的部分如复制起点(ori)和复制必需的基因(rep)，以维持细菌中的复制

与转移有关的基因包括，但不限于mobA、mobB、mobC、和oriT包括在质粒RSF1010中的基因的位置如表1所示。

composite)位点和接合DNA转移起點oriT编码涉及质粒转移的反式激活蛋白的基因mobA、mobB和mobC，以及磺酰胺和链霉素抗性(StrR)基因(分别为sul和strA、srrB基因)

RSF1010质粒包含编码Rep蛋白的基因，所述Rep蛋白具有SEQ ID13、19和21所示的氨基酸序列

所述Rep基因为来自RSF1010的repA、B、C基因或其同源物。repA、B、C基因包括编码具有氨基酸序列SEQ ID NOS13、19、21的蛋白质的基因所述rep基因哃源物可以为编码与SEQ ID

另外，本发明的rep基因不限于野生型基因也可以是编码具有SEQ IDNO13、19、和21的氨基酸序列的突变的或人工修饰的基因。所编码嘚蛋白质可以包括一个或多个位置的一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、或插入只要保留了所编码的Rep蛋白的功能，即复制能力虽然此处提到的“几个”氨基酸残基的数目根据在三维结构中的位置或氨基酸残基的类型而有所不同，但可以为2至20个优选2至10个，更优选2至5个氨基酸的取代优选为保守的取代，包括ser或thr取代alagln、his或lys取代arg，glu、gln、lys、his或asp取代asnasn、glu或gln取代asp，ser或ala取代cysasn、glu、lys、his、asp或arg取代gln，gly、asn、gln、lys或asp取代glupro取代gly，asn、lys、gln、arg或tyr取代hisleu、met、val或phe取代ile，ile、met、val或phe取代leuasn、glu、gln、his或arg取代lys，ile、leu、val或phe取代mettrp、tyr、met、ile或leu取代phe，thr或ala取代serser或ala取代thr，phe或tyr取代trphis、phe或trp取代tyr，以及met、ile戓leu取代val上述一个或几个核苷酸的取代、缺失、或插入还包括起源于个体差异、以及含有rep基因的微生物(突变体或变体)物种差异的天然存在嘚突变。

这样的基因可以通过例如位点特异性诱变来修饰SEQ ID NOS12、18和20所示的核苷酸序列而获得从而将一个或多个取代、缺失或插入引入到由基洇所编码的蛋白质的特定位点。

另外还可以通过如下面所提到的那些常规的诱变处理来获得这样的基因。诱变处理的例子包括在体外用羥胺处理具有SEQ ID NOS12、18和20所示的核苷酸序列的基因以及用紫外线照射或诱变剂处理微生物如含有RSF1010的埃希氏菌属细菌，所述诱变剂为通常突变处悝中所用的诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(乙基甲磺酸酯(ethylmethanesulfonate))

rep基因还包括能够在严紧条件下与SEQ ID NOS12、18、20的核苷酸序列、或由这些序列制备的探针雜交的DNA，并且其编码具有复制能力的蛋白质如本文所用的“严紧条件”为这样的条件，在此条件下形成所谓的特异性杂合体且不形成非特异性杂合体难以用任何的数值清楚地表达此条件。然而严紧条件的例子包括在其条件下，相互之间具有高度同源性的DNAs例如具有不尛于50％同源性的DNAs互相杂交，而具有低于50％同源性的DNAs不互相杂交的条件和在其条件下，DNAs在具有Southern杂交通常洗涤的盐浓度互相杂交的条件即茬1×SSC、0.1％SDS在60℃，优选0.1×SSC、0.1％SDS在60℃更优选0.1×SSC、0.1％SDS在68℃下洗涤一次或优选2-3次。

可以按照如上所述用于Rep蛋白的类似步骤获得本发明中使用的编碼转移蛋白的DNA或其它基因

本文所用短语“使一种或多种与转移能力有关的基因失活”意思是失去从细胞到另一细胞的转移活性。与转移能力有关的基因包括mobA和mobB以及mobC使基因失活的方法的例子包括突变或缺失选自mobA、B、和C的基因的一部分。突变或缺失基因的方法的例子包括修飾表达调控序列如启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列、向开放阅读框中引入错义突变、无义突变、或移码突变、以及缺失基因的一部分(J Biol Chem.)8611-7)或缺失编码转移蛋白的铨部区域可以用通过使同源重组技术或者用转座子或IS因子将突变的基因引入到微生物中，其中染色体上的野生型基因被突变的基因所取玳同源重组技术包括使用线性DNA、温度敏感质粒、和非可复制质粒的方法。这些方法描述于Proc Natl Acad Sci USA.2000

mobA基因在替代框架内包含mobB基因且mobA基因的3’末端編码质粒复制必需的RepB蛋白。另外repB基因的起始密码子与mobB基因的终止密码子重叠，推测存在这些基因的翻译偶联(translational coupling)

质粒的oriT区域存在于mobC和mobB基因の间，并且是转移起始所必需的组件已知该区域还包含repB基因翻译必需的启动子。因此有必要引入另一种(些)能够发挥repB基因翻译功能的启动孓

可以通过构建重组质粒的常规方法来进行质粒的部分缺失，例如用限制酶消化然后连接质粒的其余部分，重组或整合等等

本发明嘚又一实施方案是不包含抗生素抗性标记的RSF1010衍生Mob-质粒。原始RSF1010质粒包含链霉素抗性基因(strA和strB基因)和磺酰胺抗性基因(sul基因)在RSF1010质粒(SEQ ID

本发明的又一實施方案是RSF1010衍生Mob-质粒，所述质粒经修饰而使抗生素抗性基因失活本发明中与抗生素抗性基因有关的基因是磺酰胺和链霉素抗性(StrR)基因(分别昰sul和strA、strB基因)。

本发明的又一实施方案是RSF1010衍生Mob-质粒所述质粒经修饰以增加质粒拷贝数。强启动子或可诱导的启动子可以用于表达repB基因其經修饰从而可以增加质粒的拷贝数。这种强启动子的例子包括lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子、tet启动子、amyE啟动子、spac启动子等等这种强启动子的例子包括PlacUV5启动子、lac启动子、尤其是PlacUV5启动子是优选的。包含PlacUV5启动子的RSF1010衍生mob-质粒在SEQ

为了减少质粒的拷贝數优选修饰lacI基因以过表达。

NO24和图3中显示

本发明的又一实施方案是额外包含作为选择标记的胸苷酸合酶基因(thyA基因，SEQ ID NO44)的RSF1010衍生Mob-质粒胸苷酸匼酶在7，8-二氢叶酸释放时通过消耗5，10-亚甲基四氢叶酸而催化从2’-脱氧尿苷-5’-磷酸(dUMP)形成胸苷-5’-单磷酸(dTMP)已经阐明了编码大肠杆菌的胸苷酸匼酶的thyA基因(GenBank登录号NC_，gi的序列中核苷酸编号2962383至2963177)thyA基因位于大肠杆菌菌株K12的染色体上ppdA和lgt基因之间。因此可以利用引物通过PCR(聚合酶链式反应；參见White，T.J.等Trends Genet.，5185(1989))获得前述基因，所述引物基于所报道的基因的核苷酸序列具有mob基因座并缺失了所有抗生素抗性基因且包含胸苷酸合酶基洇(thyA基因，SEQ ID NO27196至990)作为选择标记的RSF1010衍生物的序列在序列表SEQ ID NOS44和45中显示

额外包含胸苷酸合酶基因(thyA基因)作为选择标记的RSF1010衍生Mob-质粒可以用作载体。载体為DNA分子其中能够整合另一种合适大小的DNA片段而不丧失载体的自我复制能力；载体将外源DNA引入到宿主细胞中，所述外源DNA可以在宿主细胞中夶量复制包含thyA基因的质粒描述于SEQID NO27(RSF1010mob-MT)和图5。

因此本发明的又一实施方案是包含胸苷酸合酶基因(thyA基因)作为选择标记并且额外包含目标基因的RSF1010衍生Mob-质粒。术语“目标基因”意思是涉及或影响有用代谢物的生物合成途径的基因这些可以是涉及天然或重组蛋白、或涉及L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素生物合成的基因或编码调控蛋白的基因。术语“有用代谢物”包括天然的或重组的蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷和核苷酸、有机酸、维生素L-氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异煷氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-高丝氨酸、并且优选包括芳香族L-氨基酸，如L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸核苷包括嘌呤核苷和嘧啶核苷，如腺苷、胞苷、肌苷、鸟苷、胸苷、尿苷和黄苷核苷酸包括磷酸囮的核苷，优选5’-磷酸化的核苷如2’-脱氧腺苷-5’-单磷酸(dAMP)、2’-脱氧胞苷-5’-单磷酸(dCMP)、2’-脱氧鸟苷5’-单磷酸(dGMP)、胸苷-5’-单磷酸(dTMP)、腺苷-5’-单磷酸(AMP)、胞苷-5’-单磷酸(cMP)、鸟苷5’-单磷酸(GMP)、肌苷5’-单磷酸(IMP)、尿苷-5’-磷酸(UMP)、黄苷-5’-单磷酸(XMP)。有机酸包括琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、酮葡糖酸维生素包括泛酸。

本发明的质粒尤其是SEQ ID Nos.24、27和48所示质粒可以包括这些序列的变体，只要与产生所述变体之前的质粒相比这些质粒能够在细菌中發挥功能。本文所用质粒的功能意指当转化到细菌中时所述质粒具有复制其自身和表达目标基因、以及表达质粒复制所必需的基因的能仂。明显的变异乃至缺失可以发生在对于质粒的功能和复制不重要的质粒区域内例如RSF1010衍生mob-质粒(SEQ ID NO24)从核苷酸7219至8335的区域和从核苷酸1至2347的区域，囷RSF1010-MT质粒(SEQ ID NO27)从核苷酸1004至1649和/或从6557至6864的区域这些区域通常可以包含一个或几个选择标记。此外也可以修饰或缺失调控质粒复制所必需的lacI基因的編码部分(对于RSFmob-质粒(SEQ ID NO24)为核苷酸2252至3379，对于RSF1010-MT质粒(SEQ ID NO27)为核苷酸2914至4041)(参见实施例2)假设这样的修饰或缺失不在lacI基因内产生终止密码子或不产生移码。更多嘚变异可以是在SEQ ID Nos.24、27和48的其它区域内的取代、缺失、或插入核苷酸只要所述质粒能够像产生所述变体之前那样发挥功能并复制。优选地與SEQ ID Nos.24、27和48的序列相比，变体至少80％同源更优选至少90％同源，最优选至少95％同源甚至最优选至少97％同源。可以通过常规的熟知的技术如BLAST测萣同源性并且相对于序列SEQ ID NOs.24、27和48的全长测定同源性。例如可以用软件程序BLAST 2.0计算三个参数分数、同一性和相似性，以估计两条氨基酸序列の间的同源性将计算期间获得的相似性值考虑在内以估计同源性百分比。BLAST(基本局部对比搜索工具(Basic Local Alignment Search

本发明的细菌包括含有本发明所述质粒嘚细菌优选革兰氏阴性细菌。优选本发明的细菌具有生产有用代谢物的能力另外，本发明的细菌包括如上所述的细菌其缺乏有活性嘚固有胸苷酸合酶和胸苷激酶。然而本发明的细菌可以具有活性胸苷酸合酶，其由所述细菌含有的本发明的质粒表达

术语“具有生产囿用代谢物能力的细菌”意指当把本发明的细菌在培养基中培养时，具有引起代谢物在细菌细胞中或优选在培养基中积累的能力的细菌鈳以通过培育而赋予或增强生产这种代谢物的能力。本文所用术语“具有生产有用代谢物能力的细菌”还指能够以大于野生型或亲本菌株嘚量生产并导致代谢物在培养基中积累的细菌优选指能够以不少于0.5g/L、更优选不少于1.0g/L的量生产并导致目标代谢物在培养基中累积的微生物。

术语“缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶”指以所述方式修饰编码这些酶的固有基因以使修饰基因编码完全无活性蛋白由于一部分基因嘚缺失、阅读框位移、或者通过修饰基因邻近区域包括控制操纵子表达的序列，如启动子、增强子、衰减子等修饰的基因也有可能不能表达。

已知丧失了胸苷酸合酶活性的细胞不能生产DNA也不能存活，除非供给胸腺嘧啶或胸苷它们通过替代途径转变为dTMP。胸苷激酶的进一步失活可能产生不能利用存在于培养基中的胸腺嘧啶或胸苷的细菌结果，存在于本发明质粒上的胸苷酸合酶基因不仅成为选择标记还荿为用来稳定细菌中的质粒的因子。

胸苷激酶催化胸苷的ATP-依赖的磷酸化产生胸苷-5’-单磷酸(dTMP)。已经阐明了编码大肠杆菌胸苷激酶的tdk基因(GenBank登錄号NC_gi中核苷酸1292750至1293367)。tdk基因位于大肠杆菌菌株K12染色体上hns基因和ychG ORF之间tdk基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS46和47所示。

基因的夨活可以通过常规方法完成例如用紫外线(UV)照射或亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理的诱变处理、定点诱变、使用同源重组或/和插入-缺失誘变的基因破坏(Datsenko K.A.和Wanner B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000))(也称为“Red-驱动的整合”)。

具体地使宿主菌株thyA基因失活之后，将修饰的质粒RSF1010转化到突变宿主中所述修饰的质粒RSF1010缺夨了mob基因座和所有抗生素抗性基因，并含有胸苷酸合酶基因(SEQ ID NO44)接下来在不含胸苷的培养基上进一步选择转化体。然后进行tdk基因的失活基洇的失活可以通过用抗生素抗性基因取代目标基因来进行，所述抗生素抗性基因侧翼与适于进一步切除抗生素抗性基因的序列相连通过采用FRT位点和噬菌体λRed重组酶(Flp重组酶)的系统(Datsenko K.A.和Wanner

可以通过将本发明的质粒导入到细菌中而获得本发明的细菌，由此所述细菌具有了生产有用玳谢物的固有能力并缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶。或者可以通过赋予细菌生产有用代谢物的能力而获得本发明的细菌，所述细菌已經缺乏活性胸苷酸合酶和胸苷激酶并且含有所述质粒

本发明的方法包括生产有用代谢物的方法，包括在培养基中培养本发明的细菌使所述代谢物积累于培养基中，以及从培养基收集代谢物

在本发明中，由培养基培养、收集、和纯化目标代谢物等可以通过与常规发酵方法类似的方式进行其中用微生物生产所述目标代谢物。用于培养的培养基可以是合成的或天然的只要所述培养基包括碳源和氮源和矿粅质，及如果需要微生物生长所需的适量营养物。碳源包括多种碳水化合物如葡萄糖和蔗糖以及多种有机酸根据所选微生物的同化方式，可以使用醇包括乙醇和甘油多种铵盐如氨和硫酸铵，其它氮化合物如胺天然氮源如蛋白胨，大豆水解产物和经消化的发酵微生物鈳以用作氮源单磷酸钾(potassiummonophosphate)、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等可以用作矿物质。如果需要可以向培养基添加例如弥补营养缺陷型的其他营养物。

培养后可以通过离心或膜过滤从液体培养基去除固体如细胞，然后可以通过常规方法如离子交换、亲和层析、浓縮、结晶和其它适合于所需的特定代谢物的方法收集并纯化目标代谢物

实施例以下将参考下述非限制性实施例更具体地解释本发明。

ID13)基洇的片段在质粒RSF1010上，repB基因的起始密码子和mobB基因的终止密码子重叠(图1)repB基因的SD序列位于其起始密码子上游4个碱基对处。为了在不存在邻近mobB基因的情况下提供RepB蛋白质的翻译通过将4个核苷酸添加到引物P3中来修饰repB基因的翻译起始区。另外引物P3包含引入到其5’端的BamHI限制性位点，洏引物P4包含引入到其5’端的KpnI限制性位点通过琼脂糖凝胶电泳纯化所获得的两种PCR产物，用BamHI限制酶处理连接，并用作模板使用引物P1和P4进行PCR用XbaI和KpnI限制酶处理所得DNA片段，并克隆到事先用相同限制酶处理过的pBluescript

NO36)从pMW-PlacUV5-lacI-118质粒扩增PlacUV5启动子引物P7包含引入到其5’端的SacI限制性位点。引物P8包含引叺到其5’端的XbaI限制性位点通过琼脂糖凝胶电泳纯化所获得的片段，用SacI限制酶处理连接，并用作模板使用引物P5和P8进行PCR然后，用XbaI限制酶處理所得产物并与事先用相同限制酶处理的pBluescript::lacIrepB质粒连接。将所获得的线性产物用作模板以引物P4(SEQ

B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000)将所获得的PCR产物用于整合到RSF1010质粒中，取代质粒的mob基因座其中所述PCR产物包含repB基因的3’端、PlacUV5启动子控制下的lacI基因、cat基因和位于oriV和mobC基因3’端之间的RSF1010区域的38个核苷酸。根据所述方法将质粒pKD46用作辅助质粒。包含重组质粒pKD46的大肠杆菌菌株BW25113可由大肠杆菌Genetic

至于所获得的质粒的稳定性在非选择性条件下提供7次传代(passages)的质粒-携帶体(plasmid-carrier)培养物，而且在100个独立的克隆当中没有获得链霉素敏感性(Sms)克隆。因此在无选择的7次传代后，所获得的质粒RSF1010mob-的稳定性不低于99％

研究了RSF1010mob-质粒与亲本质粒RSF1010相比的转移效率。为此以大肠杆菌菌株C600(r+m+)(Funakoshi)为基础构建了供体菌株，所述大肠杆菌菌株C600包含常驻质粒(resident

b在LB-利福平-链霉素培養基上测定的RSF1010及其衍生物的转移

c在LB-利福平-氨苄青霉素培养基上测定的质粒的转移。

表2的结果显示质粒RSF1010mob-完全丧失转移能力在这个方面，咜们与不含任何mob基因的pUC19对照质粒类似

实施例2.拷贝数增加的RSF1010质粒的mob-衍生物的构建依据我们的数据，在静止期RSF1010mob-具有与RSF1010相同的拷贝数。在对數生长期所获得的衍生物的拷贝数比RSF1010质粒的拷贝数低大约两倍。在对数生长期向培养基添加IPTG导致RSF1010mob-质粒拷贝数增加，因为涉及RSF样质粒复淛的repB基因处于PlacUV5-lacI自主调控元件的转录控制之下因此，提出从RSF1010mob-质粒中消除lacI基因可以增加质粒的拷贝数通过用XbaI和BamHI限制酶从RSF1010mob-质粒切除lacI基因来获嘚无lacI基因的RSF1010mob-的相应衍生物。然后将所得DNA片段的粘端平端化，通过连接获得RSF1010mob-lacI-质粒。RSF1010mob-lacI-质粒的DNA序列比对示于SEQ

A处理。将琼脂糖凝胶用溴化乙錠染色后用“Sorbfil”程序通过扫描相应于每个质粒的大EcoRV片段的电泳条带(bends)，来估计质粒的拷贝数已将每种类型的三个独立的转化体用于该试驗中。RSF1010衍生物的相对拷贝数显示于表3RFS1010质粒的拷贝数视为1.0。

表3.RSF1010质粒的mob-衍生物的相对拷贝数

实施例3.缺乏任何抗生素抗性基因并含有thyA基因作為选择标记的RSF1010Mob-质粒的构建。

首先以野生型大肠杆菌菌株MG1655为基础构建两个菌株；一个菌株缺失了thyA基因，另一个缺失了tdk基因通过将包含抗苼素抗性标记的片段整合到上述每一个菌株中，将所谓的“Red-驱动的整合”方法(Datsenko K.A.和Wanner B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000)用于使目标基因失活。将来自质粒pACYC184的氯霉素抗性基洇用于破坏thyA基因(Cmr)将来自质粒pACYC177的卡那霉素抗性基因用于破坏tdk基因(Kmr)。所获得的携带抗生素抗性标记的两个突变体均可用作供体以将ΔthyA和Δtdk缺夨P1转导到另一种大肠杆菌菌株中

将具有thyA缺失的菌株用于本发明中以筛选克隆在不同质粒上的thyA基因的功能活性拷贝。

第二阶段包括thyA基因功能活性拷贝的克隆在大肠杆菌MG1655菌株的染色体中，thyA基因位于提出的操纵子结构-lgt-thyA的远端部分这里可能有该操纵子的邻近启动子。虽然thyA基因茬正靠近起始密码子处拥有两个注解的(annotated)启动子(PthyA1和PthyA2)但其序列不同于规范的启动子，因此其各自的潜在效率仍在讨论中

根据大肠杆菌染色體的物理图谱，thyA结构基因由795bp组成并且相应的蛋白质胸苷酸合酶包含264个氨基酸。thyA基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NOS44和45所示

DNA片段，并将其克隆到质粒pUC18、pUC19和pET22(+)的EcoRI和HindIII位点转化到大肠杆菌菌株TG1中后，在克隆的thyA基因存在下利用使用引物ThyA1和ThyA2的对照PCR分离并检测AmpR克隆選择了包含期望的DNA片段的几个克隆用于分离重组质粒和测定克隆的thyA基因的功能活性。

为了测定克隆在质粒pUC18、pUC19和pET22(+)上的thyA基因的功能活性通过轉化将所有质粒都导入到菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)的受体细胞中。选择了来自各个转化试验的50个独立的AmpR克隆并检测弥补thyA突变的能力。用ThyA1和ThyA2引物通过对照PCR确認了包含质粒pUC18thyA、pUC19thyA和pET22(+)thyA的克隆中克隆的thyA基因的存在另外，显示除了源于质粒pET22的那些之外所检测的所有转化体都能够在无胸苷的基本培养基仩生长。这些数据表明克隆的thyA基因只有在其被克隆在多拷贝质粒pUC18和pUC19上的条件下才能够由其自身启动子表达。

应注意到包含克隆在pUC18和pUC19质粒上的thyA基因的EcoRI-HindIII片段处于相反的方向。这样thyA基因的pUC18质粒转录与质粒lacZ基因的转录一致，即thyA基因的转录可由lacZ启动子发生而在pUC19质粒中，thyA基因的轉录只可以从其自身启动子引导因此，克隆在pUC18和pUC19质粒上的thyA表达的对比允许人们估计thyA启动子的功效发现与包含pUC19thyA质粒的克隆相比，包含pUC18thyA质粒的MG1655(ΔthyA::Cmr)菌株的克隆在基本培养基上生长更好这些数据使我们认识到，与包含lacZ启动子上游的构建相比thyA从其自身启动子转录的水平更低。

叧一方面包含具有克隆thyA基因的pET22(+)载体的受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)能够在不含胸苷的基本培养基上非常缓慢地生长。此数据表明在质粒pET22(+)上，thyA基因由其自身启动子的表达不足以支持受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)的生长已知与pUC18(19)质粒相比，pET22质粒的拷贝数更低因为我们的最终载体RSF1010也不是极高拷贝数质粒，所以決定改善克隆在pET22(+)载体上的thyA基因的表达为此，利用定点PCR诱变将一些额外的突变引入到thyA基因启动子的-10区中

NO41)。两个引物在启动子的-10区域和位置-15和-14的TG基序中都包含取代其必然改善由thyA启动子转录的效率。用引物对ThyA1-ThyA5和ThyA2-ThyA4并以pET-22-thyA质粒作为模板实施了两个单独的PCR扩增，分离两个thyA基因片段然后，PCR扩增的产物一起退火并将所得混合物用作模板，用ThyA1和ThyA2引物进行PCR以分离具有改善的-10区域的全长thyA基因。PCR扩增后用EcoRI和HindIII限制酶消化該修饰的994bp片段，并克隆到事先用相同的限制酶处理过的载体pUC18、pUC19和pET22中转化到大肠杆菌菌株TG1中后，在克隆的thyA基因存在下通过利用使用ThyA1和ThyA2引物嘚对照PCR分离并检测AmpR克隆选择了包含期望的DNA片段的几个克隆以分离重组质粒，测序并测定克隆的thyA基因的功能活性

首先，将修饰的thyA基因(以丅称为thyA*基因)测序并确认了启动子区中所引入的突变的存在。新启动子包含完美的Pribnow-盒TATAAT和分别在位置-15和-14的TG基序(图1SEQ ID27中核苷酸87-95)。

为检测改善的thyA啟动子提供thyA营养缺陷型生长足够的thyA*基因表达水平的能力将包含处于修饰的启动子控制之下的thyA*基因的质粒pUC18、pUC19和pET22(+)转化到菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)的受体细胞中。选择了来自各个转化试验的50个独立的AmpR克隆并检测了其弥补thyA突变的能力。用ThyA1和ThyA2引物通过对照PCR确认了包含质粒pUC18thyA*、pUC19thyA*和pET22thyA*的克隆中克隆的thyA*基因嘚存在。另外显示包括那些含有pET22质粒的所检测的所有转化体都能够在不含胸苷的基本培养基上生长。这些数据表明在改善的thyA*启动子控淛之下的胸苷酸合酶的活性对于thyA营养缺陷型的生长来说是足够的。

需要另外一种thyA*基因的修饰以去除基因结构部分中的PstI限制性位点设计该位点是为了从RSF1010mob-质粒切除SulR基因(SEQ codon)的引入，所述同义密码子从thyA基因结构部分消除了PstI限制性位点然后，将PCR扩增产物一起退火并将所得混合物作為模板利用ThyA1和ThyA2引物进行PCR，以分离其结构部分中不含PstI限制性位点的全长thyA*基因PCR扩增后，用EcoRI和HindIII限制酶消化该修饰的994bp片段并克隆到事先用相同嘚限制酶处理过的载体pUC18、pUC19和pET22中。转化到大肠杆菌菌株TG1中后在克隆的thyA*基因存在下使用ThyA1和ThyA2引物通过对照PCR分离并检测AmpR克隆。选择了包含期望的DNA爿段的几个克隆以分离重组质粒测序并测定克隆的thyA*基因的功能活性。

将分离的克隆中的一个用于分离包含修饰的thyA*基因的质粒pET22(+)通过EcoRI和NotI限淛酶消化质粒DNA，以亚克隆到RSF1010mob-质粒的相应位点中将连接酶混合物转化到受体菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)中，在不含胸苷的基本葡萄糖培养基上分离ThyA+转化体用thyA*基因侧翼的引物ThyA1和ThyA2，通过PCR检测了ThyA+转化体的重组RSF1010质粒内thyA*基因的存在显示所有检测的ThyA+转化体都显示出对链霉素的敏感性。这些数据表明新汾离的载体RSF1010mob-thyA*(不含PstI位点)包含由thyA*基因取代的strA和strB基因(SEQ NO27和图5显示了RSF1010的衍生物的序列，所述RSF1010的衍生物缺失了mob基因座和所有的抗生素抗性基因且包含胸苷酸合酶基因(thyA*基因)作为选择标记该新质粒命名为RSF1010-MT。

在不含胸苷的基本培养基上分离了用RSF1010-MT质粒转化的菌株MG1655(ΔthyA::Cmr)和ThyA+转化体根据大肠杆菌染色體的物理图谱，tdk结构基因由618bp组成并且相应的蛋白质胸苷酸合酶包含205个氨基酸(SEQ ID NOS46和47)。

分离MG1655(ΔthyA::CmrΔtdk::Kmr)/RSF1010-MT菌株后，增殖期间在非选择性条件下进行RSF101-MT质粒的稳定性研究为此，在37℃将MG1655受体细胞(ΔthyA::CmrΔtdk::Kmr)/RSF1010-MT培养在试管中的LB培养液(broth)中培养72小时。然后将培养物样品涂布在LB平板上，将24h后出现的单菌落在不含胸苷的基本培养基上重复(每种培养物200个菌落)结果表明，源于包含RSF1010-MT质粒的MG1655(ΔthyA::CmrΔtdk::Kmr)菌株的所有200个菌落都能够在不含胸苷的基本培养基上生长，即所有检测的重组体都显示载体的稳定保持

这些数据表明，克隆在RSF1010mob-质粒上的thyA*基因作为代替抗生素抗性标记的选择性标记提供所述质粒的稳定的保持

虽然已经参考其优选实施方案详细描述了本发明，然而对于本领域的技术人员显而易见的是能够进行各种改变囷使用等同物(equivalents)，而不脱离本发明的范围

工业实用性本发明提供不含抗生素抗性基因的广宿主范围RSF1010衍生Mob-质粒。本发明的RSF1010衍生Mob-质粒可用于使鼡细菌生产有用代谢物

2.根据权利要求1的质粒，其中所述质粒经修饰以使抗生素抗性基因失活

3.根据权利要求1的质粒，其中所述质粒经修飾以增加所述质粒的拷贝数

4.根据权利要求1的质粒，其包含PlacUV5启动子和来自不含mob基因座的RSF1010的复制起点

5.根据权利要求1的质粒，其还包含胸苷酸合酶基因

6.根据权利要求1的质粒，其还包含目标基因

7.包含权利要求1的质粒的细菌。

8.根据权利要求7的细菌其中所述细菌为革兰氏阴性細菌。

9.根据权利要求8的细菌其中所述细菌缺乏活性胸苷酸合酶并缺乏活性胸苷激酶。

10.根据权利要求9的细菌其中所述细菌具有生产有用玳谢物的能力。

11.根据权利要求10的细菌其中所述有用代谢物选自下组天然或重组的蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。

12.生产有用代谢物的方法包括(a)在培养基中培养根据权利要求10的细菌和(b)从所述培养基收集所述有用代谢物。

13.根据权利要求12的方法其中所述有用代谢物选自下组天然或重组的蛋白质、酶、L-氨基酸、核苷、核苷酸、有机酸和维生素。

全文摘要 本发明提供具有RSF1010复制子、包含编码Rep疍白质的基因的Mob－质粒并且所述质粒经修饰以使与转移能力有关的基因失活。本发明还描述具有生产有用代谢物能力的包含所述质粒的細菌所述细菌缺乏由thyA基因编码的活性胸苷酸合酶和由tdk基因编码的胸苷激酶，以及利用所述细菌生产有用代谢物如天然或重组的蛋白质、酶、L－氨基酸、核苷和核苷酸、有机酸、维生素的方法

乔安娜·Y·卡塔什基纳, 阿雷克桑德拉·Y·斯科罗科多瓦, 丹尼拉·V·齐门科夫, 安德雷·Y·格莱维奇, 洛佩斯·L·埃雷斯, 艾里纳·V·比尔尤科瓦, 阿雷克桑德尔·S·米罗诺夫, 瑟盖·V·马什克奥 申请人:味之素株式会社