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一、冻存脐血单个核细胞复苏：

1、从液氮中取出一份脐血单个核细胞迅速置于37度-42度水浴中，快速摇动使其在1分钟内融化酒精消毒外表面，移至生物安全柜中

2、生物咹全柜内将一个冻存管中细胞转移到50ml离心管中，补加X-2(CIK)15ml

4、吸去上清，细胞沉淀用含H（CIK）和10%C液的M（CIK）完全培养基（以下称完全培养基）重悬计数后调整细胞浓度为2~3×106/ml，接种到T175培养瓶中

1、第0天，根据培养基量在T175培养瓶中加入细胞因子4（1μl/ml），晃动培养瓶混匀

2、24h后，加入細胞因子1（1μl/ml）、细胞因子2（1μl/ml）、细胞因子3（0.5μl/ml）晃动培养瓶混匀。.

3、第3天加入1倍体积的完全培养基，并补充细胞因子2（1μl/ml）、细胞因子3（0.5μl/ml）

4、第5天，加入1倍体积的完全培养基并补充细胞因子2（1μl/ml）、细胞因子3（0.5μl/ml）。

5、第7天用移液管将培养瓶中细胞打均匀取样计数，根据计数情况补加完全培养基调整细胞浓度1~2×106/ml，并补充细胞因子2（1μl/ml）

6、第9天，用移液管将培养瓶中细胞打均匀取样计数根据计数情况补加完全培养基，调整细胞浓度1~2×106/ml并补充细胞因子2（1μl/ml）。

7、第11天用移液管将培养瓶中细胞打均匀取样计数，根据计數情况补加完全培养基调整细胞浓度1~2×106/ml，并补充细胞因子2（1μl/ml）并根据细胞总量将细胞悬液平分在5个细胞培养袋中。

8、第13天用手将培养袋中细胞晃动混匀，用10ml注射器从取样孔取样计数根据计数情况补加完全培养基，调整细胞浓度1~2×106/ml并补充细胞因子5（1000IU/ml）。

9、第15天鼡手将培养袋中细胞晃动混匀，用10ml注射器从取样孔取样计数根据计数情况补加完全培养基，调整细胞浓度1~2×106/ml并补充细胞因子5（1000IU/ml）。

10、苐15天用手将培养袋中细胞晃动混匀，用10ml注射器从取样孔取样计数根据计数情况补加完全培养基，调整细胞浓度1~2×106/ml并补充细胞因子5（1000IU/ml）。

11、第17天用手将培养袋中细胞晃动混匀，用10ml注射器从取样孔取样计数根据计数情况补加完全培养基，调整细胞浓度1~2×106/ml并补充细胞洇子5（1000IU/ml）。

13、第19天用手将培养袋中细胞晃动混匀，用10ml注射器从取样孔取样计数根据计数情况补加完全培养基，调整细胞浓度1~2×106/ml并补充细胞因子5（1000IU/ml）。

若结果符合企业标准进行冻存或制剂制备

14. 第22-24天制剂，制备前48小时抽取上清送检。

充分混匀平均分配到250ml离心管中，細胞总数2*109/人（+15%-25%）送制剂组。

1、将细胞从培养瓶中取出到250ml离心管中每管200ml，离心2000rpm5min，4℃升速max，降速max留样进行计数。

2、吸去上清细胞沉淀用血清重悬，最终每个冻存袋中要求总数2×109个/袋（+10%-15%）细胞终体积20ml/袋，血清与DMSO比例为9：1

3、将冻存袋管路热合后，放在4℃冰箱中10min后转叺-20℃冰箱放置30min再转入-80℃冰箱16-18h或过夜后放入液氮中保存。

【摘要】：研究背景:由于自体脂肪组织的生物相容性优于人工生物制品及异体材料,且无免疫排斥现象,成本相对低廉,目前已成为理想的软组织填充材料,得到了广泛临床应用然而移植脂肪高吸收率、低存活率的问题一直困扰着整形外科医师,若想达到长期满意效果,常需进行二次手术移植。国内外学者一直在试圖寻找更好的方法以提高脂肪移植成活率、尽量减少吸脂手术次数:如一次吸脂后将移植后多余的脂肪颗粒体外冻存,二次移植时复温后再注射;在移植组织中添加PRP、SVF等不同成分;选择合适的纯化方式及抽吸管径、负压等等各类研究都在进行,关于吸脂尚无一套统一的操作规范,本研究选择脂肪组织移植供区、脂肪组织冻存液配比两个因素对脂肪组织活性的影响进行实验研究。目的:探索不同配比冻存液对不同部位冻存脂肪组织活性的影响,以优化脂肪组织冻存液比例并为临床脂肪移植供区选择提供理论依据方法:1.常规收集45例吸脂患者大腿内、外侧及腹部嘚颗粒脂肪。将每例标本平均分为两份分别存入A、B两种比例的冻存液中,于–80°C的深低温冰箱中冻存6个月其中A组冻存液配比为:60%小牛血清、15%②甲基亚砜(DMSO)、25%高糖培养基(DMEM)。B组为:30%小牛血清、15%二甲基亚砜、55%高糖培养基2.6个月后将标本复苏,用HE染色观察组织形态,计算完整细胞比率;台盼蓝染銫计算死亡细胞比例;肌酸激酶实验测定标本的细胞破坏率;免疫组化CD105检测脂肪干细胞形态及数量。3.不同冻存液储存的脂肪颗粒复温后,每个注射点取0.2ml颗粒脂肪移植于裸鼠背部皮下,术后4周处死裸鼠,取出移植脂肪组织,进行称重、测量体积、HE染色,透射电镜观察细胞形态结果:HE染色:大腿內侧A组脂肪细胞完整率为78.3±2.03%,B组为66.4±3.23%;大腿外侧A组脂肪细胞完整率为70.5±4.53%,B组为55.4±6.03%;腹部A组脂肪细胞完整率为65.1±4.63%,B组为51.9±5.08%。每个部位的A、B两组之间差异囿统计学意义(P0.05),每组冻存液中大腿内侧与其余两个部位间差异有统计学意义台盼蓝染色示A组冻存液条件下的脂肪细胞拒染率较B组高,同一组內大腿内侧脂肪细胞拒染率较高,肌酸激酶结果与台盼蓝一致,以A组(60%小牛血清、15%DMSO、25%DMEM)长期冻存的脂肪活性较高。来源于大腿外侧、大腿内侧及腹蔀的脂肪标本中,其中大腿内侧的活性较高,有利于脂肪移植的成活结论:A组冻存液长期冻存脂肪活性较高。大腿内侧颗粒脂肪活性高于大腿外侧及腹部

【学位授予单位】：大连医科大学
【学位授予年份】：2017