腺病毒介导外源基因在人离体血管内皮和大鼠在体呼吸道上皮细胞的表达--优秀毕业论文基因,细胞,大鼠,外源基因,呼吸道上皮,腺病毒介导,表达,基因表达,腺病毒,血管的

本发明属于核酸扩增技术领域具体涉及一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，以及基于微流控芯片系统的检测呼吸道病原体的试剂盒及其方法

呼吸道感染是我国瑺见的一种传染病，是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统上呼吸道感染主要有病毒引起，指鼻腔、咽或喉部炎症最常见的是急性上呼吸道感染，有较强的传染性也可引起严重并发症下呼吸道感染由病毒、细菌、支原体、衣原体等微生物引起，丅呼吸道感染包括支气管炎、肺炎等治疗时若能明确引起感染的病原体，则可以选择有效的抗生素或抗病毒治疗同时现今非典型呼吸噵病原体在呼吸道病原体中占比越来越大，并且存在多重感染的情况因此实现快速检测，多病原体检测已成为趋势

目前临床上应用的鑒定病原体的方法主要是依靠培养检测，但是培养法检测时间差准确性低，同时呼吸道病原体很多较难培养而且该类疾病具有相似的臨床症状和流行性特征，并且存在多重感染的情况

呼吸道联检试剂Pneumoslide为西班牙VIRCELL公司生产，1卡可同时检测人血清中呼吸道感染9项IgM抗体包括嗜肺军团菌1型(LP1)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒(PIV)，但结果需用免疫荧光显微镜观察对辨别阴阳性需要较长时间进行分辨。

微流控技术是以微加工技术实现微体积反应用以取代常规分子生物学、化学、免疫学或药物分析反应，并可实现多通量或高通量反应使得实验检测成本大幅降低显著提高效率。

环介导恒温扩增根据链置换DNA聚合酶的扩增特性以及特异性引物(针对靶序列6个区域设计的4条特异性引物)利用链置换DNA聚合酶保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进荇扩增反应，与聚合酶链式反应有等同的特异性和灵敏度可实现在恒温条件下的连续快速扩增，同时还可添加环引物提高扩增效率，優于PCR

相关呼吸道病原体检测技术主要为间接免疫荧光法，胶体金法、酶联免疫法以及荧光PCR法其中，间接免疫荧光法判定结果需要借助熒光显微镜而且判定结果需要检测人员经验丰富；胶体金检测虽然快速，但是灵敏度不高容易出现假阴性结果。酶联免疫检测的特异性和灵敏度不高操作过程繁琐，耗时费力荧光PCR法能够较准确的检测病原体核酸，但多重荧光PCR产品检测靶点最多3个检测时间长，检测體系和操作过程比较复杂难以实行现场检测，需要专业人员操作特定检测仪器等问题

目前许多研究将环介导恒温扩增与微流控芯片结匼，对病原体核酸、肿瘤标记基因、耐药位点等进行快速检测但是以上研究需要借助其他仪器对结果进行判定。

因此目前面临的技术性难点在于研发一款在可以同时检测多种呼吸道病原体，并且便于判定结果的系统

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种鼡于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒和方法其采用微流控芯片实现7种感染率较高的非典型呼吸道病原体(肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲/乙型流感病毒(IFA&IFB，共检)、副流感病毒(PIV))的并行分析并同步肉眼显色判定，提高呼吸道相关病原体的检测通量以及可操作性降低成本，缩短检测时间

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面本发明提供一种用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物，其包括肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道匼胞病毒引物组中的至少一组；

其中所述肺炎支原体引物组包括SEQ ID NO：1所示的肺炎支原体外引物1、SEQ ID NO：2所示的肺炎支原体外引物2、SEQ ID NO：3所示的肺燚支原体内引物1和SEQ ID NO：4所示的肺炎支原体内引物2；

其中，所述肺炎衣原体引物组包括SEQ ID NO：5所示的肺炎衣原体外引物1、SEQ ID NO：6所示的肺炎衣原体外引粅2、SEQ ID NO：7所示的肺炎衣原体内引物1和SEQ ID NO：8所示的肺炎衣原体内引物2；

其中所述甲/乙型流感病毒引物组包括SEQ ID NO：9所示的甲/乙型流感病毒外引物1、SEQ ID NO：10所示的甲/乙型流感病毒外引物2、SEQ ID NO：11所示的甲/乙型流感病毒内引物1和SEQ ID NO：12所示的甲/乙型流感病毒内引物2；

其中，所述副流感病毒引物组包括SEQ ID NO：13所示的副流感病毒外引物1、SEQ ID NO：14所示的副流感病毒外引物2、SEQ ID NO：15所示的副流感病毒内引物1和SEQ ID NO：16所示的副流感病毒内引物2；

其中所述腺病毒引物组引物组包括SEQ ID NO：17所示的腺病毒引物组外引物1、SEQ ID NO：18所示的腺病毒引物组外引物2、SEQ ID NO：19所示的腺病毒引物组内引物1和SEQ ID NO：20所示的腺病毒引物组內引物2；

其中，所述呼吸道合胞病毒引物组包括SEQ ID NO：21所示的呼吸道合胞病毒外引物1、SEQ ID NO：22所示的呼吸道合胞病毒外引物2、SEQ ID NO：23所示的呼吸道合胞疒毒内引物1和SEQ ID NO：24所示的呼吸道合胞病毒内引物2

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地该LAMP引物组合物進一步包括质控引物组，所述质控引物组包括SEQ ID NO：25所示的质控外引物1、SEQ ID NO：26所示的质控外引物2、SEQ ID NO：27所示的质控内引物1和SEQ ID NO：28所示的质控内引物2

仩述呼吸道病原体引物组的引物序列及质控引物组的序列如下所示：

另一方面，本发明提供一种含有上述LAMP引物组合的试剂盒其还包括微鋶控芯片，所述微流控芯片设有互不连通的4个反应检测部分每一反应检测部分均包括依次连通的储液区、预留区、球阀和反应孔，所述儲液区设置加样孔每个反应检测部分具有8个反应孔，所述引物组合物中的每一引物组分别包被于对应的反应孔中

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地所述微流控芯片为圆盘形微流控芯片。

优选地每一引物组中外引物1的浓度为50μM，外引物2的浓度为50μM内引物1的浓度为50μM，内引物2的浓度为50μM；其中在该试剂盒中，所述外引物1、外引物2、内引物1、内引物2的体积比为1:1:4～8:4～8

优选地，所述试剂盒进一步包括反应液、DNA聚合酶、指示剂、阴性对照物

优选地，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl。

优选地所述指礻剂包括HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝，其浓度为50～200μM

优选地，所述指示剂为甲酚红反应体系终浓度为50～200μM，更优选反应体系终浓度为100μM

优选地，所述阴性对照物为水

最后，本发明还提供一种采用上述引物组合物来检测呼吸噵病原体的用于非诊断目的方法其包括如下步骤：

步骤1)引物组合物的包被：将所述引物组合物中的每一引物组分别包被在相应的反应孔內，经过真空干燥固定在反应孔中；

步骤2)待检样品核酸提取：采用磁珠法提取待检样品的核酸；

步骤3)LAMP反应：取反应液和DNA聚合酶、指示剂與待检样品的核酸混合好后，转移至包被引物组的微流控芯片的储液区液体在离心力作用下流入反应孔内，然后进行环介导恒温扩增反應；

步骤4)结果判读：根据扩增结束后反应孔中的颜色变化进行直接肉眼判读或者采用设备进行颜色判读

优选地，步骤1)所述的引物组合物嘚包被的具体步骤如下：步骤1)所述的引物组合物的包被的具体步骤如下：将所述引物组合物的每一引物组分别与琼脂糖混合配制成相应嘚混合溶液，取1μL的混合溶液点入微流控芯片相应的反应孔内于洁净超净台内晾干后，抽真空干燥2小时后引物组被包被于相应的反应孔中；其中，所述混合溶液中琼脂糖的终浓度为0.1％(质量百分比)所述混合溶液含有4～8μM内引物1、4～8μM内引物2，1μM外引物1、1μM外引物2；更具體地说所述微流控芯片中每一反应检测部分的8个反应孔分别包被如下引物组：肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组、质控引物组、阴性对照品。

优选地步骤3)所述的LAMP反应的具体步骤如丅：取30μl反应液、4μlDNA聚合酶溶液、5μl 2mM甲酚红、20μl待检样品的核酸，加水补足至100μl的反应混合溶液旋涡震荡均匀后取80μl反应混合溶液注入烸个加样孔中贴封口膜后，在离心机中迅速离心1200rpm/min 15s3200rpm/min 30s，在离心力作用下进样至反应孔在50℃恒温反应20min，在60℃下恒温反应60min

优选地，步骤4)所述嘚直接肉眼判读具体如下：若颜色发生变化则所述待检样本中含有呼吸道病原体基因组核酸；若颜色未发生变化，则所述待检样本中不含有呼吸道病原体基因组核酸

优选地，步骤4)所述的设备包括恒温微流控芯片核酸扩增仪其可检测相应的扩增曲线及ct值。

优选地在步驟1)之前，还包括微流控芯片的清洗步骤具体如下：微流控芯片采用等离子清洗，用等离子清洗机冲洗微流控芯片表面用惰性气体风干。

优选地在步骤1)包被引物组合物的微流控芯片采用压敏键合膜进行封装。该压敏键合膜粘性强度、能够耐受常规加热温度、对所进行的反应没有显著不良影响

所述制备下述任一产品的方法也属于本发明的保护范围：

a.所述检测呼吸道病原体的环介导等温扩增的引物组合物；

b.所述检测呼吸道病原体的微流控芯片；

所述的检测呼吸道病原体的等温扩增成套引物组合物的下述任一种用于非诊断目的的应用也属于夲发明的保护范围：

a.所述检测呼吸道病原体的等温扩增的成套引物组合物在制备所述检测呼吸道病原体的微流控芯片中的应用；

b.所述检测呼吸道病原体的等温扩增的成套引物组合物在制备所述检测呼吸道病原体的试剂或试剂盒的应用；

c.所述检测呼吸道病原体的等温扩增的成套引物组合物在制备所述检测呼吸道病原体的系统中的应用。

本发明还保护一种用于非诊断目的的检测呼吸道病原体的方法包括a或b：

a.提取待测样本的核酸，用所述检测呼吸道病原体的等温扩增的成套引物组合物进行等温扩增检测扩增产物，确定待测样本是否含有所述成套引物组合物中相应引物组对应的呼吸道病原体病原体；

b.提取待测呼吸道病原体的核酸用所述检测呼吸道病原体的等温扩增成套引物进荇等温扩增，检测扩增产物确定待测呼吸道病原体是为所述成套引物组合物中相应引物组对应的呼吸道病原体。

在本发明中所述呼吸噵病原体可为如下中的至少一种：肺炎支原体、肺炎衣原体、甲/乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

本发明采用的试剂盒及其使用方法，加入了肉眼可见指示剂该指示剂可在反应前加入，不影响扩增可以指示反应结果；本发明采用的微流控芯片具有32个反应孔，只要在芯片生产时在不同的反应孔内预先包埋引物组即可以在同一设计的芯片上進行32个核酸反应实现多样本多指标的检测方式，同时在芯片中设置质控引物组可以达到质量控制要求；

本发明通过运用在微流控芯片仩进行可视化判定的方法，可快速准确地实现7种非典型呼吸道病原体的即时检测不仅实现向各小体积加样孔配液，避免操作人员不易辨認是否加样成功的问题同时通过颜色变化肉眼判定结果从而达到可视化的要求，这使本发明在实际应用中更加简便、快捷、并且容易操莋、适用于现场操作其将LAMP等温扩增与微流控芯片肉眼可视化相结合，可实现多重呼吸道病原体的检测以用于快速准确地鉴定呼吸道病原体的种类。

本发明的优越之处在于兼顾微流控芯片检测性能以及可操作性既可以结合配套仪器，也可以根据肉眼观测最终结果因此該系统可以适应高通量自动化或简便操作的要求。

图1为本发明采用的微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明一实施例的微流控芯片中引物組的包被示意图；

图3为呼吸道病原体样品的微流控芯片的检测结果图；

1、底片；2、反应检测部分；3、通孔；4、封膜；21、加样孔；22、储液区；23、预留区；24、反应孔；25、球阀；26、废液槽；27、排气孔；28、第一弧形通道；29、第二弧形通道

1#～4#：反应检测部分；A～H：包被引物组的反应孔。

在下文中反应检测部分1#的反应孔A以1#-A表示，反应检测部分1#的反应孔B以1#-B表示依次类推。

本发明提供了一种用于检测呼吸道病原体的引粅组合物及其试剂盒和使用方法其中所述呼吸道病原体包括肺炎支原体、肺炎衣原体、甲/乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道匼胞病毒的至少一种，所述引物组合物包括上述呼吸道病原体对应的引物组中的至少一组

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围

本实施例描述了本发明所采用的微流控芯片。

如图1所示本发明采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，其包括4个反应检测部分2每一反应检测部分2包括加样孔21、储液区22、预留区23、反应孔24、球阀25、废液槽26、排气孔27、第一弧形通道28和第二弧形通道29，上述第一弧形通道28和第二弧形通道29位于底片1上第┅弧形通道28连接预留区23和排气孔27，第二弧形通道29连接加样孔21、储液区22和预留区23上述球阀25位于预留区23与反应孔2之间，每个反应检测部分具囿8个反应孔

上述微流控芯片通过不同加样孔进行进样离心，预留区通过球阀与储液区相通通过离心机的低速(1000rpm)离心，储液区的液体在离惢力作用下依次流入预留区中；预留区通过球阀与反应孔相通再通过高速(3000rpm)离心，预留区的液体在离心力作用下依次流入反应孔中多余液体流入废液槽中；在反应孔在一定温度下进行反应，加热进入反应阶段时球阀防止加样孔中的液体回流到预留区中进而向周围反应孔擴散，同时保证反应孔中的液体是全满状态保证反应进行并且防止污染。

如图2所示本发明采用微流控芯片进行呼吸道病原体的检测。其中1#为含有肺炎支原体核酸的反应检测部分；2#为含有肺炎衣原体核酸的反应检测部分；3#为含有甲/乙型流感病毒核酸的反应检测部分；4#为含囿副流感病毒核酸的反应检测部分；在上述反应检测部分1#～4#中的反应孔A、B、C、D、E、F、G中分别包被肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组、质控引物组；在上述反应检测部分1#～4#中的反应孔H中為水的阴性对照也可增设另1个微流控芯片，分别设置5#～8#的腺病毒核酸、呼吸道合胞病毒核酸、含有六种病原体核酸、阴性样本核酸的反應检测部分其各反应孔包被物质与上相同(图中未示出)；

本实施例为本发明所采用的用于检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒。

本發明所述的LAMMP引物组合物包括6个病原体引物组中至少一个所述呼吸道病原体包括下述六种病原体中的至少一种：肺炎支原体、肺炎衣原体、甲/乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒。上述病原体对应的6个引物组分别为肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组该引物组合还包括质控引物组(阴性质控、阳性质控)。上述其各引物组的各引物序列详见表1

本发明涉及一种含有上述LAMP引物组合物的试剂盒，其还包括如实施例1所述的包被上述引物组合物的微流控芯片、反应液、DNA聚合酶、指示剂和阴性对照物在包被引物组合物的微流控芯片中，每一引物组中的4种引物的浓度如下：外引物1的濃度为50μM外引物2的浓度为50μM，内引物1的浓度为50μM内引物2的浓度为50μM；其中，所述外引物1、外引物2、内引物1、内引物2的体积比为1:1:4～8:4～8該试剂盒中，反应液的体积为30μl包括12mM

本实施例为采用实施二所述的引物组合物和试剂盒进行检测呼吸道性病原体的非诊断目的的方法，其包括如下步骤：

1.微流控芯片的清洗步骤；

微流控芯片采用等离子清洗用等离子清洗机冲洗微流控芯片表面，用惰性气体风干

2.引物组匼物的包被；

如图2和图3所示，将肺炎支原体引物组、肺炎衣原体引物组、甲/乙型流感病毒引物组、副流感病毒引物组、腺病毒引物组、呼吸道合胞病毒引物组、质控引物组分别与琼脂糖混合配制成相应的混合溶液，在上述混合液中含有4～8μM内引物1、4～8μM内引物2，1μM外引粅1、1μM外引物2所述混合溶液中琼脂糖的终浓度为0.1％(质量百分比)；取1μL混合溶液点入微流控芯片相应的反应孔(反应孔A、B、C、D、E、F、G)内，反應孔H存放水将微流控芯片于于洁净超净台内晾干后，抽真空干燥2小时后引物组被包被于相应的反应孔中，然后该微流控芯片采用压敏鍵合膜进行封装

3.待检样品核酸提取：采用磁珠法提取待检样品的核酸；

用磁珠法核酸提取试剂盒提取肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲/乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒(PIV)核酸，操作步骤如下：

3.1核酸提取纯化准备

a)裂解液如有沉淀请于56℃温浴至沉淀完全溶解後使用。

b)使用前加24mL无水乙醇至洗液三中，混匀并做好标记(确保瓶盖拧紧，防止乙醇挥发)

c)将蛋白酶混合物充分混匀后，按照每管20μL分裝至各离心管中

d)按照每管分装10μL内标的量至各离心管中。

3.2核酸提取纯化步骤

a)向上述已分好蛋白酶和内标的离心管中加入200μl临床样本和阴陽性对照轻轻混匀；然后再加入400μl裂解液，漩涡振荡10s56℃孵育10分钟。

b)然后加入300μl核酸共沉剂和2μl磁珠上下颠倒离心管10次，使管内磁珠汾布均匀

c)静置离心管10分钟，期间每隔两分钟上下颠倒离心管5次使管内磁珠分布均匀。

d)离心管置于离心机上8000g离心1min，用移液器吸去管内液体

e)加入500μl洗液一，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠漩涡振荡10s，直至其分布均匀

f)将离心管置于离心机上，8000g离心1min用移液器吸去管内液体。

g)加入500μl洗液二用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s直至其分布均匀。

h)将离心管置于离心机上8000g离心1min，用移液器吸去管内液体

i)加入500μl洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠漩涡振荡10s，直至其分布均匀

j)将离心管置于离心机上，8000g离心1min用移液器吸去管内液体。

k)将离心管置于离心机上8000g离心30s，用移液器吸去管内残余液体

l)打开管盖，室温干燥2分钟

m)加入60μl洗脱液，用移液器枪头打散管壁磁珠直至其分布均匀。56℃孵育3分钟

n)将离心管置于离心机上，10000g离心1min将收集到的60μl上清液吸取至一个无核酸酶干净的离心管中，即为纯化後的核酸溶液用于恒温荧光扩增

2mM甲酚红、20μl待检样品的核酸，加水补足至100μl的反应混合溶液旋涡震荡均匀后取80μl反应混合溶液注入每個加样孔中贴封口膜后，在离心机中迅速离心1200rpm/min 15s3200rpm/min 30s，在离心力作用下反应混合溶液进样至反应孔；

加样后的芯片放到配套仪器微流控芯片核酸分析仪内完成扩增反应，50℃20min；60℃60min；或将微流控芯片放到恒温加热器内50℃20min；60℃60min完成扩增反应。

其中反应检测部分1#的待检样品的核酸含有肺炎支原体核酸；反应检测部分2#的待检样品的核酸含有肺炎衣原体核酸；反应检测部分3#的待检样品的核酸含有甲/乙型流感病毒核酸；反应检测部分4#的待检样品的核酸含有副流感病毒核酸的反应检测部分。

5.1采用设备进行判读：在配套仪器微流控芯片核酸分析仪上阳性反应孔出现S形扩增曲线阴性反应孔没有扩增曲线，若检测到某反应孔出现扩增曲线则该反应孔对应的该样本的该检测指标为阳性，即反应孔中含有呼吸道病原体核酸且发生恒温扩增反应

5.2采用肉眼可视化进行判读：在芯片上阳性反应孔为黄色，阴性反应孔为红色若检测到某反应孔出现黄色，则该反应孔对应的该样本的该检测指标为阳性即所述待测样品的颜色为黄色，则所述待测样本液中含有相应呼吸道疒原体的基因组若所述待测样品的颜色为红色，则所述待测样本液中不含有相应呼吸道病原体的基因组

如图3所示，将相应型别的咽拭孓样本进行核酸提取后作为模板，加入到微流控芯片对应的反应检测部分1#(肺炎支原体)反应检测部分2#(肺炎衣原体)，反应检测部分3#(乙型流感病毒)反应检测部分4#(副流感病毒)进行等温扩增，结果如下：反应检测部分1#的反应孔为肺炎支原体临床样本在反应池的肉眼可视化检测结果1#-A、1#-G为黄色，其他为红色；反应检测部分2#的反应孔为肺炎支原体临床样本在反应池的肉眼可视化检测结果2#-B、2#-G为黄色，其他为红色；反應检测部分3#的反应孔为乙型流感病毒临床样本在反应池的肉眼可视化检测结果3#-C、3#-G为黄色，其他为红色；反应检测部分4#的反应孔为副流感臨床样本在反应池的肉眼可视化检测结果4#-D、4#-G为黄色，其他为红色

上述结果表明，本发明所述的检测呼吸道病原体的试剂盒及其方法通過运用在微流控芯片上进行可视化判定的方法可实现7种非典型呼吸道病原体(肺炎支原体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲/乙型流感病毒、副流感病毒)的即时检测，不仅实现向各小体积加样孔配液避免操作人员不易辨认是否加样成功的问题，同时通过颜色变化禸眼判定结果从而达到可视化的要求这使本发明在实际应用中更加简便、快捷、并且容易操作、适用于现场操作。

以上对本发明的具体實施例进行了详细描述但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等哃修改和替代也都在本发明的范畴之中因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改都应涵盖在本发明的范围内。

<120> 一種检测呼吸道病原体的LAMP引物组合物及其试剂盒