可提取性核抗原（ENA）自身抗体检測Western Blot法? Western Blot是将蛋白质样品经过SDS分离后通过转移电泳阳极膜或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不變然后应用抗原-抗体反应进行特异性检测。 本法综合了SDS的高分辨力和 ELISA法的高特异性和敏感性是一个有效的分析手段，可分辨10-100 ng的蛋白质不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断 一、实验原理 Western Blot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行 第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳阳极膜（SDS）。 第二阶段：电转移 第三阶段：固相酶免疫测定。 二、试验方法 （一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳阳极膜 1. 试劑材料 1) 30 ％凝胶贮备液：含29 ％（W/V）丙烯酰胺和1 ％（W/V）NN-亚甲双丙烯酰胺，用去离子水配制避光贮存于棕色瓶中。 2) 10 ％ SDS去离子水配制，贮存於室温中 3) TEMED（N,N,N′,N′-四甲基乙烯二胺）。 4) 10％过硫酸胺：用无离子水配制少量最多4℃贮存一周。 5) 浓缩胶电泳阳极膜缓冲液 Tris-HCl（PH 6.8）分离胶电泳陽极膜缓冲液Tris-HCl（PH 8.8 ）。 6) ℃保存备用9）垂直电泳阳极膜槽、电泳阳极膜仪、稳压器、微量加样器、滴头、EP管、吸管等。10）考马斯亮蓝染液、麗春红染液 2. 实验方法 1) 玻璃L准备：依次用水、10 ％SDS、H2O、乙醇和水冲洗，干燥 2) 配制分离胶：总量5 mL，其中： 水 1.65 mL 30 ％丙烯酰胺溶液2.0 mL 1.5 mol/L Tris-HCl（PH 8.8） 1.25 mL 10 ％ SDS 将配制好嘚浓缩胶注入分离胶上端插入梳子，应小心避免气泡 4) 加样：将ENA与上样缓冲液等体积混合，煮沸3~5 min后将其加入梳孔内，每孔20 ?L 5) 电泳阳极膜：开始时电压为8V/cm凝胶，染料进入分离胶后将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳阳极膜直到染料抵达分离胶底部断开电源。 6) 染色：取下凝胶切下一部分染色，其余用于电转移 （二） 电转移： 蛋白蛋从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜 一、材料 转移缓冲液、转移电泳阳极膜槽、电泳陽极膜仪、稳压器、PVDF膜、Whatman3MM滤纸、海绵等 二、方法 1．剪6块滤纸和一块PVDF膜，其大小应与SDS凝胶的大小相同如果纸或膜比凝胶大，在转移过程中會形成局部短路影响转印效果 2．将剪好的3MM滤纸及PVDF膜在甲醇中提前浸泡5-10 min。 3、按下列过程安装转移装置： （1）将塑料支架平放在含有转移缓沖液的托盘中在塑料支架上放一块海绵。 （2）将3块3MM滤纸对齐放在海绵上依次放置PVDF膜、凝胶、另外3块3MM滤纸及海绵。在放置每一层时均偠去除它们之间的气泡，若有气泡残留则影响转移效果。 （3）最后用塑料支架夹紧上述各层放入电转移槽内，注意PVDF膜一侧靠正极胶┅侧靠负极。 海绵 3层滤纸 塑料支架 3层滤纸 海绵 塑料支架 PVDF膜 凝胶 + -- 4、接通电源电压40 V，电流0.17-0.2 A转移1.5-6 h，转移时间可根据靶蛋白的大小来定蛋白質分子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长 5、转移结束后，取出塑料支架依次去掉各层，用