问 男人吃了别人的精子会影响当天的精子基因吗？？？

为什么腮腺炎可以导致不育?流行性腮腺炎是学龄前和学龄儿童期常见的呼吸道传染病，病原体是腮腺炎病毒，通过唾液飞沫传染。腮腺炎有一个特点，它不但影响腮腺，而且影响睾丸，少数患腮腺炎的男孩会同时患睾丸炎，以至于睾丸红肿、疼痛。虽然像腮腺炎一样，睾丸炎可以自愈，但有时却会留下后遗症，也就是成人之后的不育症。因此，幼儿患腮腺炎一定要积极治疗，以免后患。

如果妻子出现自然流产或胚胎停止发育，又检查不出任何异常，作为丈夫应及时去做检查，别让妻子再“背黑锅”。当然，更重要的是：查出流产的原因。

虽然老张和前妻生育没有任何问题，但随着年龄的增长，男性的精子数量、活力(游走速度)和质量都会下降。有研究表明，在30~50岁之间的男性中，精子数量平均下降了30%，精子游走的速度慢了37%，的比例增加了5倍，这些都增加了胎儿基因异常的可能性。一项新研究发现，男方超过40岁，女方流产的概率约为35%。研究人员认为，这可能与男性的年龄增大容易导致精子的脱氧核糖核酸(DNA)出现断裂、衰退有很大关系。

琳琳曾经怀过两次孕，但都没有保住胎儿。琳琳多次到医院检查却无果，于是她希望老公李强也能到医院去检查一下，但李强却认为自己年轻力壮、性功能正常，坚持不肯。两人多次争吵，李强最后才勉强去了医院。经检查，李强的精子总数只有500万，而正常男子精子总数一般在6000万以上。医生经过详细询问病史，得知李强在幼儿时得过腮腺炎，并引发了睾丸炎。医生告诉他，正是腮腺炎导致了他的不育。

案例二：幼年患病留下不孕后遗症

如果阿勇与小芳血型相同，抗体就不会对相同血型的精子起作用，流产问题也就不会发生;另外，如果阿勇与小芳是第一次妊娠，小芳的体内没有产生过抗体，那么流产也不会发生。“血型不合”造成的流产，多发生在夫妻俩的第二次及其以后的妊娠中。

治疗“血型不合”要禁欲，或使用避孕工具，等待一段时间后再怀孕;或中医中药治疗，减少体内抗体。这里特别要提到的是，这种情况在第一胎时往往不会发生，所以，做好避孕，尽量不做人工流产就会减少这种情况的发生。

圆圆和丈夫大康经过全面检查，身体都很健康，大康的精子质量也较好。那为什么会出现这种情况呢?原来大多数时候，总是最健康的精子和卵子结合，但有些特殊情况下，某些不正常的精子会抢先和卵子结合，也有时是因为卵子与一个精子结合后，，又有第二个精子也和同一个卵子结合，这样形成的受精卵是有先天缺陷的，所以不可能发育成为正常胎儿，导致最终流产。

圆圆婚后两个月就怀孕了，但怀孕后没多久她就出现了肚子疼、阴道出血的症状。咨询医生后，考虑可能是先兆流产，医生让圆圆静养，保胎。几天后，圆圆阴道大量出血，最终流产，后经医生检查为畸形胎—“葡萄胎”。

小芳快30岁时又一次怀孕了。之前她做过一次人工流产，，这一次，在怀孕之后没多久就流产了。经过医生检查，原因是阿勇和小芳“血型不合”。阿勇是B型血，小芳是O型，前一次流产使小芳的体内产生了对抗阿勇精子的抗体，于是这次妊娠时，抗体排斥受精卵，使这个小生命不能正常发育，最终流产。

还有一些男性，因为幼年患病，比如肾炎、恶性肿瘤，服用化疗药物，也可能造成男性少精症、、。

案例一：夫妻“血型不合”导致流产

42岁的老张和年轻貌美的小丽喜结良缘，可婚后小丽两次怀孕都自然流产。老张一直都认为是小丽的问题，因为他和前妻的生育史非常正常，育有一子。然而小丽迟迟没查出问题，，就劝老张去了医院。经查，老张性功能正常，但精子数量和精子活力已经明显下降，精子畸形率也很高。很显然，这就是小丽流产的原因。

案例三：受精卵有先天缺陷会致流产

案例四：老夫少妻女方易流产

SCSA检测的不育男性精子DNA完整性与精子正常形态的相关性

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性

与精子正常形态的相关性

指导老师：廖勇彬教授一

目的通过对男性不育患者进行精子染色质结构分析，探讨精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性，进一步完善不育患者的精液质量评估。初步探讨精子ＤＮＡ损伤的检测在辅助生殖领域的临床应用价值。

方法收集江门市中心医院生殖医学中心就诊的９２名男性不育患者精液，采用ＣＡＳＡＪ挂行精液常规参数检测，采用巴氏染色检测精子正常形态，将精子正常形态（Ｍ）分为五个组：１组Ｍ＜Ｉ％；２组１％冬Ｍ＜４％；３组４％≤Ｍ＜１０％；４组ｌＯ％ＳＭ＜１５％；５组Ｍ＞１５％。采用ＳＣＳＡ检测每组患者的精子ＤＮＡ完整性；并对精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态进行相关性分析。

结果９２名患者精子形态学分析显示形态异常率为６３．０４％，精子ＤＮＡ碎片异常率为６１．９６％。３４名精子形态正常的患者中有１４名（４１．１８％）ＣＯＭＰａｔ参数＜１５％，但其中也有５名（１４．７ｌ％）患者ＣＯＭＰａｔ参数≥３０％。精子ＤＮＡ完整性与精子形态无显著相关，但精子头部形态异常率与精子ＤＮＡ碎片率相关。

结论精子ＤＮＡ碎片在是独立于精子形态之外的评价男性不育的指标，应作为精液常规分析的有效补充，综合分析精子染色质完整性及精液常规参数能够对男性生育力进行更全面的评估。关键词：精子形态，染色质结构，ＳＣＳＡ，流式细胞术，不育

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性ＴｈｅｓｐｅｒｍＤＮＡｉｎｔｅｇｒｉｔｙｉｎｉｎｆｅｒｔｉｌｅｍｅｎａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｓｐｅｒｍ

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ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｓｐｅｒｍｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＳＣＳＡ，ＦＳＭ，ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙｌｌ

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

ＳＣＳＡ………………………………精子染色质结构分析试验ＦＩＳＨ………………………………．．荧光原位杂交技术ＩＳＥＬ………………………………．．原位末端标记法

ＳＣＤ…………………………………精子染色质扩散试验ＳＣＧＥ………………………………．单细胞凝胶电泳ＰＣＲ…………………………………聚合酶链式反应

ＡＯ…………………………………．．吖啶橙

ＤＦＩ…………………………………．ＤＮＡ碎片指数ＡＲＴ…………………………………辅助生殖技术

ＩＵＩ…………………………………．．宫腔内人工授精ＩＶＦ…………………………………．体外受精

ＩＣＳＩ…………………………………．卵胞浆内单精子注射ｄｄ－Ｈ２０………………………………．双蒸馏水

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对

学位论文作者签名：与一与孚

日期：沁妇年５－月四日

本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。学位论文作者签名、诧擎

日期：石护年ｒ月≥荻扫，１］日

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１９６９年，德国学者ＣａｒｌＳｃｈｉｒｒｅｎ经过不懈努力，在当时联邦德国《科学》杂志上开始正式使用“Ａｎｄｒｏｌｏｇｙ＇’这～学科名称，这是男科学作为－Ｉ＂７新兴独立的学科而诞生得标志！男性不育（ｍａｌｅｉｎ－ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）的诊治作为男科学的一个分支，最近数十年也得到了迅猛发展！

精液质量评估（ｓｐｅｒｍｑｕａｌｉｔｙｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）一直是男性不育评估的重点。最近二十年来，随着临床诊疗水平以及实验方法学的不断发展，精液质量评估逐渐趋于完善。精子活力（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、密度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）测定以及精子形态（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）分析等已经被广泛应用于男性不育评估、临床诊治，尤其是精子形态分析一直以来被认为是精液质量评估的重要指标，也一直被认为是辅助生殖技术（ａｓｓｉｓｔｅｄｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡＲＴ）最重要的参考和预测指标！

随着男性不育诊治技术和辅助生殖技术的不断完善、以及实验方法学的不断发展，精液分析已不能全面评估男性生育力，且约有１５％的男性不育症患者精液常规检查是正常的，因此有必要探讨新的不育评价指标，完善男性生育力的检测。近些年来，精子ＤＮＡ损伤（ｓｐｅｒｍＤＮＡｄａｍａｇｅ）的问题越来越受到重视而逐渐成为近些年来国内外的研究热点。目前研究表明，精子ＤＮＡ损伤能够影响精子的受精能力、受精卵的分裂、胚胎的发育以及子代健康，已有不少学者将其作为一个新的评价精液质量和预测生育能力的指标。‘

关于精子ＤＮＡ完整性（ｓｐｅｒｍＤＮＡｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）的检测技术最近十余年也发展迅速。主要有以下几种方法：荧光原位杂交技术（ｆｌｕｏ．ｒｅｓｅｅｎｃｅ

ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）；精子染色质结构分析试验（ｓｐｅｒｍｉｎｓｉｔｕｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｓｓａｙ，

ｃｅｌｌｇｅｌｅ―ｓｃｓｈ）；彗星试验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ）又称单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅ

ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＣＧＥ）；原位末端标记法（ｉｎ

质扩散试验（ｓｐｅｒｍｃｈｒｏｒｒｍｔｉｎｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｓｉｔｕｅｎｄ－－－－ｌａｂｅｌｉｎｇ，ＩＳＥＬ）；精子染色ｔｅｓｔ，ＳＣＤ）；聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）；吖啶橙试验（ＡＯａｓｓａｙ）等。其中ＳＣＳＡ可以检测不同精子染色质构象结构的异质性，该方法快速、简便、客观，被认为是精子染色质完整性检测的“金标准９１１０ＳＣＳＡ最早由Ｅｖｅｎｓｏｎ等于１９８０年发明，其检测原理在于：损伤变性的精子ＤＮＡ对于热和ＰＨ改变比未损伤的ＤＮＡ更加敏感。随后近二

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性十年时间里，Ｅｖｅｎｓｏｎ不断将ＳＣＳＡ实验方法进行改良，于１９９９年的得到完善并被广泛应用至今。

如上述，约有１５％的男性不育症患者精液常规检查正常，无法对不育原因进行合理解释；同时亦有大量反复自发流产夫妇，在进行女方自发流产评估及男方精液质量传统评估后亦未能找到合理解释。在辅助生殖方面，精子形态一直被认为是最重要的参考指标和结局预测指标，亦有大量学者对精子形态与辅助生殖结局的相关性做了大量研究。部分学者认为精子形态与体外受精（ｉｎｖｉｔｒｏ佗ｒｔｉｌｉｚｉｔｉｏｎ，ＩＶＦ）结局相关；部分学者认为精子形态仅与ＩＶＦ受精率和优质胚胎率相关，同卵裂率、胚胎移植率、妊娠率、流产率等无关；而大多数学者认为精子形态与卵胞浆内单精子注射（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｐｅｒｍｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）结局无关。正因为诸如上述用精子形态无法解释或尚存争议的问题存在，精子ＤＮＡ损伤的检测及研究逐渐被引用到男性不育领域。

有不少学者将精子形态等常规参数与精子ＤＮＡ损伤进行优对，研究二者的相关性，但研究结果亦存在争议。Ｌｅｗｉｓ－Ｊｏｎｅｓ等认为：精子头部作为男性基因的高度专一的载体，精子头部缺陷可以反映精子染色质结构的异常。Ａ．Ｃ．Ｖａｒｇｈｅｓｅ等研究表明：精液常规参数与精子ＤＮＡ异常存在相关，但这些相关性从精子活力、快速直线运动精子活力、密度、正常形态、精子头部缺陷呈递减趋势。ＭｉＣｈａｅｌ等研究表明：尽管有些男性精子形态等传统精液参数正常，但ＳＣＳＡ分析却存在高水平的ＤＮＡ碎片率（ＤＮＡｆｒａｇａｍｅｎｔａｔｉｏｎｒａｔｅ）。应用多元回归分析显示，精子形态只能预测４０％的精子ＤＮＡ碎片指数（ＤＦＩ）变异。包括精子形态在内的所有常规参数正常时，仍然有１８％的男性ＤＦＩ超过３０％；同样约３９％的男性精子形态等参数正常，但并没有高水平的ＤＦＩ。ＡｒｍａｎｄＺｉｎｉ等研究表明：精子形态与ＳＣＳＡ参数％ＨＤＳ（ｈｉｇｈＤＮＡｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ）存在负相关（Ｆ．０．４０）；精子头部缺陷与％ＨＤＳ正相关（ｒ－－０．４０）；而精子尾部、中段、颈部与ＳＣＳＡ参数无明显相关性。他们最终认为精子头部缺陷可能部分归因于精子染色质浓缩障碍。Ｌａｒｓｏｎ等亦表明：与精子染色质结构有关的是精子头部，但某些精子头部畸形如顶体畸形和缺失不影响精子染色质结构的完整性。上述研究表明，精子形态与精子染色质异常并非完全相关，精子染色质完整性应该相对独立的作为男性不育和辅助生殖技术的参考指标。２

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江门市中心医院是一所有近百年历史三级甲等综合性医院，２００５成为中山大学附属江门医院。该院生殖医学诊疗中心成立于２００１年，于２００４年ＪＩＩ页Ｎ通过广东省卫生厅“夫精人工授精技术”专家评审，成为国家标准的夫精人工授精技术的生殖中心。２００７年３月又通过了国家卫生部专家组评审，获得“体外授精一胚胎移植和卵胞浆内单精子注射”（即试管婴儿）项目的运行资格，成为五邑地区唯一一家通过国家卫生部认证的开展各类辅助生殖技术治疗不孕不育的特色专科。随着各项ＡＲＴ的开展，不少严重少、弱、畸精症的患者得到了生育的机会。在ＡＲＴ尤其是ＩＶＦ及ＩＣＳＩ的实施过程当中，在男性因素方面我们一直以精液常规参数作为参考指征，虽然随着男科实验室诊断水平的不断提高以及辅助生殖技术的不断发展，中心的ＡＲＴ指征不断变化，但精子形态一直以来仍然是主要参考指标。通过近两年对ＩｖＦ及ＩＣＳＩ结局的观察，我们发现仅仅以精子形态作为预测指标，ＩＶＦ及ＩＣＳＩ仍然存在一些无法解释的失败结局。有些患者精子形态较差，能获得有效妊娠结局；相反有些患者精子形态较好却不能获得有效妊娠，或者虽然能获得有效胚胎移植但却最终流产。随着最近几年对精子ＤＮＡ损伤问题研究的逐渐深入，我们认为有必要将精子染色质完整性引入作为男性不育评估及ＡＲＴ的参考及预测指标。这正是本次研究的思路来源。

同时也正是基于上述关于精子形态与精子染色质异常的这种模糊而有争议的相关性，我们设计了本次研究，通过对男性不育患者进行精子形态学分析及精子染色质结构分析，旨在进一步验证精子正常形态与精子染色质完整性的相关性，进一步完善畸形精子症患者的不育评估。期望能进一步明确精子染色质损伤在评价男性生育力及辅助生殖应用方面的参考作用。

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

１．通过对男性不育患者进行精子染色质结构分析，探讨精子ＤＮＡ完整性与精子

正常形态的相关性，进一步完善不育患者的精液质量评估。

２．初步探讨精子ＤＮＡ损伤的检测在辅助生殖领域的临床应用价值。４

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９２例男性不育患者均来自江门市中心医院生殖医学中心不育门诊，年龄２仁－４５岁，平均３１．２５岁；婚后正常性生活１年以上不育，平均不育年限３．４５年；无外伤及遗传性疾病家族史，体检未发现明显睾丸、附睾及输精管异常，基本排除女方不育因素。

按ＷＨＯ标准，禁欲２～７ｄ后手淫法取精于干燥消毒量杯内，立即置于３７℃水浴箱内，３０分钟后待完全液化进行检测，对每名患者而言，精子形态学分析和染色质结构分析取自同一份精液样本。

采用ＷＬＪＹ一９０００型伟力彩色精子质量检测系统进行精子常规参数分析，本次研究主要取精液密度参数，为ＳＣＳＡ试验精液样本稀释时提供参考。

按照ＷＨＯ推荐【１Ｊ的改良巴氏染色法分析精子形态。具体方法如下：精液液化后取ｌｕｌ涂于载玻片上，自然干燥；将玻片置于等量的９５％乙醇和乙醚混合成的溶液中，固定５ｍｉｎ将玻片依次浸人８０％、７０％、５０％乙醇溶液各ｌｍｉｎ，最后放人蒸馏水中ｌｍｉｎ；把玻片放人苏木精染液中染色３ｍｉｎ，蒸馏水冲洗ｌｍｉｎ；放人Ｏ．５％盐酸乙醇中分色，约２ｍｉｎ，蒸馏水冲洗ｌｍｉｎ；将玻片依次浸入５０％、７０％、８０％、９５％乙醇溶液各ｌｍｉｎ；在橘黄Ｇ６染液中染色２ｍｉｎ，然后将玻片浸入９５％乙醇溶液中两次，每次２ｍｉｎ；将玻片放人ＥＡ３６染液中染色５ｍｉｎ，然后浸入９５％乙醇溶液中３次，每次ｌｒａｉｎ，再入无水乙醇中浸２ｍｉｒａ将玻片放人二甲苯溶液中透明３次，每次ｌｍｉｍ干燥后立即显微镜观察。５

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五、精子ＤＮＡ完整性检测

采用精子染色质结构分析实验ＳＣＳＡ检测精子ＤＮＡ碎片，具体操作流程参照Ｅｖｅｎｓｏｎ及张宁等【７’龃的方法，根据Ｅｖｅｎｓｏｎ／及Ｌａｓｏｎ等人１９：０］推荐的标准，ＳＣＳＡ参数ＣＯＭＰａｔ＜１５％为正常。

１．ＳＣＳＡ试剂配制：

①１０＊ＴＥＮ缓冲液：９．４８９Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（Ｏ．１ｍｏｌ／１），５２．６９ＮａＣｌ（１．５ｍｏｉ／Ｉ），２．２３９ＥＤＴＡ?Ｎａ２（１０ｍｏＹｌ），加水至６００ｒａｌ，用２ｍｏｌ／１ＮａＯＨ调整至ＰＨ７．４。

②酸处理液：２０ｍｌ２ｍｏｌ／ｌＨＣＬ（０．０８ｍｏｌ／１），４．３９ｒｎｇＮａＣｌ（０．１５ｍｏｌ／１），０．５ｍｌ

ｍｏｌ／ｌＨＣＬ调整至ＰＨＩ．２。

２ｍｇ。ＴｆｉｔｏｎＸ．１００（０．１呦，加水至５００ｍｌ，用５③ｌｇ／ｌ吖啶橙（ＡＯ）储存液：在２ｍｌ双蒸水中溶解色谱纯ＡＯ

④染色缓冲液：３７０ｍｌＯ．１ｍｏｌ／１柠檬酸缓冲液，６３０ｍｌ０．２ｍ０１／ｌＮａＨ２Ｐ０４缓冲液，３７２ｍｇＥＤＴＡ?Ｎａ２（１．Ｏｍｏｌ／１），８．７７９ＮａＣＩ（０．１５ｍｏｌ／１）混合过夜以保证ＥＤＴＡ‘Ｎａ２完全溶解，用浓ＮａＯＨ片调整至ＰＨ６．０。

⑤ＡＯ染液：取０．６ｍｌＡＯ储存液，加入１００ｍｌ染色缓冲液，保存于棕色瓶中。⑥ＡＯ平衡缓冲液：０．４ｍｌ酸处理液加１．２ｍｌ染色缓冲液。

和缓冲液均保持在４＂Ｃ冰水中。

２．ＳＣＳＡ实验精液参考样品的选择及设定

为保证每次实验的标准化，必须选择一份独立的精液样本作为参考样品，具体实施如下：

①：选择一名捐赠者，作为参考样品。留取其精液样本，演示其毗变异性，保证ＣＯＭＰａｔ值为１０－－－２０％：使用时所有试剂

③：用冷１＊ＴＥＮ缓冲液稀释成（１￣２）＊ｌｏｅ／ｍｌ；

④：在不使用冷冻保护剂的情况下迅速置于．７０～１００。Ｃ液氮中冷冻保存；

⑤：当测量标本时，参考样品用于设置红、绿光电倍增管的电压（分别为１３０／１０００和５００／１０００ｃｈａｎｎｅｌｓ）。以保证红、绿荧光水平和ａｔ、ＳＤａｔ、ＣＯＭＰａｔ等参数值为相同测量标准；

⑥：在以后的试验中也一贯地使用这些设定值；６

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性⑦：所有参考样品均值（红、绿荧光水平）须控制在＋５ｃｈａｒｍｅｌｓ范围内；⑧：每运行１０份检测样本更换一次参考样品，以保证流式细胞仪设置没有

变动。每次使用的参考样品溶液只能使用一次，同时不能超过２个小时；

⑨参考值的设置必须严格坚持，贯穿试验始终。这种精确性是必须的，即使是对同一人的不同精液样本作比较。

①：调整流式细胞仪激发光波长为４８８ｎｍ和二色滤光片，在峰顶或峰高收集红色荧光（＿＞６３０ｎｍ）和绿色荧光（５１５～５３０ｎｍ）。用ＡＯ平衡缓冲液平衡流式细胞仪样品通道。用参考样品调整仪器设定，保持日内和日间完全一致。

②将新鲜的液化精液样品至于冰块上，待冰块刚融化，立即取出。用冷１＊ＴＥＮ缓冲液稀释成（１￣２）?１０６／ｍｌ。

③取５０ｕｌ稀释精子悬液于进样管中，加入１００ｕｌ酸处理液（ＰＨｌ．２），立即开动秒表，漩涡轻轻混合３０ｓ，加３００ｕｌＡＯ染液染色后低速流动样品２ｍｉｎ，检查精子流速，如果太快（＞３００个Ｉｓ）重新稀释。每个样品获取和储存１０００个精子的红、绿荧光。每测１０个样品，运行一个新融化的参考样品，以保证仪器的稳定性和控制整个测量过程。

④用Ｄｅｎｏｖｏｓｏｆｔｗａｒｅ公司软件ＤＮＳ分析结果。计算瞰＝Ｏ．５（红荧光）／（红荧光＋绿荧光）、ＳＤａｔ（０【ｔ分布的标准偏差）、ＣＯＭＰａｔ（ｃｅｌｌｓ

ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）表示主群以外的细胞即变性精子占总精子的百分数。ｏｕｔｓｉｄｅｔｈｅｍａｉｎ

４．流式细胞仪样本通道的清洗

为避免两份不同精液样本检测结果之间相互干扰，在每次测量一份样本前后，流式细胞仪样本通道的清洗是相当重要的，其目的在于完全清除通道内残留的样本残渣及残留的染色试剂。我们准备了两种清洗液：一种是流式细胞仪本身配备的样品通道清洗液（我们称为洗液１）；另一种是我们按照Ｅｖｅｎｓｏｎ的方法自行配制的清洗液（我们称为洗液２），它能良好的清除残留在样本通道内的ＡＯ染色试剂。洗液２的配制方法如下：５０ｍｌｄｄ．Ｈ２０＋５０ｍｌ家用漂白剂（含５％的次氯酸钠）混合而成。具体清洗方法如下：在每一份精液样本运行之前，先运行洗液ｌ一次，在运行ｄｄ．Ｈ２０两次；在运行完精液样本之后，先运行洗液２―７

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性次，在运行ｄｄ．Ｈ２０两次，最后运行洗液ｌ一次。

改良巴氏染色试剂（按照ＷＨＯ手册由生殖医学中心男科实验室自行配制）；ＯＬＹＭＰＵＳ―ＣＸ２１型光学显微镜；流式细胞仪（美国Ｃｏｕｌｔｅｒ公司）；ＷＬＪＹ．９０００型伟力彩色精子质量检测系统。

统计分析采用ＳＰＳＳｌ３．０软件包进行分析，计量资料用均数４－标准差表示，两两比较采用ｔ检验，多重比较采用ＬＳＤ－ｔ检验，精子形态与ＤＮＡ损伤的相关性采用Ｐｅａｒｓｏｎ积矩相关分析，以Ｐ＜０．０５为差别有统计学意义。８

中山大学硕士学位论文ｓｃｓＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

９２名受试者精子正常形态＜１５％者５８名，总的形态异常率６３．０４％（见表１）。

表１受试对象精子形态分析结果

二、精子染色质结构分析结果

９２名受试者ＳＣＳＡ参数ＣＯＭＰａｔ均值２０．５７＋１５．３２，总的ＣＯＭＰａｔ参数异常率６１．９６％（见表２，图１）。

表２ＳＣＳＡ参数ＣＯＭＰｏｒｔ结果９

Ｉ?山大学碗±学位论文ｓｃｓＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精于正常％忐的相盖性

图１ＳＣＳＡ实验精子Ｄ１ｑＡ碎片图及红绿荧光圈

图１．Ｉ患者Ｊ精子ＤＮＡ碎片圈图圈Ｉ－３患者２耪子ｕＮＡ碎片图鞫图ｍ患者ｌ红绿荧光图窭田Ｉ－４患者２红姆荧光图

三、按形态分组，各组ＣＯＭＰａｔ参数对比情况

各组ＣＯＭＰａｔ参数行两两比较无明显统计学差异（Ｐ值均）００５）（见表３，表４）。

表３按形态各组的ＣＯＭＰｔｔｔ参数对比

分组例数（ｎ）ＣＯＭＰｍ均值±标准差ｌ４２２７６±１５３２

２７２４７１±１９７０

３２１２２１３±１２８４

４２６１９９２±８．９５

５３４１９００±－９３５

Ｔｏｔａｌ９２２０５７±１５３２

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

表４形态不同各组ＣＯＭＰａｔ参数行多重比较结果

ＭｕｔｉｐｌｅＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ

（Ｉ）黟ｏｕｐｌ（Ｏ秒ｏｕｐｌＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅＳｔ＆ＥｒｒｏｒＳ碡

Ｌｏｗｃｒ０４）ＢｏｕｎｄＵｐｐｅｒＢｏｕｎｄ

四、ＳＣＳＡ参数ＣＯＭＰａｔ与形态参数的相关性分析

９２名受试对象的ＳＣＳＡ参数与对应的形态学分析结果性相关性分析ｒ：一０．１９４，Ｐ＝０．０６４。表明精子ＤＮＡ碎片率与精子正常形态无显著线性相关（见图２）。

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图２关于精子形态和ＤＮＡ碎片率的散点图

五、精子ＳＣＳＡ参数与精子头部形态的对比分析

先计算精子头部形态异常率（头部缺陷精子数／缺陷精子总数），将精子头部形态异常率分为＜９０％和之９０％两组，比较两组ＳＣＳＡ参数差别具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）（见表５），表明精子ＤＮＡ碎片率与精子头部缺陷存在着某种联系。

表５精子头部形态异常率与ＣＯＭＰａｔ参数的对比分析

≥９０％ＣＯＭＰａｔ均值士标准差１８．４１士１２．５４２６．７８士ｌ６．７３两组比较结果Ｐ＝０．０１２６

六、精子形态正常者的ＤＮＡ碎片率情况

９２名受试对象中精子形态≥１５％者３４名，其中有１４名对象ＣＯＭＰａｔ参数＜１５％，占４１．１８％；同时也有５名对象ＣＯＭＰａｔ参数≥３０％，占１４．７１％（见表６）。１２

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表６精子形态正常者ＣＯＭＰａｔ参数情况１３

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精液质量评估一直是男性不育评估的重点。最近二十年来，随着临床诊疗水平以及实验方法学的不断发展，精液质量评估逐渐趋于完善。精子活力、密度测定以及精子形态分析等已经被广泛应用于男性不育评估、临床诊治，尤其是精子形态分析一直以来被认为是精液质量评估的重要指标，也一直被认为是辅助生殖技术最重要的参考和预测指标。目前大多数生殖医学中心仍然是通过传统精液分析来对不育男性精液样本进行评估，但这并不能完全排除其他男性因素的影响［１Ｍ２ｌ。随着对精子ＤＮＡ损伤研究的深入，精子ＤＮＡ损伤在男性生育力评估及对辅助生殖结局的作用变得更加重要。

一、精子ＤＮＡ损伤的检测技术

目前关于精子ＤＮＡ损伤检测的方法比较多，本次研究采用的ＳＣＳＡ分析法是通过具有统计学意义严密性的流式细胞仪，来对每份精液标本分析至少５０００个精子细胞。精子经过低ＰＨ值的缓冲液处理后，能使精子ＤＮＡ链在断裂处变性。然后经过吖啶橙染色处理，使双链ＤＮＡ显绿色荧光，而使单链ＤＮＡ显红色或橙色荧光。最后再计算含有断裂ＤＮＡ的精子细胞的百分比（即％ＤＦＩ或ＣＯＭＰａｔ参数）。ＳＣＳＡ检测法的发明人Ｅｖｅｎｓｏｎ［２３】在其报告中指出：ＳＣＳＡ检测法是一个有统计学意义的检测工具。其检测方法是唯一的，能够给临床提供可信的不育和可生育男性ＤＮＡ碎片率的参考值范围，并且也显示了对临床的妊娠的预测价值，此项检测技术无可置疑的而价值在于其检测结果的稳定性，以及较小的内部及个体相互间的变异性。本次研究为确保实验数据的精确性，严格按照Ｅｖｅｎｓｏｎ等人的方法进行：试剂配制方面尽量做到精确；参考样品使用上做到严格控制；在检测每一份精液样本前后，均严格按照程序清洗样本通道。在进行ＳＣＳＡ预实验阶段，我们曾对同一份精液样本进行５次反复检测，发现５次检测结果相互之间的差异未超过均值的１０％。进一步证实ＳＣＳＡ在精子ＤＮＡ碎片检测方面的稳定性和精确性。１４

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二、精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性分析

有不少研究试图寻找传统精液参数与精子ＤＮＡ完整性的相关性【１３ｔ１４ｔ

有的认精子形态与精子ＤＡＮ碎片率相关，有些认为这种相关性不显著，但在有些观点上具有共同点，例如形态学分析正常的精子也可能存在高水平的ＮＤＡ碎片率，精子ＤＮＡ碎片率主要与精子头部异常有关。本次研究虽然得出精子形态与精子ＤＮＡ碎片率无显著相关的结论，但关于精子形态学分析正常的精子也存在高水平的ＤＮＡ碎片率以及精子ＤＮＡ碎片率主要与精子头部异常有关的观点与上述研究相符。本次研究的对象中精子形态学分析正常的患者共３４名，但其中有５名患者％ＤＦＩ≥３０％。Ｃｅｌｉｋ．Ｏｚａｎｃｉ掣１７１研究１５为男性的精液，使用相差显微镜和荧光原位杂交通过同样精子细胞Ｘ、Ｙ、ｌＯ、１１、１７号染色体的着丝粒探针以评价人类精子形态和染色体变异，他们发现正常形态精子可以有染色体的变异，并总结精子形态并无益于选择正常倍型的精子以进行ＩＣＳＩ。Ｂｕｒｒｅｌｌｏ等【１８】评估了少弱畸精症的１０名患者和６名年龄相似的正常男性的精液，研究人员采用ＷＨＯ推荐的相同标准分析形态，但不是用巴氏染色。每一个精子均用电子镜下定位。玻片标本用原为荧光杂交法检测Ｘ、Ｙ、１２号染色体。该项研究显示少弱畸精症患者形态学正常的精子伴有不正常染色体组成的几率与头部异常的精子发生率是相似的。

三、精子ＤＮＡ碎片检测在辅助生殖领域的临床价值

目前辅助生殖技术尤其是ＩＶＦ和ＩＣＳＩ主要是以精液常规参数尤其是精子形态作为主要参考指标，现在看来，我们应该同时关注所选用的精子是否存在ＤＮＡ损伤的问题。大量研究表明男性精子ＤＮＡ损伤在不育男性中是普遍存在的，同时也观察至ＵＩＣＳＩ后代存在遗传学或基因表型异常的，促使我们应该进一步探索精子ＤＮＡ损伤的问题。Ｅｖｅｎｓｏｎ掣９１采用精子染色质结构分析试验所得出的ＤＮＡ碎片指数来评估精子ＤＮＡ的断裂程度，并被认为是一个能预测助孕治疗的独立因素。Ｋｕｃｈｉｎｏ等【ｌ９】研究表明：如果脱氧核苷酸存在可测量的损伤（比如ＤＮＡ碎片）可能导致ＤＮＡ复制过程的判读错误，而这可以导致新的突变。Ｔｅｓａｒｉｋ等【２０，２１，２２１分析了ＩＣＳＩ失败和精子ＤＮＡ碎片的关系。不良的ＤＮＡ损伤并不造成可见的受精卵的形态异常，但后期的男方影响与增高的精子ＤＮＡ碎片有关。同时推测精子１５

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性ＤＮＡ碎片并不阻碍受精，但可能阻碍囊胚的形成和／或胚胎的发育。

关于精子ＤＮＡ损伤与辅助生殖结局的关系最具代表性的是两篇Ｍｅｔａ分析。其ｅｆｌＥｖｅｎｓｏｎ等人【２３】在２００６年做过一项Ｍｅｔａ分析，其目的在于验证精子ＤＮＡ碎片与体内受精、ＩＵＩ、常规ＩＶＦ和ＩＣＳＩ所获得妊娠之间的关系。此项荟萃分析所选择的文献都是采用ＳＣＳＡ的检测方法来评估精子ＤＮＡ的断裂程度。其结论是：ＳＣＳＡ完整性检测能够显著预测体内受精、ＩＵＩ、常规ＩＶＦ助孕中所降低的成功率，以及预测碎片率对ＩＣＳＩ受精的次要影响。Ｚｉｎｉ等人１２４１在２００８年也做过一项Ｍｅｔａ分析，其中包括了１１项关于妊娠流产的研。其报告最后指出：精子ＤＮＡ损伤是与ＩＶＦ以及ＩＣＳＩ助孕治疗后妊娠风险增加相关的，这些数据为在ＩＶＦ或ＩＣＳＩ助孕前是否要进行进行精子ＤＮＡ损伤的评估提供了临床指示，并且为进一步的研究精子ＤＮＡ损伤与流产的相关性提供了理论依据。

首先，在ＳＣＳＡ试验方面，由于实验程序复杂，试剂配制等工作繁琐而要求精确，我们又受到实验设备欠缺、实验条件差的限制，ＳＣＳＡ试验结果在精确性上仍然有所欠缺。我们期望随着试验技术的不断发展，ＳＣＳＡ试验也能逐步改进使其程序更加简化，以便保证更好的保证操作上的精确性。

其次，在受试的９２名患者中，精子正常形态＜４％者共１１名，这一部分患者样本含量偏少，其ＣＯＭＰａｔ参数是否具有代表性我们不能十分肯定，在今后的研究中，我们将继续增加这一部分样本量，使其更具有统计学意义上的说服力。

最后，本次研究未能进一步探讨精子ＤＮＡ损伤对我们临床上辅助生殖结局的具体影响，我们对于精子ＤＮＡ损伤与辅助生殖结局的关系的结论主要来源于对大量参考文献的学习。在今后的研究中，我们将把精子ＤＮＡ损伤的检测逐步应用到辅助生殖临床中，进一步探讨精子ＤＮＡ损伤对辅助生殖结局及其他不育结局（如复发性流产）的影响，进一步验证精子ＤＮＡ损伤的检测在男性不育中的临床应用价值。１６

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

１．精子ＤＮＡ碎片率与精子正常形态无显著相关性：精子ＤＮＡ碎片率可能主要与精子头部的缺陷相关；

２．精子形态正常的男性亦可存在高水平的ＤＮＡ碎片率；

３．仅仅将形态学上正常的精子作为助孕治疗中最重要的筛选标准显然是不够的；

４．我们应该完善不育男性的精子ＤＮＡ损伤的检测，找寻有效的治疗方法，进一步提高助孕的妊娠率及有效预防ＩＣＳＩ后代的可能的遗传风险的发生。

总之，精子ＤＮＡ损伤的检测应该尽快被纳入男性不育临床评估，尤其是那些主要因为男性因素所致的不育夫妇在考虑进行助孕治疗时，我们推荐先行男性精子ＤＮＡ损伤的筛查。１７

中山大学硕十学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

１．ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｏｎ．Ｌａｂｏｒｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌｆｏｒｔｈｅｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｕｎｍａｎ

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３．ＶａｎＷａａｒｔＪ，ＫｒｕｇｅｒＴＦ，ＬｏｍｂａｒｄＣＪ，ｅｔａ１．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅｏｆｎｏｒｍａｌｓｐｅｒｍ

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ｌＲｓｐｅｒｍｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｎｔｅｇｒｉｔｙ

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ｒｉｓｋｏｆａｂｏｒｔｉｏｎａｆｔｅｒｐｒａｇｎａｎｃｙｉｎｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｔｒａ－ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｐｅｒｍｔｉｏｎ：ａｓｙｓｔｉｍａｔｉｃ

２６６８ｒｅｖｉｅｗｓａｎｄｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｈｕｍｉｎｊｅｃ－Ｒｅｐｒｏｄ，２００８，２３（１２）：２６６３―

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精子ＤＮＡ损伤在男性不育评价中的研究现状

精子质量检测是诊断男性不育症的重要手段，目前进行的精液分析已不能全面评估男性生育力，且约有１５％的男性不育症患者精液检查是正常的，因此有必要探讨新的不育评价指标，完善男性生育力的检测。近几年来精子ＤＮＡ损伤的问题受到关注，精子ＤＮＡ的损伤能够影响精子的受精能力、受精卵的分裂，以及胚胎的发育，在男性不育症患者的评价中越来越受到重视。精子ＤＮＡ损伤程度被认为是一个新的评价精液质量和预测生育能力的指标，

一、精子ＤＮＡ的损伤机制

（一）、精子形成过程异常在精子形成过程中，精母细胞分裂时自身监控功能出现缺陷，将会导致异常精母细胞的继续分裂，从而产生携带损伤ＤＮＡ的精子；另外精子成熟过程中“染色质浓缩”使精子核染色质呈紧密状态，增加了核ＤＮＡ对外界环境的适应性。与体细胞松散的染色质不同，人类精子ＤＮＡ双链形成的是与鱼精蛋白分子（主要是精氨酸）缠绕形成的高度有序的紧密环。这种特殊结构，即鱼精蛋白中尤其是巯基Ｓ．Ｈ不断氧化成二硫键Ｓ＝Ｓ与ＤＮＡ紧密结合，使其更具有抗酸能力，染色质浓缩，从而使染色体结构稳定Ⅲ。如果染色质浓缩过程异常，形成松散结构的染色质，易受环境因素的攻击（如高热、氧化应激等），造成精子ＤＮＡ损伤。在染色质浓缩过程中导致精子核ＤＮＡ损伤的主要环节是鱼精蛋白替代组蛋白时出现异常‘２１。Ａｏｋｉ等ｂ１也证实：鱼精蛋白．１（Ｐ１）或鱼精蛋白．２（Ｐ２）浓度降低的不育患者精子ＤＮＡ损伤明显增高。因此鱼精蛋白缺陷也是导致精子ＤＮＡ损伤的原因之一。

（二）、氧化应激氧化应激主要由精液中活性氧（Ｉ的Ｓ）和精浆抗氧化能力不平衡所产生。在生殖系统各个器官和组织中，ＲＯＳ产生是一种生理现象，少量适当的ＲＯＳ有助于精子的或能和项体反应；高水平的ＲＯＳ可导致ＤＮＡ单链的形成和双链的断裂，从而影响精子染色质的完整性Ｈ１。男性生殖系统中高水平的

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性ＲＯＳ主要由精液中自细胞和非成熟精子细胞产生，精液中增多的白细胞可以刺激人类精子产生ＲＯＳ，这种刺激可以通过细胞．细胞接触或白细胞所产生的可溶性产物等多种途径介导‘５１。约有２５％的男性不育患者精浆中具有高水平的ＲＯＳ，而且ＲＯＳ的升高与精子ＤＮＡ损伤有显著相关性哺１。Ｌｉｕ等‘７’报道：Ｈ２０２是精液中所产生的主要ＲＯＳ，睾丸特异性细胞色素Ｃ（Ｔ．Ｃｅ）能保护精子免受Ｈ２０２的损伤，而精子中高浓度的Ｈ２０２能诱导ＤＮＡ断裂、脂质过氧化，结果导致细胞死亡。Ｍｅｎｅｚｏ等随１报道：抗氧化治疗可使精子ＤＮＡ损伤减少，表明这种减少至少部分原因与Ｉ的Ｓ有关。另外雌激素和精索静脉曲张等多种疾病及不良生活习惯均可能引起局部氧自由基增加，导致氧化应激，并最终损伤精子ＤＮＡ，包括精子膜脂质过氧化、精子代谢异常、精子活率与受精能力下降等。

ＲＯＳ对ＤＮＡ完整性的影响机制可能有：ＤＮＡ核酸含有亲核基团，活性氧自由基能与其碱基反应使ＤＮＡ链聚集，从而改变ＤＮＡ正常结构。活性氧可直接攻击超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和谷胱甘肽．过氧化物酶（ＧＳＨ．ＰＸ）一结构，Ｈ２０２是ＳＯＤ歧化的产物，高浓度的Ｈ２０２可还原ＳＯＤ的辅基Ｃｕ２＋为Ｃｕ＋，改变ＳＯＤ活性基团，使其中组氨酸转化为丙氨酸，伎ＳＯＤ结构和构型发生改变，活性减弱或丧失。ＳＯＤ和ＧＳＨ．ＰＸ的合成和再生减少，最终导致ＳＯＤ含量显著降低。多数学者认为活性氧自由基除了可以直接造成ＤＮＡ链断裂外，主要是通过脂质过氧化作用影响ＤＮＡ，引起ＳＯＤ基因表达的变化，使之合成减少‘９１。

（三）、精子凋亡异常精子发生过程中有超过７５％的精子细胞通过细胞凋亡的途径被破坏¨∞。生精细胞的选择性凋亡避免了精子过多生成和中止了异常精子生成，对于维持精子数量和质量具有重要作用。而精子发生或运输过程中的凋亡异常可能是精子ＤＮＡ损伤的机制之一。Ｓａｋｋａｓ等提出，某些ＤＮＡ损害的精子会逃脱凋亡ｎ¨。有证据提示，许多质量不好的精液中缺乏精子正常凋亡，使异常精子的清除减少。涉及精子凋亡的一个因素是细胞表面蛋白，生精细胞表面可表达凋亡蛋白Ｆ嬲，而支持细胞则表达Ｆａｓ配体（ＦａｓＬ），Ｆａｓ／ＦａｓＬ途径可能是控制精子凋亡的重要途径¨∞。然而，Ｓａｋｋａｓ等用ＴＵＮＥＬ法测定的Ｆａｓ阳性精子群与ｐ５３无相关性，说明凋亡异常是否能解释不育男性患者中精子ＤＮＡ损伤，仍不清楚¨＂。近几年亦有文献表明活性氧可诱导精子凋亡，导致精子ＤＮＡ损伤，三者之间可能存在相互关联。ＲＯＳ可诱导Ｆａｓ和Ｆａｓ－Ｌ表达，通过Ｆａｓ／ＦａＳ－Ｌ

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性结合的外部途径调控精子凋亡¨们。线粒体是ＲＯＳ产生的主要产所，当ＲＯＳ超过生理浓度时，能致ＤＮＡ断裂或使其选择性地对离子通透性丧失或使线粒体膜通透性发生改变，导致线粒体膜势能发生改变，进而引起线粒体释放细胞凋亡蛋白酶激活因子．１，通过内部途径调控精子凋亡ｎ５１。

二、影响精子ＤＮＡ损伤的因素精子ＤＮＡ损伤可由很多原因造成，精子ＤＮＡ损伤可能为单因素造成亦可能为多种因素共同作用的结果。根据国内外相关报道证实，以下因素可造成精子ＤＮＡ损伤发生率增高。

（一）、化学治疗和放射治疗导致精子ＤＮＡ损伤

放化疗是肿瘤患者提高生存率和治疗效果的重要途径，但同时亦带来许多副作用。在经过肿瘤特异性治疗和细胞毒性药物治疗后，往往导致不育发生，其原因可能是快速增殖的睾丸生精上皮是放化疗的天然作用靶位，放化疗在杀死肿瘤细胞的同时，也可损害生精上皮‘１６’１＂。Ｓａｋａｍｏｔｏ等‘１７１指出：有患者经过肿瘤放化疗后严重影响生育能力，进行卵胞浆内单精子注射技术（ＩＣＳＩ）后仍然不能受孕。Ｓｐｅｒｍｏｎ等¨８’对双侧睾丸生殖细胞癌患者进行化疗前后激素水平测定，结果显示：标准剂量化疗不会导致血清睾酮水平显著降低，但会使血清ＦＳＨ和ＬＨ水平增高。其机制可能是化疗损伤生精上皮，导致精子生成异常，通过反馈机制引起血清ＦＳＨ和ＬＨ水平增高。但放化疗引起精子ＤＮＡ损伤的具体机制仍有待进一步研究。

（二）、高龄因素及生活方式

随着社会进步及生活方式的变化，高龄父母生育孩子越来越多见，亦越来越引起社会关注，主要是年龄与异常妊娠及出生缺陷存在关联。女性随着年龄增加其生育力也逐渐下降主要归因于卵母细胞的丢失，高龄产妇容易导致流产、出生缺陷。尽管男性老年化时精子发生过程仍能正常进行，但ＳｌｏｔｃｒＥ等¨９１已证实男性生育力随诊年龄增加而降低，但未能阐明精子ＤＮＡ完整性异常的主要类型（基因突变、易位、缺失、染色体出现单、双链断裂和非整倍体等）于男性年龄的依存关系。Ｓｃｈｍｉｄ等砼０１对８０位不吸烟健康人群（平均年龄４６．４岁）用单细胞凝胶电泳实验进行精子ＤＮＡ损伤检测，结果显示男性年龄增长和精子ＤＮＡ损伤有关联。同时指出：每天喝３杯或更多咖啡的人群，其精子ＤＮ―识链断裂发生率大大增加，所以认为精子ＤＮＡ损伤与咖啡因摄入量呈正相关。

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性耪子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

正常人类阴囊的低温条件可为睾丸的生精过程提供适宜环境。睾丸温度升高会影响精子的发生过程。ＢａｎｋｓＳ等‘２ｎ用小鼠实验研究睾丸温度升高对不育的关系，结果证实：阴囊温度升高可导致精液质量和ＤＮＡ完整率均下降。其机制可能是：作用在睾丸和附睾的热应激导致冷诱导ＲＮＡ结合蛋白（Ｃｉｒｐ）表达减少，而使生殖细胞凋亡增加，造成生精能力丧失。导致ＤＮＡ损伤的机制可能为：高热造成组氨酸／精氨酸比例增高，及组蛋白与鱼精蛋白比率增加，最终导致ＤＮＡ结构改变，使精子ＤＮＡ损伤。一些生活方式如桑拿、热浴、直接睾丸热疗以及长时间使用电脑和驾驶等都可使阴囊温度升高。目前高温对人类睾丸生精过程的影响和ＤＮＡ损伤的机制仍有待进一步研究。

（四）、吸烟与生殖道炎症

目前有较多文献探讨吸烟与男性不育的关系。Ｒａｍｌａｕ―Ｈａｎｓｅｎ等‘２２１对２５４２名健康男性进行检测，结果显示吸烟与精液量、精子数目和活率呈负相关；吸烟对精子ＤＮＡ有负面影响。Ｓｅｐｅｎｉａｋ等‘２３１用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（ＴＵＮＥＬ）检测５１名吸烟男性和５７名不吸烟男性的ＤＮＡ损伤程度，结果吸烟者ＤＮＡ断裂率显著高于不吸烟者，证实吸烟对精子核质量有损伤。吸烟导致精子ＤＮＡ损伤的原因可能是精液中自细胞产生的活性氧类物质增多，但具体机制仍有待进一步研究。Ｓａｌｅｈ等ｎ４１研究表明吸烟者精液白细胞聚集比不吸烟者高４８％，ＲＯＳ水平高１０７％，ＲＯｓ－＿ＴＡＣ积分低ｌＯ分，可见吸烟可以增加精液氧化胁迫；但是该实验还发现在吸烟和不吸烟的不育者之间精液常规、ＤＮＡ损伤参数没有统计学意义，因此研究者只是谨慎地提出精子氧化胁迫对生育有潜在的负面影响。他的另一项关注氧化胁迫与精子ＤＮＡ损伤关系的研究则显示，氧化损伤对精子受精能力的影响及其程度在一特定个体内是恒定相关的，与吸烟无关‘２５１。因此吸烟与精子质量的关系还有待于进一步研究证实。

生殖道感染性疾病是导致男性不育的重要因素之一。生殖道感染和非特异性炎症增加了精子的ＤＮＡ损伤，其原因可能为精液中自细胞数量增加‘２６’２”，引起局部氧自由基增加导致氧化胁迫最终损伤精子ＤＮＡ。

（五）、环境毒素人们密切接触并赖以生存的环境是男性不育的影响因素之一，环境因素与精

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性子ＤＮＡ损伤之间存在一定关系。Ｒｕｂｅｓ等‘２盯对间断性暴露于高于美国空气质量标准环境中生活的捷克人进行精子染色质结构分析试验（ＳＣＳＡ），结果显示：暴露于空气污染环境中的人，精子ＤＮＡ损伤率有明显增高。亦有大量文献表明环境中有多种污染物均能对男性生殖系统产生损害。尿中邻苯二甲酸酯单酯酶和氧化产物均与精子ＤＮＡ损伤有显著相关性眨∞。丙稀腈（ＣＡＮ）或其代谢产物作为体内一种多效应遗传毒性物质，可以诱导生精过程中精子ＤＮＡ链断裂心９１。农药也能对精子ＤＮＡ产生损伤。甲苯、２，４，６．硝基甲苯及其代谢产物等均可诱发精子ＤＮＡ氧化性损伤‘３∞。精浆中的镉可以影响精子质量和氧化性ＤＮＡ损伤，硒则能使人类精子细胞免受氧化性ＤＮＡ损伤‘３¨，铁毒性也会增加精子ＤＮＡ损伤１３２｝。总之，多种环境毒素均能对精子ＤＮＡ造成损伤，损伤机制大部分为氧化性损伤。

精索静脉曲张是导致男性不育的重要原因之一，有报道在精索静脉曲张患者中１５％．２０％可出现不育。Ｓｍｉｔｈ等研究表明‘３３’３４１：即使精液常规分析正常，精索静脉曲张也是导致睾丸功能继发性损害和不育的危险因素之一。同时指出：精索静脉曲张患者在性精索静脉曲张结扎术后，精子ＤＮＡ完整性能够得到显著提高，同时术后患者精浆抗氧化能力增强，而使氧化应激减弱。汤洁等‘３”通过对精索静脉曲张患者及正常者应用精液参数测定和精子染色质结构分析进行对比发现：精索静脉曲张组精子运动参数有明显改变，表现为运动速度明显减慢且摆动性增加。同时认为精索静脉曲张可引起精子ＤＮＡ损伤比例大幅度增高，精索静脉曲张组的生育潜能按照Ｅｖｅｎｓｅｎ等‘３们提出的评估办法评估处于中低级。

三、精子ＤＮＡ损伤的检测技术

随着对精子ＤＮＡ损伤在男性不育中重要性的逐步认识，精子ＤＮＡ损伤的检测技术也随之不断完善和发展。目前精子ＤＮＡ完整性的检测技术主要有以下几种：

（一）、荧光原位杂交技术（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）ＦＩＳＨ是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与介导分子结合，杂交后再通过免疫化学过程连接上荧光染料，在核中或染色体上相应的ＤＮＡ序列上显示杂交信号。其最大优点是可以与间期细胞核杂交，测定染色体

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性非整倍体率，这可以省去由细胞培养获取中期相的麻烦，对一些体外不能分裂的细胞如人的成熟精子尤为合适。ＦＩＳＨ主要用于精子染色质非整倍体的研究。目前已从单色ＦＩＳＨ分析发展为三色ＦＩＳＨ和多色ＦＩＳＨ，同时对精子的多条染色体进行整倍体的研究，能够更全面地了解非整倍体与男性不育的关系。此方法简便，可大批量分析，逐渐取代传统精子一仓鼠卵融合技术。

（二）、精子染色质结构分析试验（ｓｐｅｒｍｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｓｓａｙ，ＳＣＳＡ）ＳＣＳＡ的方法与原理是：受到损伤不成熟精子的鱼精蛋白ＳＨ没被氧化，形成松散结构染色质，ＤＮＡ在酸的作用下变性成单链。吖啶橙（ＡＯ）可与双链ＤＮＡ结合呈单体形式发出绿色荧光，与单链ＤＮＡ结合呈聚合物形式发出红或黄色荧光。然后通过配有专用软件的流式细胞仪可进行数据处理得出ＳＣＳＡ参数。ＳＣＳＡ参数有：ａｔ、ＣＯＭＰａｔ（ｃｅｌｌｓｏｕｔｓｉｄｅｔｈｅｍａｉｎｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、ＳＤａｔ、％ＨＩＧＲＥ（ｈｉｇｈｇｒｅｅｎｓｔａｉｎａ－ｂｉｌｉｔｙ）。ａｔ是红荧光占总荧光的分数［红／（红＋绿）１，反映单链ＤＮＡ精子；ＣＯＭＰａｔ是主群以外的精子占总精子的百分数，ＣＯＭＰａｔ反映双链ＤＮＡ精子；ＳＤａｔ是毗分布的标准偏差；％ＨＩＧＲＥ称为对绿可染性高的精子百分数，其精子核未完全缩合使染料的插入力增强，ＤＮＡ可染性增加，它与圆精子细胞有关。其中对临床最

有用的两个参数是ＣＯＭＰａｔ和％ＨＩＧＲＥ，这两个数值的大小对生育力的评估具有重要意义。ＳＣＳＡ的创始人Ｅｖｅｎｓｏｎ等玎们对ＳＣＳＡ参数用于男性生育力的评估和预测亚ｌ临床不孕进行了大量研究，得出评估人生育潜能的阈值：ＣＯＭＰａｔ为０＂＂１５％时具有高生育潜能；１６％～２９％具有中生育潜能；＞３０％具有低生育潜能；８０％＂－－９０％无生育能力。ＳＣＳＡ参数是独立于常规精液参数以外的特殊检验参数，反映了不同精子染色质构象结构的异质性，该方法快速、简便、客观，已经成为染色质完整性检测的“金标准”。

（三）、彗星试验（ｃｏｍｅｔａｓｓａｙ）又称单细胞凝胶电泳（ｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｇｅｌｅ－ｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＣＧＥ），由Ｏｓｔｌｉｎｇ和Ｊｏｈａｎｓｏｎ首先提出，后经Ｓｉｎｇｈ等进一步改进和完善的在精子细胞水平上检测ＤＮＡ损伤与修复的方法。以后被逐渐运用于检测精子ＤＮＡ链断裂情况，以评价精子的质量和损伤。基本原理是：当精子细胞ＤＮＡ出现断裂时，使ＤＮＡ超螺旋变得松散，同时由于暴露了负电荷，损伤ＤＮＡ片段在电场力作用下从核内迁出，向阳极迁移，从而形成“彗星”样脱尾，然后在

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性荧光显微镜下进行分析。Ｃｏｍｅｔ试验可检测精子单双链的断裂损伤、抗氧化损伤、遗传毒理学等研究，所需样品和细胞数量少，且灵敏度较高。

（四）、原位末端标记法（ｉｎｓｉｔｕｅｎｄ－－ｌａｂｅｌｉｎｇ．ＩＳＥＬ）是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞中的单股或双股链相结合，并通过一定的显示系统使之显示出来。ＩＳＥＬ有两种：原位缺口平移法（ｉｎ

ＩＳＮＴ）和末端转移酶介导的ｄＵＴＰ末端标记法（ｔｅｒｍｉｎａｌ

ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｓｉｔｕｎｉｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ｄｅｏｘｙｎｕｃ．１ｅｏｔｉｄｙｌｌａｂｅｌｉｎｇ，ＴＵＮＥＬ）。ＴＵＮＥＬ法近来常用于评估精子细胞凋亡的情况，基本原理是凋亡精子细胞内源性核酸内切酶被激活而将自身ＤＮＡ切断成缺口或含１８０＂－２００ｂｐ的３．ＯＨ末端片段，利用ＴｄＴ将标有标记物的脱氧核苷酸（如ｄＵＴＰ）转移到３一ＯＨ末端，结果可用流式细胞仪、荧光显微镜或光学显微镜检测。正常精子细胞没有或只有少量的３．ＯＨ末端，故不会被检测到。ＴＵＮＥＬ法是一种分子生物学与免疫组织化学相结合的原位检测凋亡细胞ＤＮＡ片段的方法，优先标记发生凋亡的细胞而不是坏死的细胞，近年得到了广泛的应用。ＴＵＮＥＬ法可检测凋亡精子，因其灵敏可靠被广泛用于细胞凋亡的研究。但是Ｃｏｍｅｔ和ＴＵＮＥＬ试验有待于建立标准化方法，尚难用于临床精子常规检测。

（五）、精子染色质扩散试验（ｓｐｅｒｍｃｈｒｏｍａｔｉｎｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｔｅｓｔ，ＳＣＤ）由Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ等首先于２００３年提出的一种检测精子ＤＮＡ损伤的新方法，基本方法和原理是：将精子悬液与琼脂糖混合铺于载玻片上，酸处理后溶解细胞去除核蛋白，用ＤＡＰＩ或Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｋ试剂染色，最后用荧光显微镜观察。结果可根据精子ＤＮＡ产生的光晕进行评估，正常的精子ＤＮＡ产生扩散的光晕，而损伤的精子ＤＮＡ则不产生或产生很小的光晕。可能去除核蛋白后，精子染色质结构松散，ＤＮＡ环附于残留的核结构，形成光晕。ＳＣＤ是一种简洁，快速，准确，廉价且不需要很高的实验设备、结果易于分辨的方法。ＳＣＤ试验与Ｃｏｍｅｔ和ＴＵＮＥＬ试验相比，结果不仅取决于

荧光强度和颜色，还很容易肉眼观察到核的扩散状况，易于较精确地统计。但

（六）、８一羟基脱氧乌苷（８一ｈｙｄｒｏｘｙ．２．ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ，８－ＯＨｄＧ）ｆｌＩＪ定法８－ＯＨｄＧ的检测方法较多，目前较为常用的方法是通过液相色谱．电化学检测器（ＨＰＬＣ―ＥＣＤ）等将ＤＮＡ酶水解样品用ＨＰＬＣ分离后用ＥＣＤ测定，是定量测定８－ＯＨｄＧ的有效方法。８－ＯＨｄＧ是反映精子ＤＮＡ氧化损伤较理想的分子生物学标

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性记物，可用来检测ＲＯＳ对精子ＤＮＡ氧化损伤程度。从精子中提取的ＤＮＡ在变性后依次用脱氧核糖核酸酶Ｉ、核酸酶及碱性磷酸酶消化ＤＮＡ，然后用ＨＰＬＣ．ＥＣＤ检测８．ＯＨｄＧ和ｄＧ浓度，结果用ＯＨｄＧ／１０ｄＧ表示。内源及外源性自由基可引起精子ＤＮＡ氧化损伤，在ＤＮＡ受到过量ＲＯＳ攻击时，机体的修复系统并不能纠正所有的损伤，累积在ＤＮＡ链上８．ＯＨｄＧ大量增多，并导致精子结构和功能异常、不育、及子代肿瘤的发生。８－ＯＨｃｌＧ是反映精子ＤＮＡ氧化损伤较理想的分子生物学标记物。８．ＯＨｄＧ测定法具有较高的

灵敏度，需样品量小，是非损伤性的，快速而且选择性好。该方法也有一些缺点，存在ＤＮＡ的不完全酶解，可导致检测值比真实值偏高。

（七）、聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）ＰＣＲ技术主要用于ｍｔＤＮＡ的突变、缺失以及拷贝数的改变，可更精细地研究精子ＤＮＡ的完整性是否异常。此外，用于检测精子ＤＮＡ完整性的实验还有甲苯胺蓝染色（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅｓｔａｉｎ，ＴＢ）和色霉素Ａ３（ＣｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎＡ３，ＣＭＡ３）染色法等。一

综上所述，ＳＣＤ试验等方法成本低，但速度慢，费时费力；８一ＯＨｄＧ测定法等快速，但成本高、准确性低；Ｃｏｍｅｔ和ＴＵＮＥＬ等方法有待于建立标准化，尚难用于临床检测；到现在还没有一个完全符合以上条件的理想方法出现。有条件单位可采用ＳＣＳＡ试验，没条件单位可根据实际情况选择一个较合适方法。随着对检测技术的逐步完善和发展，相信在不久的将来，有希望研究出一种理想的检测ＤＮＡ完整性的方法。

四、精子ＤＮＡ损伤对生育的影响

根据目前文献报道，精子ＤＮＡ损伤对生育的影响主要体现在以下几个方面：受精能力、受精卵的发育、胚胎的发育和子代健康。

（一）、精子ＤＮＡ损伤与受精能力精子ＤＮＡ损伤与男性自然生育能力密切相关，Ｅｖｅｎｓｅｎ等Ｂ７１研究表明：当ＤＮＡ碎片指数（ＤＦＩ）２３０％时，自然妊娠不可能发生。在辅助生殖技术（ｍ订）中，有不少文献报道精子ＤＮＡ损伤影响受精率。在宫腔内注射（ＩＵＩ）中，用末端转移酶介导的ｄＵＴＰ末端标记法（ＴＵＮＥＬ）评估，ＤＦＩ＞１２％时，不能发生妊娠；达到１０‰１２％之问时，会导致流产‘３８１。在体外受精（ＩＶＦ）中，精子ＤＮＡ损伤影响受精几率及胚泡发育‘３蚰。在单精子卵胞浆内注射（ＩＣＳＩ）中，ＤＮＡ损伤与受精和妊娠率之间呈显著负相关，当ＤＦＩ＞３０％

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性时易出现低胚泡率，且不能发生妊娠‘４∞。当然亦有些研究在试图说明损伤的精子ＤＮＡ（ＳＣＳＡ）对受精率和妊娠率的负面影响，但未成功。Ｈｅｎｋｅｌ等Ｈ¨报告了精子ＤＮＡ碎片没有影响到受精率和胚胎碎片率，但是当ＴＵＮＥＬ阳性时（＞３６．５％），ＩＶＦ的妊娠率仍很低。Ｈａｍ－ｍａｄｅｈ等¨２１发现精子核缩合程度不同，对受精率、卵裂率和妊娠率没有影响。总之根据目前的研究结果，精子ＤＮＡ损伤和ＩＶＦ或ＩＣＳＩ中的受精率没有固定关系，尚需进一步探讨；但精子ＤＮＡ损伤对自然受精能力的影响值得肯定，其原因可能是自然受精过程中的各个环节包括精子或能、顶一体反应、精卵结合远比辅助生殖技术中的受精过程要复杂，精子ＤＮＡ损伤对于上述环节的影响仍值得进一步探讨。Ａｐｐａｓａｍｙ等‘４”报道：精子ＤＮＡ碎片化程度与精子前向运动能力呈负相关。而精子前向运动能力是能否使卵子自然受精的关键因素之一。张宁等Ⅲ１应用流式细胞术分析精子染色质结构，并与精液有关参数进行相关性研究发现：精子核ＤＮＡ损伤影响精子头的运动活力即精子的曲线速度、直线速度、平均路径速度变慢，精子头沿曲线轨迹瞬间转折角度的时间延长；但不影响精子运动方式即运动的前向性、摆动性、鞭打频率。但同时也报道：精子染色质结构的完整性与项体完整率无关。

（－－）、精子ＤＮＡ损伤与受精卵发育及胚胎发育目前对于这一关系的探讨，大部分体现在辅助生殖技术的研究中，少部分研究主要与自然流产、习惯性流产有关。Ｉｂｒａｈｉｍ和Ｐｅｔｅｒｓｏｎｔ４５】早在１９８８年就发现反复自然流产的夫妇存在精子ＤＮＡ完整性方面的某种缺陷。Ｃａｒｒｅｌｌ等‘４∞研究表明：精子ＤＮＡ碎片化程度高可能与不明原因的反复流产有关。Ｓｕｄｈｉｎｄｒａ“７１在均衡精子密度、活力、活率、精液量等精液常规参数之后，采用吖啶橙试验（ＡＯＴ）测定两组男性（７４例习惯性流产女性的丈夫和６５例正常生育男性）精子ＤＮＡ的完整性，得出：精子ＤＮＡ完整性损伤是与习惯性流产相关的重要男性因素之一。在ＩＶＦ中，受精卵能否正常发育，在很大程度上取决于原核的质量，Ｂｅｎｃｈａｉｂ等‘４”按照原核核前体的数目和分布将原核形态分组，结果显示：ＤＮＡ碎片化程度高的精子形成形态欠佳发育潜能低的原核的比例高于ＤＮＡ碎片化程度低的精子。他同时指出：精子ＤＮＡ碎片化程度与胚胎种植率呈负相关，ＤＮＡ碎片化程度高的胚胎种植率低。精子ＤＮＡ碎片化程度还决定胚胎质量，影响胚胎发育。Ｍｕｒｉｅｌ等‘４９１研究发现：同一个体的卵子与ＤＮＡ碎片化程度不同的精子结合产生的胚胎质量有明显差异。亦

中山大学硕七学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性有文献报道：精子ＤＮＡ碎片化程度与胚囊形成率呈负相关，当ＴＵＮＥＬ阳性精子比例小于２０％时，胚囊形成比率比该比例大于２０％时提高了５０％。

（三）、精子ＤＮＡ损伤与子代健康ＤＮＡ完整性损伤的精子其受精能力虽然明显下降，甚至影响到胚胎发育，但仍然有可能顺利产下子代。ＤＮＡ损伤精子对后代健康的影响仍然未能阐明，但流行病数据表明，父亲从事工作（接触重金属，化学溶剂，杀虫剂等）跟子代出生缺陷与疾病相关嘞１。而且有文献报道随着男性年龄增加，与碱性位点结合的精子ＤＮＡ损伤或ＤＮＡ单链断裂增加；男性每天大量消费咖啡因会增加精子ＤＮＡ损伤与双链ＤＮＡ断裂，而后受精后精子损伤的ＤＮＡ可以被转换成染色体畸变和基因突变，增加后代发育缺陷和遗传疾病的风险‘２∞。动物实验清楚表明父代长期暴露于致癌因素下会发生精子损伤，并对后代发育产生负面影响，包括子代染色体易位、突变，及畸形，如脑积水、小颌等。

五、精子ＤＮＡ损伤检测的临床意义

常规精液参数分析（精子密度、活力和形态学检查）仅仅是从形态和数量方面对精子进行分析，而在精子功能和受精能力方面提供的信息有限，不能对男性生育力提供全面诊断及预后评估。而精子ＤＮＡ损伤检测可更好地衡量男性生育能力以及预测生殖结局。精子ＤＮＡ损伤检测的临床适应证如下：①计划进行宫腔内人工授精的人群。精子ＤＮＡ检测（尤其是精子染色质结构分析方法）可以很好预测治疗结果。如果男性伴侣有高水平精子ＤＮＡ损伤，夫妻应考虑ＩＶＦ或ＩＣＳＩ；②计划进行ＩＶＦ或ＩＣＳＩ的人群。精子ＤＮＡ检测是目前唯一可能预测辅助生殖结局的方法；③进行生殖学毒理研究及纵向研究报告。ＤＮＡ检测（尤其是精子染色质结构分析方法）具有客观性及高重复性（特别是与常规精液参数检测相比），而且对于冷冻精液标本也具有可行性；④监测后代患病的潜在风险。可以利用ＤＮＡ检测，但尚不确定其是否是最佳检测方法；⑤计划首次怀孕的人群。在有条件的情况下，精子ＤＮＡ检测（尤其是精子染色质结构分析方法）可以很好地预测不孕不育，甚至可以预测不必要的流产的发生。如果男性伴侣精子有高水平ＤＮＡ损害，夫妇可以考虑辅助生殖技术（ＩＶＦ或ＩＣＳｌ），以达到成功怀孕。

六、结语及展望精子ＤＮＡ损伤在男性不育的评价中已得到越来越多的认识，同时也越来越

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性受到重视。相比正常生育男性，不育男性往往伴有更多的精子ＤＮＡ损伤。但是目前关于精子ＤＮＡ损伤的机制、导致不育的机理仍有待于进一步研究。精子ＤＮＡ损伤同辅助生殖结局的关系中诸多细节问题，如胚胎移植率、妊娠率等仍值得探讨。同时精子ＤＮＡ损伤目前也已不仅仅限于对受精能力的影响，还要考虑其对胚胎发育和子代健康的影响。目前也有学者在试图寻找一个ＤＮＡ损伤的有效预测阈值，期望可以很好的预测胚胎发育和妊娠结局。总之，人类对于精子ＤＮＡ损伤的认识仍然处于探索阶段，要全面评价其在男性不育中的意义仍需要进一步的深入研究。

【ｌ】Ｂｏｅ．ｈａｎｓｅｎ

ａｓｓａｙａＳａＧＢ，ＦｅｄｄｅｒＪ，ＥｒｓｂｏｌｌｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｔｏｏｌｉｎＡＫｅｔｔｈｅａ１．Ｔｈｅｓｐｅｒｍｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｔｒｕｅ．ｔｕｒｅｈｕｍａｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙｅｌｉｌｉｅ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ．１２１２００６，２１（６）：１５７６－１５８２．ＭｕｒａｔｏｒｉＭ，ＭａｒｃｈｉａｎｉＳ，ＭａｇｇｉＭ，ｅｔ

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３２ｆａｕｌｔｙｎｕｃｌｅａｒｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ

中山大学硕士学位论文ＳＣＳＡ检测的不育男性精子ＤＮＡ完整性与精子正常形态的相关性

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ｗｉｔｈｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔａｚｏｏｓｐｅｒｍｉａａｆｔｅｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｇｅｒｍｃｅｌｌＳａｋａｍｏｔｏＨ，ＯｏｈｔａＭ，ＩｎｏｕｅＫｅｔａｉ．Ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｔｌｉｌｌｌｏｒ．Ｉｎ［ＪＵｒ０１．２００７，１４（２）：１６７―１７０．

【ｌ８】ＳｐｅｒｍｏｎＪＲ，ＲｍｏｓＬ，ＷｅｔｚｅｌｓＡＭ，ｅｔａ１．Ｓｐｅｒｍｉｎｔｅｇｒｉｔｙｐｒｅ―ａｎｄ

ｐｏｓｔ―ｃｈｅｍｏｔｈｅｒｅｐｙｉｎｎｌｅｎｗｉｔｈｔｅｓｔｉｃｕｌａｒｇｅｒｍｃｅｌｌｃａｎｃｅｒ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ．２００６，２１（７）：１７８１－１７８６．

【１９１Ｓｌｏｔｅａ＂Ｅ，ＮａｔｈＪ，ＥｓｋｅｎａｚｉＢ，ｅｔａ１．Ｅｆｉｅｃｔｓｏｆｍａｌｅａｇｅｏｎｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓｏｆ

ｇｅｒｍｉｎａｌａｎｄｈｅｒｉｔａｂｌｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｉｎｈｕｍａｎｓａｎｄｒｏｄｅｎｔｓ．

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【２０】ＳｃｈｍｉｄＴＥ，ＥｓｋｅｎａｚｉＢ，ＢａｕｍｇａｒｔｎｅｒＡ

［２１】ＢａｎｋｓＳ，ＫｉｎｇＦｅｒｔｉｌＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍａｌｅａｇｅｏｎｓｐｅｒｍＤＮＡｄａｍａｇｅｉｎｈｅａｋｈｎｏｎ－ｓｍｏｋｅｒｓ．ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ．２００７，２２（１）：ｌ８０．１８７．ＳＡＩｒｖｉｎｅＤＳ，ｅｔａ１．Ｉｍｐａｃｔｏｆａｍｉｌｄｓｃｒｏｔａｌｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｏｎ

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ＡＭ，ＡｇｇｅｒｈｏｌｍＡＳ，ｅｔａ１．Ｉｓｓｍｏｋｉｎｇａ【２２】Ｒａｒｒｄａｕ－ＨａｎｓｅｎＣＨ，Ｔｈｕｌ}