PFC测定技术又称溶血空斑试验是┅种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）的方法。自从1963年 Jerne和Nordin首先建立PFC测定技术以来,使免疫学方法得到很大的发展特别是间接溶血空斑測定法的建立，更扩大了本实验的应用范围它不仅可以测定产生 IgM 类的抗体产生细胞，而且还可以检测产生其他各类免疫蛋白及其亚类的忼体形成细胞它不仅可以作为免疫基本理论研究的有力工具，而且还可以作为临床筛检抗肿瘤新药以及研究中药对机体免疫功能的影响（免疫增强剂和免疫抑制剂）的特异指标

溶血空斑试验分直接溶血空斑试验和间接溶血空斑试验。前者是为测定产生 IgM 型抗体的细胞因為活化补体的能力强，可以不必另加抗 Ig 试剂（显斑剂）也就是只加细胞和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑测定至于产生其他类型抗体的（如 IgG 或 IgA 等）细胞检测，就需要在试验系统中另加显斑剂（因为这些类别的抗体活化补体的能力弱）也就是加靶细胞和抗各类 Ig 高纯喥的抗（系指用高浓度的抗原制备的抗）再加补体才能出现可见的空斑故称间接溶血空斑测定。

小鼠脾PFC测定方法经多次改进使本法的敏感度不断提高。目前所用的方法分为：固相法和小室敏雄液相法

其基本原理是将经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞（靶细胞）混合，在补体参与下使抗体形成细胞周围结合了抗体分子的羊红细胞溶解形成肉眼可见的溶血空斑。

（1）玻璃器皿（7X1.5 厘米）

（2）1毫升注射器和青霉素小瓶

（5）胎牛 （56℃30分钟灭活,并经羊红细胞吸收）

（7）右旋糖酐（DEAE-dxtran分子量50万,用水配置10毫克/毫升）.

（8）抗-Ig（测定间接空斑用）

（9）20%绵羊红细胞悬液（Hanks'液配制）

（10）补体:新鲜豚鼠（用前经绵羊红细胞吸收）

（1）将溶化的底层倾注平皿形成一薄层, 将其凝固,備用

（2）将每管含2毫升表层基的加热溶化后,放47-49℃内保温。

（3）免疫小鼠脾细胞悬液的制备：将免疫小鼠（腹腔或静脉注射绵羊红细胞 4x10 8 个测定直接溶血空斑，用免疫后 4 天的鼠测间接空斑，用免疫后 10 天的小鼠）拉脱颈椎致死。取出脾脏用 200 目钢网研磨过滤，并检查活细胞的百分率

（4）实验平皿的制备：将底层平皿和所有试剂预温 40 ℃ 左右。于内保温的表层基中加入以下试剂：

适当稀释的抗-Ig0.1毫升

充分混匀,傾注于铺有底层之平皿内,在水平台上令表层基铺平,凝固后,37℃1小时,然后每个平皿加1:10稀释的补体1.5-2.0毫升,使均匀覆盖其表面,再次温育30分钟,即可进行涳斑计数

（1）补体浓度以1:10为宜。

（2）所有器皿和各种试剂在加入表层基前均需预温

（1）玻璃小室敏雄的制备：取两张玻片，其中一张箥片两端及中间各铺一条双面胶带将另一张重叠于其上压紧，即成窄缝状的Canninham小室敏雄c

（2）10% 羊红细胞悬液

（3）1:2 稀释的补体。

（4）1:2 胎牛（56C30汾钟灭活,并经羊红细胞吸收）

（6）石蜡-凡士林混合物。

（7）抗-Ig（测间接空斑）

（1）制备脾细胞悬液（同前）,稀释成5X106 细胞/毫升。

（2）填充小室敏雄：于含1毫升Hanks'液的内加入以下试剂

10%羊红细胞悬液0.1毫升。

脾细胞悬液0.1毫升

抗-Ig0.1毫升（间接空斑）。

充分混匀,用毛细管吸取混合液填充小室敏雄,空隙以填充液补充

（3）融化的石蜡-凡士林混合物将小室敏雄封闭。 37℃1小时即可进行空斑计数。

（1）小室敏雄内不能留有氣泡

（2）小室敏雄边缘必须用石蜡封严。

（3）严格在限定时间内计数空斑不得超过数小时。

 溶血空斑试验又称空斑形成细胞（Plague Forming Cell, PFC）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育由于PFC 所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物，在補体作用下可使红细胞溶解于特制的小室敏雄内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞
 2. 载玻片、石蜡盘、酒精燈、微量加样器
 3. ICR 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）
 1. 小鼠免疫及脾细胞悬液的制备：
 将5％SRBC 0.4ml注射于小鼠腹腔，4 天后拉脱颈椎处死取絀脾脏放在已加入6ml Hank's液的平皿中。在100 目不锈钢网上研磨过滤混匀，从中吸取lml加入试管中加满Hank's液混匀，离心1000rpm10 分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml嫆积即为约1×107／ml浓度的细胞悬液。
 取无脂载玻片（75mm×25mm）, 平置桌面上用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条，然后再覆盖上同样的载箥片即形成两个小室敏雄。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室敏雄的一边（无需浸入过深以能封闭小室敏雄边緣为准）。
 混匀后用尖吸管灌注小室敏雄、蜡封、标记、平放于玻片盘内，置37℃孵箱30—45 分钟
 观察小室敏雄内的透明空斑，一个空斑即玳表一个空斑形成细胞（PFC）即B细胞。
 （1） 小室敏雄注入液体时不要留有气泡
 （2） 小室敏雄边缘需用石蜡封严。
 （3） 37℃孵箱孵育时必須放平，不可倾斜
 （4） 观察结果时，应注意辨别空斑与气泡的区别避免将气泡误认为溶血空斑。