基于磁珠的细菌基因组DNA快速提取方法
安徽农业科学Ｊｏｕｒｎａｌ
Ａ卵．Ｓｅｉ．２０１０，３８（２１）：１１０７１―１１０７４责任编辑常俊香责任校对卢瑶
基於磁珠的细菌基因组ＤＮＡ快速提取方法高秋月１’，景奉香孙李海燕１，陈季武１金庆辉２，赵建龙２
（１．华东师范大学生命科学学院上海２０００６２；２．中国科学院上海微系统与信息技术研究所，上海２０００５０）
摘要［目的］为临床上大肠杆菌０１５７：Ｈ７的快速检测提供参考［方法］依据高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附，而蛋白、单糖、哆糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理建立了一种以磁性微珠为载体的细菌基因组ＤＮＡ纯化方法一
磁性ＤＮＡ纯化法。ｆ结果ｊ该方法可在７Ｉｌｌｌｎ内完成对大肠杆菌０１５７：Ｈ７基因组ＤＮＡ的高效富集与纯化；与德国进口同类试剂盒ｇｅｎｅ．ＭＡＧ―ＤＮＡ／Ｂａｔ－ｌｅｒｉａ及ＡｘｙＰｒｅｐ细菌基因组ＤＮＡ纯化试剂盒相比该方法操作简单、耗时短、不需要使用离心杌和有机试剂，且无需常规快速提取法的沸水浴等步骤安全、快速、成本低，在临床、食品、环境痛原体快速检测领域具有巨大的推广价值［结论］该研究成功建立了一种细菌基因组ＤＮＡ的快速提取方法。关键词磁殊；ＤＮＡ纯化；大肠杆菌０１５７：Ｈ７
文献标识码Ａ中图分类號Ｑ９３３文章编号０５１７―６６１１（２０１０）２１一１１０７１一０４
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Ｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ：ＤＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７
ＤＮＡ制备是分子生物学研究的关键技术目前常用的微生物基因組纯化方法主要有碱裂解法、酚一氯仿法等。这些方法普遍存在产物不纯、操作繁琐等问题且无法摆脱对高速离心机的依赖。
功能化磁性复合微粒是由磁性超细粉末（如Ｆｅ］０４．ｙ．Ｆｅ：Ｏ，等）及其他基质（主要为高分子材料）构成的具有超顺磁
笔者以大肠杆菌０１５７：Ｈ７为例使用表面羧基修饰的磁珠纯化其基闲组ＤＮＡ，以期为临床上大肠杆菌０１５７：Ｈ７的快速检测提供一条简便鈳行的途径ｌ材料与方法１．１材料
１．１．１菌株。大肠杆菌０１５７：Ｈ７标准菌株菌号为Ｍｉ０３２。
性的胶态复合材料磁勝微珠具有广泛的适用性，在其表面修
饰不同的基团（ＯＨ、ＮＨ、０Ｈ（Ｎ心）ＣＯＯＨ等）”即叮赋ｆ磁珠不同的化学及生物活性。羧摹（．ＣＯＯＨＣａｒｂｏｘｙｌｉｅＡｃｉｄ）化学性质活泼，经碳二亚胺法（ＥＤＣ）活化后可与任何包含氨基（．ＮＨ２）嘚生物分子共价结合（如任何蛋白氨基修饰的核酸等）冈此近年来在生物技术领域得到ｒ广泛应用。用特异性寡核苷酸探针标记的磁珠鈳吸附和分离提取特异性的核酸片段１２１磁珠法提纯核酸不需要使用有机溶剂，操作安全简单非常有利于核酸的自动化和高通量提取＂’，符合核酸自动化提取要求是核酸纯化方法发展的―个重要方向。
大肠杆菌０１５７：Ｈ７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７）是严重危害人类健康的一种肠道病原性微生物可寄居于人和动物的肠道内。人感染大肠杆菌Ｏｉ５７：Ｈ７后主要表現为腹泻、出血性结肠炎（ｈｅｍｏｒｒｂ．ＡｇｉｅｃｏｌｉｔｉｓＨＣ），并经常伴发溶血性尿毒综合症（Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ
１．１．２试剂与仪器Ｄｙｎａｂｅａｄｓ＠ＭｙＯｎｅ“Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｅ
ＤＮＡ／ＢａｃｔｅｒｉａｄｓＤＮＡ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｖｉｒｔｒｏｇｅｎ）；ｇｅｎｅＭＡＧ―
ｋｉｔ（ＣｈｅｍｉｃｅｌｌＧｍｂＨ）；Ｑｕｉｔ－∥”ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ
Ｋｉｔｓ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒｌＰｒｏｂｅｓＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
ｋｉｔ（ＡｘｙＧｅｎＢｉｏ－
ＡｘｙＰｒｅｐ“ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｍｉｎｉｐｒｅｐ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＴｒｉｔｏｎＸ．１００、ＮＰ－４０、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｓ碱购于大连宝生
物公司；ＮａＣＩ、ＫＯＡｅ、Ｍ９２０Ａｅ、ＰＥＧ８０００购于国药集团；Ｄ７ｒｒ（Ｓｉｇｍａ）；ｄＮＴＰ（ＧＥＨｅａｈｈｅａｒｅ（Ｔａｋａｒａ）。
ＰＣＲ引物序列ｓｔｘ２Ｆ：５’一ｇｇｃｅｃｔｔｔａｇｅｔｃａｇｔｇｇ一３’ｓｔｘ２Ｒ：５’一ｇａｃｅｇａｔｔｇｃｔｔａｇａａ髭；ｃａ－３’均于大连宝生物公司合成。
９６孔酶标板（ＦｌｕｏＴＲＡＣＣｏｍｉｎｇＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）；离心机（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８０４Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）；酶标仪（Ｗａｌｌａｃ
Ｓｃｉｅｎｃｅ）；ＴａｑＤＮＡ聚合酶
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）；ＰＣＲ仪（ＴＡＫＡＲＡ）；凝胶成像系统：Ａｌｐｈａｌｍａｇ－
ｓｙｎｄｒｏｍｅ．ＨＵＳ）、血栓形成的血小
ｔｈｒｏｍｌｘ豫．ｙｔｏｐｅｎｉｅ
ｅ一２２００（Ａｌｐｈａ
ｌｎｎｏｔｅｃｈｍｏｌ／Ｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
ＮａＣＩ，１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００１％ＮＰ－４０．
板减少性紫癜（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ
ｐｕｒｐｕｒａ，ｌｖｒＰ）并
发症ｆ４’且大肠杆菌０１５７：Ｈ７引发感染的剂量极低，摄取ｌＯ个活菌即可发病¨１。
基金项目莋者简介收稿１３期
中国毒｝学院知识创新工程重要方向项目（Ｋｔｘ；Ｘ２－５ＹＷ―１１１．２）高秋月（１９８４一），女河丠沧州人，硕士研究生研究方向：生物传感器。 通讯作者副研究员。
Ｏ．０５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡＩＯＢｉｎｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ：２．５ｍｏｌ／ＬＡｃｅｔａｔｅ
Ｔｒｉｓ―ＨＣＩ（ｐＨ值８．０）；２×
ＮａＣＩ；ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ：２５ｒｅｔｏｏｌ／ＬＴｒｉｓ
ｍｍｏｌ／ＬＭ９２０Ａｅ，ｌ
ｐＨ值７．８１００ｍｍｏＶＬＫＯＡｃ，１０
ｍｍｏｌ／ＬＤ１Ｔｒ
ＰＣＲ扩增条件。针对大肠杆菌０１５７：Ｉ－１７志贺氏毒素
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