【摘要】：研究背景胃癌(Gastriccancer)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。近些年来,虽然胃癌的发病率有所下降但其死亡率一直居高不下,成为困扰人类健康的重大难题。从全世界范围来看,胃癌在亚洲地区的发病率最高,在中国位居癌症发病率的第二位。由于现有的胃癌诊断标志物缺乏灵敏性和可靠性以及胃癌早期临床指征不明显,大多数胃癌患者一旦确诊已是晚期,胃癌患者的五年生存率较低。因而,寻找新的诊断和治疗胃癌的灵敏性和特异性高的的靶点成为当务之急。本课题组之前研究发现JMJD2B(KDM4B),即组蛋白去甲基化酶在胃癌组织中高表达,具有促进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的能力。然而,在胃癌发生发展的过程中,JMJD2B的调控机制尚未完全阐明。研究表明,miRNAs是单链非编码的RNA分子,可以在转录后水平调节细胞的一系列生物学功能,包括调控细胞周期以及细胞增殖、分化、凋亡、代谢的进程等。因而miRNA的异常表达能够诱导肿瘤的发生和发展。鉴于此我们推测JMJD2B是否能受到miRNA的调控而参与胃癌的发生发展进程。我们通过生物信息学分析软件预测可以调控JMJD2B表达的miRNA分子,并通过一系列的细胞分子生物学实验验证了miR-491-5p可以调控JMJD2B的表达,参与胃癌的发生发展过程。此外,我们通过检测组织和血清中miR-491-5p的表达发现,miR-491-5p可能作为胃癌早期诊断的标志物。实验目的探讨在胃癌发生发展过程中miR-491-5p调控JMJD2B的分子机制,以及miR-491-5p作为胃癌诊断标志物的潜在价值。实验方法1、以JMJD2B为靶基因,通过四种生物信息学软件(miRDB、miRanda/microRNA.org、Microcosm mimics后对胃癌细胞系迁移能力的影响。4、利用QRT-PCR检测miR-491-5p在胃癌组织以及胃癌患者血清标本中的表达,评估其是否能作为胃癌的潜在诊断标志物。5、利用QRT-PCR检测幽门螺杆菌菌株感染胃癌细胞系后miR-491-5p表达水平变化。实验结果1、四种生物信息学分析软件(miRDB、miRanda/microRNA.org、Microcosm Targets 和 UTR的野生型载体,三个位点的总突变载体以及三个位点的单突变载体。使用双荧光素酶报告基因检测系统,与对照组检测相比,pmiR-RB-REPORT_h-KDM4B WT 与 miR-491-5p mimics 共同转染胃癌细胞系后,胃癌细胞系的荧光素酶活性明显下降(P0.05);而当miR-491-5pmimics与三个位点的总突变载体共转染后,荧光素酶活性未出现明显下降;同时,三个单突变载体分别与miR-491-5p mimics共同转染胃癌细胞系后,荧光素酶活性未出现明显变化,以上结果表明miR-491-5p能够直接结合于JMJD2B 3' UTR端,同时三个结合位点在miR-491-5p对JMJD2B的调控中都发挥作用。3、检验胃癌细胞系的克隆形成实验结果显示,当转染miR-491-5p mimics后胃癌细胞系的克隆形成能力显著受到抑制(P0.05);Transwell基质胶实验结果表明转染miR-491-5pmimics能够降低胃癌细胞系的侵袭能力(P0.05);细胞划痕实验结果显示转染miR-491-5p 3' UTR端的三个位点而抑制JMJD2B的表达以及抑制胃癌细胞系的克隆形成能力、侵袭和迁移能力。2、MiR-491-5p在胃癌组织以及胃癌患者血清中均表达明显降低,提示miR-491-5p可能作为一种新的胃癌诊断标志物。

【学位授予单位】：山东大学
【学位授予年份】：2017

【摘要】：本实验通过猪与人TNF-α基因序列相似性的比对,及与猪miR-369第2-8位种子序列相匹配的靶位点的寻找和对比,预测猪miR-369同样调节TNF-α基因的表达。为了验证这一结果,本实验利用双荧光素酶报告基因系统去检测猪miR-369与TNF-α基因的靶标关系。结果显示： (1) TNF-α基因在人、猪、大鼠、小鼠、牛和家兔中,均具有较高的相似性,其中猪与牛的相似性最高,与人次之。 (2)猪与人的TNF-α基因中,3'UTR区域含有相同核苷酸数目(34 nt)的AREs,且相似性极高。经miR-369第2-8位种子序列碱基匹配预测,在AREs区域两者含有两个相似性极高的miR-369的靶位点。 (3)野生型重组质粒(WT)和突变型重组质粒(MT)构建成功,即野生型的AREs序列和靶位点突变的突变型AREs序列均按正确方向,成功地连接到了双荧光素酶报告基因质粒载体psiCHECKTM-2上。 (4)在对猪髋动脉内皮细胞(PIEC)进行转染时,只有当细胞生长融合度到90%,mimics (miRNA模拟物)与质粒载体共转染的最终浓度分别为50 nM和150 ng时,才能达到最优的转染效果。 (5)单转染的突变型重组质粒(MT)与野生型重组质粒(WT)相比,差异极显著,P0.01,即MT的荧光比值极显著高于WT的荧光比值,表明AREs影响mRNA的稳定性。由于MT比WT少了三个连续的AUUUA五聚体,说明AUUUA五聚体与mRNA稳定性密切相关,且推测mRNA的稳定性可能与AUUUA五聚体的连续性成正相关。即相同个数的AUUUA五聚体,连续性越好,其影响mRNA稳定性越强；连续性越小,其影响mRNA稳定性越弱。 (8)在转录后水平调节mRNA的过程中,AREs与miRNA具有一些相似之处。但当共处时,它们的调节作用互不干扰,或者说影响很少,即使当miRNA的靶位点位于AREs区域中时也一样。 (9)本研究的成功表明了一种筛选动物功能基因的新的途径,能更好地把人类和小鼠等物种上的取得的一些研究成果借鉴到我们动物生产上来,同时本研究还可能为AREs (AU-rich

【学位授予单位】：四川农业大学
【学位授予年份】：2011

【摘要】：目的：筛选与乳腺癌相关的microRNAs (miRNAs)异常表达谱；分析差异性niRNAs与乳腺癌组织中各临床病理特征如雌邀素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(Her-2)、Ki67增殖指数、突变型P53蛋白及增殖细胞核抗原((PCNA)的关系；评估差异性miRNAs作为乳腺癌诊断及预后的潜在价值；明确差异性表达的miR-141及miR-15a在乳腺癌发展过程中所起的作用。 mimics及mimics阴性对照于乳腺癌MDA-MB-231细胞中,采用流式细胞技术分析细胞凋亡和细胞周期；采用CCK-8实验检测细胞活力,Transwell实验观察细胞的侵袭力,划痕实验观察细胞的迁移能力；qPCR技术检测候选miRNAs的靶基因mRNA表达情况；western blotting检测靶基因的蛋白表达。利用双荧光素酶报告实验验证miRNAs的靶基因。 结果： (1)乳腺癌组织(Luminal-like)与其对应的癌旁组织比较,严格以p0.05,基因上调或下调差异倍数2.0倍作为芯片筛选标准,癌组织中有37个成熟型miRNAs上调表达,8个成熟型miRNAs下调表达；Basal-like型的癌组织与Luminal-like型的癌组织比较,严格以p0.05,基因上调或下调差异倍数1.5倍作为筛选标准,有3个成熟型miRNAs上调,4个成熟型miRNAs下调。 miR-15a与miR-141的表达水平与乳腺癌组织中Ki67、PCNA的表达呈负相关(p0.05)。此外,miR-15a还与乳腺癌组织突变型P53蛋白的表达呈负相关(p0.05)。miR-205与患者的年龄相关,在大于50岁的患者中miR-205的表达水平要比小于50岁的患者中更低(p0.05)。 (4)miR-141可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡,使细胞休眠在G1期,抑制细胞G1/S期转化,抑制细胞增殖,降低细胞的侵袭和迁移能力；miR-15a可促进细胞凋亡、抑制细胞增殖。 结论：在乳腺癌发生发展的过程中,miR-130b演致癌基因的作用。miR-141和miR-15a行使抑癌性miRNAs的功能,可能分别通过作用于靶基因ANP32E与SNCG的3'-UTR发挥抑瘤效应。miR-141表达水平的高低与乳腺癌细胞增殖及侵袭能力相关，乳腺癌患者组织中miR-141的低表达提示患者预后不良。

【学位授予单位】：武汉大学
【学位授予年份】：2014