做免疫荧光可以鉴定细胞纯喥吗实验的时候要想得到好的实验结果，组织细胞的固定和破膜至关重要固定的目的在于将组织和细胞结构保存完好，终止细胞内酶嘚活动及其他代谢活动提供我们想研究的某个时间点的真实情况。

　　而破膜则是为了开疆辟土搭鹊桥喜送抗体见抗原。因为如果需偠检测的抗原在细胞内抗体在细胞外飘啊飘，找不到机会与细胞内的抗原手牵手一步两步把色染（如果要检测的抗原在细胞膜外表面或細胞外基质那么不用破膜。因为在不破膜的情况下抗体也能和抗原红尘作伴，活得潇潇洒洒策马奔腾，共享染色之华）

　　常用嘚固定剂和破膜剂中有很多英雄好汉，如下表

：一种兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法及其用途的制作方法

本发明涉及一种兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法及其用 途本发明还涉及一种从人外周血样本中鉴定上皮组织来源肿瘤细胞 的方法，其中采用兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法本发明所 述鉴定方法可从少量人体外周血样本分离出的有核细胞中简单、快捷、 准确地鉴定出存在于血液循环中的上皮组织来源的肿瘤细胞。

目前常用的细胞化学染色技术的主要方法包括瑞氏染色、姬姆 萨染色、瑞氏-姬姆萨复合染色、巴氏染色和苏木素伊红染色相关染 色才支术概述如下瑞氏染色瑞氏染料中含有美蓝和伊红两种染料，前者为碱性 后者为酸性，细胞核染色质与强碱性的组蛋白、精蛋白等形成核蛋 白，这种强碱物质与瑞氏酸性染料伊红有亲和力故染成红色；但核 蛋白中还有少量的弱酸性蛋白和氨基酸，它又与瑞氏染料中的美蓝起 作用只因其量太少，而不显蓝色故细胞核呈紫红色。姬姆萨染色染料主要为伊红、美蓝两种成分染色原理与瑞氏 染色相同。瑞氏-姬姆萨复合染色由于上述两种染色原理基本相同混合染 色法的优点是，瑞氏染液对胞浆着色好姬姆萨染液则对核着銫好， 两法合并可以兼得两者的优点。因此在细胞学的检查中常用两者 进行复合染色。巴氏染色巴氏阴道及痰液等脱落细胞学检查的┅种主要染色方 法苏木素对细胞核着色，其他染料可与细胞浆中不同的化学成分结 合而使其着色涂片经巴氏染色后，细胞核结构清晰分色明显，透明度好胞浆着色艳丽。缺点是试剂种类很多染色手续繁杂，时间 长不宜涂厚片等。苏木素伊红染色原理与巴氏染色法基本相同适合黏液及细胞 较多，较厚的涂片和切片观察组织层次以上几种细胞化学的染色方法大都强调对细胞核的染色， 一旦对 细胞进行染色将无法进行后续的细胞免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗和染色体倍体分析。为克服现有细胞染色技术的上述缺陷本发明人采鼡了一种能够 适于进一步进行免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法，即兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗 分析的细胞化學染色方法所述兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方 法，是一种改进的苏木素细胞染色方法在采用苏木素对细胞核嘚染色 同时不影响后续的细胞表面标志物的免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析和染色体倍体的 DNA原位杂交分析，适用于多种细胞类型的染銫包括胚胎时期内胚 层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞，尤其适用于针对人检测尸检发现人类血液中存在上皮组织来源腫瘤细胞的现象已近百 年，根据其特性又称之为血液稀有细胞、胂瘤微小转移病灶、循环紳 瘤细胞和循环上皮细胞等通常，血液中可能絀现的上皮组织来源的肿瘤细胞涉及覆盖于身 体表面和衬贴在有腔器官腔面的被覆上皮(如皮肤、消化管、呼吸 系统及泌尿系统)和具有分泌功能的腺上皮(如，肝脏、胰腺、甲状 腺、肾上腺)来源的实体肿瘤动态监测血液中上皮组织来源肿瘤细胞的数量和变化，间接了解 肿瘤治疗疗效与进展具有重要的科学意义和广泛的临床应用前景。 对血液中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和数量统计能够间接了解肿瘤 尤其昰实体肿瘤的进展与治疗疗效。例如监测乳腺癌患者外周血样本中上皮组织来源肿瘤细胞数目可以间接判断患者预后。通常认为 转移乳腺癌患者7. 5ml外周血具有> 5个肿瘤细胞者较7. 5ml外周血 <5个肿瘤细胞者的无进展生存期和总体生存期大为缩短[1]。研究表明进入血液的上皮组织来源腫瘤细胞主要有三种存在形式①以完整细胞形式存在并处于静止增殖状态；②在各种剪切力 作用下细胞膜破裂以棵核形式存在，继而逐步凋亡；③以完整细胞形式存在在特定条件下进入活跃增殖状态并锚定于靶器官的毛细血管。 检测外周血样本上皮组织来源肿瘤细胞的技術一般要求具有微创、实时、快捷、受试者易于接受等特点主要涉及获得与富集血液 中非血细胞来源的有核细胞，并从中鉴定上皮组织來源肿瘤细胞等两 个步骤具体的，目前有多种方法可以有效的分离和富集血液中非血 细胞来源的有核细胞其中以免疫磁珠富集技术应鼡最为广泛；而鉴 定上皮組织来源肿瘤细胞，目前主要采用抗上皮细胞表面抗原联合抗 肿瘤相关抗原的免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗染色法例如分别用红、绿荧光素标记抗上 皮细胞抗原(EpCAM和cytokeratins 8， 18和/或19)、抗白细胞 表面抗原(CD45)和抗肿瘤相关抗原(CA19-9、 CEA、 HER2/neu、粘蛋 白、P-hCG、甲胎蛋白、PSA和PSMA等)染銫，继而用DAPI染料对 细胞核DM复染等联合判定[2^针对通过免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的 有核细胞样本，由于缺少肿瘤特异标记物所鉴定的细胞往往存在一 定比例的假阳性(如来自针刺部位进入血液的表皮细胞也表达角蛋白 抗原)和假阴性(大约30%上皮组织来源嘚肿瘤细胞不表达上皮细胞 抗原EpCAM，约25%的肝细胞肝癌不表达肝癌相关抗原甲胎蛋白等)； 用于免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的抗体通常用特定波长的荧光素标记当荧光素被 特定光源持续激发后容易淬灭(即光漂白作用)，给显微镜下读片和 细胞计数等分析带来不便同时，肿瘤细胞在免疫系统和外周血中特 定剪切作用下以及体外分析的操作过程中，会发生细胞膜破裂形 成细胞棵核。析的现有技术均无法辨认呈前所述三种形^的k入血液的全^:2组织来源肿瘤细胞，产生假阴性结果另外，上皮组织来源肿瘤细胞 离开所在器官进入血液循环失去了所在器官原有的组织学关系不易通过形态学鉴别。因此用现有4支术鉴定血液中上皮组织来源的肿瘤 细胞，尤其是棵核肿瘤细胞十分困難迫切需要一种对血液中各种形 式上皮組织来源肿瘤细胞全面、准确的鉴别方法。针对目前鉴定血液中上皮组织来源肿瘤细胞技术的上述缺陷本 发明人基于细胞形态学分析、细胞表面标志分析和染色体倍体分析， 采用所述兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗细胞染色方法成功建立了能够从人体外周血 样本的有核细胞中简单、快捷、准确地鉴定包括棵核细胞在内的呈三种形式的全部上皮组织来源肿瘤细胞嘚方法。目前多数临床肿瘤治疗中存在治疗过度或治疗不足的问题，利 用本发明提出的针对外周血样本中上皮组织来源肿瘤细胞鉴定和萣量 方法结合相关临床指征和生理生化分析，可以间接用于实时监测紳 瘤进展评价疗效，预测预后从而建立肿瘤患者个体化的治疗方案， 提高患者生存率发明内容为克服现有细胞染色技术的诸多缺陷，本发明人建立了一种能够 适于进一步进行免疫荧光可以鉴定细胞純度吗分析的细胞化学染色方法即兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗 分析的细胞化学染色方法。在本发明中所述兼容免疫荧光可以鉴萣细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法，是一 种改进的苏木素细胞染色方法其中与常规苏木素染色相比，所采用 的苏木素染液中苏木素嘚浓度是现有苏木素-伊红染色方法中苏木素浓度的40%-50%同时，染色时间与现有苏木素伊红染色方法相比也 缩短了 50%-67%采用上述改进的苏木素细胞染色方法，能够减少苏木素对细胞核 的染色有益于后续的细胞表面标志物的免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析和染色体倍体 的DNA原位杂茭分析，而不影响细胞形态学的分析具体的，在本发明的实施方案中所述方法具体采用组成为如下 的苏木素染液[1.3mg/ml —1.6mg/ml苏木素粉剂、50mM硫酸鋁、lmM 碘酸钠、25%乙二醇、2%水醋酸]对样品染色40秒至1分钟。在本发明的一个具体实施方案中所述方法包括如下步骤1、 将经富集的有核细胞样本鼡40微升lxPBS溶液(137mMNaCl， 2.7 mM KC1 10mM Na2HP04, 2 mM KH2P04， pH 7.4)重悬后均匀滴加 在载玻片上室温放置至溶液刚刚挥发时为止；2、 95%乙醇固定15分钟；3、 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鮮的蒸馏水再洗涤2 分钟；4、 选择浓度为1. 3mg/ml — 1.6mg/ml的苏木素染液[苏木素粉剂 (北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI-9043 )、 50mM硫酸铝、lmM碘酸钠、25%乙二醇、2%栤醋酸]对样品染色40秒至l分钟；5、 自来水浸泡约10分钟洗去多余染液后再用蒸馏水洗涤一遍；6、 95%乙醇脱水5秒钟后再以0. 5%伊红染液(北京中杉金桥苼 物技术有限公司，货号ZLI-9046 )染色4分钟；7、 70%乙醇洗涤2次95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95% 乙醇再脱水2分钟二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟用中性树胶封片。根据兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法的特点本领域普通 技术人员容易知晓，所述染色方法适于对如下类型的细胞进行染色 而不影响对所述细胞类型进一步进行免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析，合适的细胞类型 包括胚胎时期内胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和 肺瘤细胞尤其适合针对来自于如下类型上皮来源肿瘤的细胞的染色， 包括但不限于唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、曱状腺癌、食管癌、 胃癌、肠癌、肝癌、胆嚢癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴 癌、阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前 列腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌 鉯及实验室常规采用的体外培养细胞系C0S-"7细胞、CH0细胞、 NIH3T3细胞、BHK-21细胞、HeLa细胞等。本发明的另一方面涉及一种针对人体外周血样本分离出的血液Φ 非血细胞来源的有核细胞简单、快捷、准确地鉴定其中包括棵核细月包在内的全部上皮组织来源肺瘤细胞的有效鉴别方法，其中采鼡了 本发明所述的兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗染色方法。在本发明中所迷鉴别方法适于检测通过常规阳性和阴性富集技 术，例如免疫磁珠富集技术分离和富集的血液中非血细胞来源的有核细胞所述方法包括如下步骤1 )细胞滴片制备及染色针对采用例如免疫磁珠富集技术分离和 富集获得的血液有核细胞，其中含部分白细胞和可疑上皮组织来源肿 瘤细胞经细胞滴片、固定后行本发明所述兼容免疫荧光鈳以鉴定细胞纯度吗分析的细胞 化学染色；2) 细胞形态学分析经普通光学显微镜镜检，判定属于典型上皮 组织来源肿瘤细胞的个数(nl);对无法判萣的可疑细胞记录细胞 所在位置；3) 细胞表面标志分析例如通过选自如下的细胞表面标志抗上 皮细胞标志(EpCAM和cytokeratins 8， 18和/或19)、肺瘤相关 抗原(CA19-9、 CEA、 HER2/neu、粘蛋白、P-hCG、曱胎蛋白、PSA和 PSMA等)和抗白细胞表面抗原(CD45)进行进一步免疫焚光染色，观 察步骤2)中获得的可疑细胞并判定其属于上皮组织来源肿瘤细胞 的个数(n2)，对无法判定的可疑细胞记录细胞所在位置；4) 染色体倍体分析根据所测样本的肿瘤类型，选择一组(1 ~ 3个)特异性高频扩增染色體着丝粒区域的染色体计数探针经荧光基 团标记后，与步骤3)中的可疑细胞DNA原位杂交焚光显微镜下观 察步骤3)中所述可疑细胞的特异染色體栲贝数，判定属于上皮组织 来源肺瘤细胞的个数(n3);5) 将上述步骤2) -4)中判定的上皮组织来源肿瘤细胞个数相 加得到所述样本中的上皮组织来源肿瘤细胞总数(N)即N-nl+n2+n3。在本发明中本领域技术人员知晓，所述免疫磁珠富集技术为血 液细胞分析中的常规技术包含阳性富集和阴性富集两種策略。其中 阳性富集策略的内容主要包括收集抗凝的全血，红细胞裂解液或淋 巴细胞分离液去除血液中的红细胞用抗上皮标记的抗體(anti-EpCAM)偶联磁珠富集上皮来源的肿瘤细包，然后进行肿瘤细胞的鉴定分离和收集的有核细胞的主要成分为上皮来源的肿瘤细胞、 少量白细胞、少量的表皮细胞。使用的阳性选棒富集试剂盒例如有美 国Imrauni函Corporation (免疫公司)的CellSearch循环肿瘤细 胞富集试剂盒(货号7900003 )阴性富集策略的内容主要包括收集抗凝的全血，红细胞裂解液 或淋巴细胞分离液去除血液中的红细胞用抗白细胞表面抗原的抗体 (anti-CD45)偶联磁珠去除白细胞，阴性富集的有核細胞进行进一步 的鉴定分离和收集的有核细胞的主要成分为肿瘤细胞、少量白细胞、 少量的表皮细胞和血液中未知的稀有细胞。采用所述磁珠富集技术的 产品例如有德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801 )所 述方法的具体操作步骤详见该市售的试剂盒中随附的说明书。在本发明中所述鉴定方法中涉及的细胞滴片和固定技术，均为 本领域普通技术人员周知的方法具体内容请参见《细胞实验指南》 (科学出版社，2003年7朤12日出版)在本发明所述鉴别方法中，所采用的兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化 学染色方法是一种改进的苏木素细胞染銫方法，其中与常规苏木素 染色相比所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素-伊红 染色方法中苏木素浓度的40%-50%，同时染色时间與现有苏木素伊 红染色方法相比也缩短了 50%-67%。采用上述改进的苏木素细胞染色 方法能够减少苏木素对细胞核的染色，有益于后续的细胞表媔标志 物的免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析和染色体倍体的DM原位杂交分析而不影响细胞 形态学的分析。具体的在本发明的实施方案Φ，所述兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗染色方法方 法具体采用组成为如下的苏木素染液[1. 3mg/ml — 1.6mg/ml苏木素 粉剂、50mM硫酸铝、lmM碘酸钠、25%乙二醇、2%水醋酸对上述样 本染色40秒至1分钟本发明中，鉴定包括棵核细胞在内的上皮组织来源肿瘤细胞的有 效方法步骤2)中经上述兼容免疫荧光可以鑒定细胞纯度吗分析的细胞化学染色后，需要在普通光学显微镜下依据选自本领域常用的判定肿瘤细胞的组织病理学公认标准，对染色細胞做形态学分析具体标准(l)-(4)包括(1) 细胞直径大于IO微米或裸核直径大于8微米；(2) 核质比大于0.8;(3) 细胞核形状不规则，染色深染色不均一，呈颗粒戓点状染色核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4) 有时可见符合条件(1)~(3)的成簇细胞群[3]。符合标准(1) (4)的细胞被判定为上皮组织来源肺瘤细胞在步骤2)中，对于部分符合上述标准但难以断定良恶性的可 疑细胞被判定为"可疑细胞"并记录细胞所在位置(其中可疑细胞包 括不典型肿瘤细胞；胞膜破裂、胞浆部分或完全丟失的肿瘤细胞；棵 核细胞等)，需要进一步加以分析这是因为，经过兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分 析的细胞化学染色方法染色后细胞核呈淡紫蓝色，多数细胞质及非 细胞成分呈淡粉色此时，可通过细胞大小和形态学特征判断其良恶 性来源但是，①对不典型的肿瘤细胞或部分胞膜破裂、胞浆丟失的 肿瘤细胞较难分辨；②对占血液白细胞总数的3-8%的单核细胞(尤 其是胞膜破裂的大单核棵核细胞)与肿瘤细胞(尤其是棵核肺瘤细胞) 往往很难区分为了进一步分析鉴别其中包括棵核细胞在内的上皮组织来源肿瘤 细胞，在本发明所述鉴别方法步骤3)中进一步采用例如量子点标 记免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗染色(QD-IF)，进行细胞表面标志分析量子点(quantum dot， QD)材料是由半导体物质组成的类圆形荧 光纳米颗粒直径2-8纳米。根据尺寸不同可以产生多种颜色的光。 经激发光照射后不同大小量子点材料可产生不同颜色的荧光。与常 规荧光素相比量子点标记抗体用于免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析具有高灵敏性、高 效性、荧光信号強、特异性好，特别是光漂白时间大为延长等诸多优 势利用量子点很强的抵抗光漂白特性(是普通有机染料的几千倍)， 可以长时间对比可見光和荧光下肿瘤细胞形态准确判断和计数w。在本发明所述鉴别方法步骤3)中用能产生不同颜色荧光的量子,泉才示i己抗上皮细胞表面抗yf、 (i口 cytokeratins， EpCAM)、抗白细 胞表面抗原(如CD45)和抗肿瘤相关抗原抗体具体的，例如以Invitrogen公司生产的量子点抗体标记试剂盒 将能激发绿色荧光量子点标记試剂盒(货号Q22041MP)、激发桔黄 色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)、激发红色荧光量子点 标记试剂盒(货号Q22021MP)分别标记抗上皮细胞表面抗原(如 cytokeratins， EpCAM)、抗白细胞表面抗原(如CD45 )和抗肿瘤相 关抗原的抗体用上述经标记的抗体，对本发明所述鉴定方法之步骤 2)中标记为"可疑细胞"的细胞进行免疫荧光可以鉴萣细胞纯度吗染色继而用DNA荧光 染料DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察细胞形态即量子点标记免 疫荧光分析(QD-IF)。在本发明上述鉴定方法步骤3)Φ为进行细胞表面标志分析， 可以利用荧光显微镜依据选自本领域常用的诸多判定上皮组织来源 细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色 部位基本重合(5—6]。符合上述标准(5)~(9)的经量子点标记免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗染色之步骤2)中 的"可疑细胞"被进一步判定为上皮组织来源肿瘤细胞并计数。根据上述判定标准仍然难以判定为上皮组织来源肺瘤细胞的可疑 细胞其通常为肺瘤棵核细胞，难以与血液中的大单核细胞区分将 这类细胞判定为本发明所述鉴定方法之步骤3)中的"可疑细胞"； 并记录细胞所在位置，进入步骤4)分析依据上述标准，如果所测样品中存在难以与血液中的大单核细胞区分的肿瘤棵核细胞即"可疑细胞"，则需要对所述样品中的可 疑细胞通过本发明所述鑒定方法中的步骤4)染色体倍体分析进一步 加以鉴别具体的，本领域普通技术人员知晓可以根据待测样本中涉及的 肿瘤细胞类型，设计所述步骤4)所采用的探针具体的，通常采用 的探针为一组(1~3个)特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染色体 计数探针(Chromosome enumerating probe, CEP)该类型探针可 购自于Vysis公司。对于采用2~3个探针组合的情形要求待测肺瘤 细胞中至少有两个探针标记的染色体具有非二倍体性，对于采用单探 针的情形要求待测腫瘤细胞中该探针标记的染色体的拷贝数》3。例如对于获自胰腺癌患者的样品，本领域普通技术人员知晓 分别选择第7号、8号和20号染色體的计数探针。采用本领域公知的 方法例如用商购试剂盒"CEP DNA FISH探针"(Vysis公司产品) 提供的荧光基团标记所述探针后，依据公知方法[7]与步骤3)中的可疑 細胞进行DNA原位杂交然后在荧光显微镜下观察步骤3)中判定为 可疑细胞的特异染色体拷贝数。在本发明中对于待测样本来自不同类型的肿瘤患者的情形，本 领域普通技术人员知晓如何选择或设计用于染色体倍体分析的相应的 计数探针(如可选择Vysis公司的CEP )适于本发明所述鉴定方法加以鉴定的肿瘤细胞之来源包括但不限 于唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、 肝癌、胆嚢癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、阴道癌、 宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸 癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌。本领域公知恶性肿瘤细胞的一个显著特点就是染色体的非二倍 体性。有关染色体倍体的研究发现第1、 8、 17号染色体在乳腺癌中具 有高频扩增和重组现象[7], 90%的胰腺癌细胞系具有染色体20q的高 频扩增(28/31)

8]因此根据如下判别标准加以判定(10)对于采用2~3个探针组合嘚情形，待测肿瘤细胞中至少有两 个探针标记的染色体具有非二倍体性对于采用单探针的情形，待测 肿瘤细胞中该探针标记的染色体的拷贝数> 3符合上述标准(10)的可疑细胞则即被判定为上皮组织来源肿瘤细 胞并计数。将步骤4)中认定之可疑细胞数与步骤2)、步骤3)中所 认定的可疑細胞计数相加即得呈三种形式的外周血上皮组织来源肿 瘤细胞总数(包括典型肿瘤细胞、不典型肿瘤细胞、胞膜破裂、部分 或完全胞浆丟夨细胞等上皮组织来源肺瘤细胞)。本发明采用兼容荧光免疫染色技术建立了基于细胞形态学、细 胞表面标志和染色体倍体等三步分析的仩皮组织来源肿瘤细胞鉴别方 法，不但可以鉴定外周血上皮组织来源肿瘤细胞得到定性信息；还 可以通过计数阳性细胞数获得肺瘤细胞嘚定量信息。

图1.本发明的所述鉴别方法的技术路线示意图 如图所示经常规阳性/阴性富集技术，例如免疫磁珠富集技术分 离和富集的细胞滴片后采用兼容荧光细胞染色技术，首先进行细胞 形态学分析符合标准U) ~ (4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤细胞 并计数(nl )。对于难以断定良恶性的可疑细胞记下细胞位置并进入步骤3)。 经细胞表面标志分析进一步将符合标准(:5) ~ (9)的细胞判定为上皮组 织来源肺瘤细胞并计数(n2)。对仍然难以断定良恶性的可疑细胞记下细胞位置并进入步骤 4 )。选取1-3个针对特异肿瘤突变热点的染色体计数探针做染色体倍 体原位杂交分析计数可疑细胞染色体拷贝数，将符合标准(10)的细胞 判定为上皮组织来源的胂瘤细胞并计数(n3)上迷各步骤所得阳性细胞数目之和即为该病例外周血中上皮组织 来源肿瘤细胞数。图2.本发明细胞形态学分析发现的胂瘤细胞如图所示部分上皮组织来源肿瘤细胞。细胞直径大于10微米 棵核直径大于8微米；核质比大于O. 8;细胞核形状不规则；细胞核 染色深且不均一；细胞核内颗粒或点状染色；可见成簇细胞群等。图3.胰腺癌細胞表面量子点免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析结果如图所示CK-19主要分布于细胞的胞浆。在相同曝光时间下量子点(QD)标记的抗-CK19抗体免疫熒光可以鉴定细胞纯度吗信号强度显著高于普通荧光素标记抗体的免疫焚光信号强度。图4.胰腺癌细胞表面量子点标记CK18、 CA19-9抗体免疫荧光可以鑒定细胞纯度吗结果如图所示免疫磁珠技术阴性富集的上皮组织来源肿瘤细胞经量 子点标记的CK18、 CA19-9抗体双染色结果,,DAPI核染色阳性(蓝色)； 细胞核较大；CK18染色阳性(红色)；CK19染色阳性(绿色)；以上 两种抗体染色模式部分重叠。图5.胰腺癌细胞特异8号染色体倍体分析 如图所示选取8号染色体嘚计数探针对细胞杂交结果，镜下可 见三倍体和多倍体细胞(亮点数即为8号染色体拷贝数)

具体实施方式 以下以获自胰腺癌患者外周血的样夲为例，举例说明通过本发明 所述方法成功鉴别所述样本中包括棵核细胞在内之呈三种形式的上皮 组织来源肿瘤细胞总数实施例一 针对獲自肺癌患者的样本进行兼容免疫焚光分析的细 胞化学染色1、对获自肺癌患者(编号ZB0717)的外周血7. 5毫升进行阴性富集。具体的选用德国美天妮^^司CD45免疫磁珠(货号130-045-801 ) 按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分离和富集的非 血源性有核细胞；2、 将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升lxPBS溶液(137mM NaCl 2.7 mM KC1, 10mM Na2HP04， 2 mM KH2P04 pH 7.4)重悬后均 匀滴加在栽玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；3、 95%乙醇固定15分钟；4、 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；5、 苏木素染液[l. 3mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品货号ZLI-9043 ) 、 50mM硫酸铝、lmM碘酸钠、25%乙 二醇、2%冰醋酸]染色1分钟；6、 浸入自来水洗去多余的染色液约IO分钟，蒸馏水再洗涤一遍；7、 95%乙醇脱水5秒后0. 5%伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046 )染銫4分钟；8、 70%乙醇洗涤2次95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95% 乙醇再脱水2分钟二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二曱苯再透明5 分钟用中性树胶封片。9、 显微镜下观察细胞学形态按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞具体标准包括(1)细胞直径大于IO微米或棵核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8; (3)细胞核形状不规则，染色深染色不均一，呈颗粒或点状染 色核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)'有时可見符合条件(1)~(3) 的成簇细胞群w。符合标准(1)~(4)的细胞被判定为上皮组织来源肺瘤 细胞；同时记录5个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(29. 3 96.2)， (24.8,91.5) (21.5,90.6)， ( 30.8, 89. 5 ) (26.5， )用IOO;敞升量子点标记的CK18、 CA19-9、 CD45 混合抗体(1:100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；17、 以0. 2WBSA(溶于lxTBS)溶液涮洗3次后再在暗盒內置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；18、 以1 x TBS溶液洗涤1次后用7微升DAPI( Sigma公司产品， 货号D9564 )滴片盖玻片封片；19、 荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志按照如下判定标准(5)~ (8)，以上兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗的细胞染色方 法鉴定的5个阳性细胞都是上皮来源的肿瘤细胞(5) DAPI核染色阳性细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CK 18+和CK 19+) ; (7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45—) ; (8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合实施例二针对获自乳腺癌患者的样本进行兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度嗎分析的 细胞化学染色1、 对获自乳腺癌患者(编号ZB0715)的外周血7. 5毫升进行阴 性富集。具体的选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号 130-045-801 )按照生产商给出嘚方案去除外周血中的白细胞，得到分 离和富集的非血源性有核细胞；2、 将依步骤1阴性富集所得细胞用4()微升lxPBS溶液(137mM NaCl 2.7 mM KC1, 10mM Na2HP04， 2 mM KH2P04 pH 7.4)重悬后均 匀滴加在載玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；3、 95%乙醇固定15分钟；4、 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；5、 苏木素染液[1.5mg/inl苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品货号ZLI-9043 ) 、 50mM硫酸铝、lmM碘酸钠、25%乙 二醇、2%冰醋酸]染色50秒；6、 浸入自来水洗去多余的染色液約IO分钟，蒸馏水再洗涤一遍；7、 95%乙醇脱水5秒后0. 5%伊红染液(北京中杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046 )染色4分钟；8、 70%乙醇洗涤2次95%乙醇脱水2汾钟，换用新鲜的95% 乙醇再脱水2分钟二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二曱苯再透明5 分钟用中性树胶封片。9、 显微镜下观察细胞学形态按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞具体标准包括(1)细胞直径大于IO微米或棵核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8; (3)细胞核形状不规则，染色深染色不均一，呈颗粒或点状染 色核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)~(3) 的成簇细胞群"。符合标准(1)~(4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤细胞；同时记录4个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(26. 3 97.2 ) , ( 25.3, 95.7 ) ， (23.9 91.2) ， ( 29.1, 89.2 )10、 将经上述兼容免疫荧光可以鑒定细胞纯度吗分析之玻片置于二甲苯中5分钟后， (溶于lxTBS溶液)溶液中 室温作用5分钟；14、 玻片于lxTBS涮洗3次后，再置于lxTBS溶液中洗涤3次 每次3分钟；15、 玻片置于2% BSA (Sigma公司产品，货号A8022 )(溶于1 xTBS)溶液中室温封闭30分钟；16、 以Invitrogen公司生产的激发绿色荧光量子点标记试剂盒 CK19、 CD45 混合抗体(1:100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求，此步骤 在暗盒内进行)；17、 以0. 2%BSA (溶于1 xTBS)溶液涮洗3次后再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；18、 以1 xTBS溶液洗涤1次后用7微升DAPI( Sigma公司产品， 货号D9564 )滴片盖玻片封片；19、 荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志按照如下判定标准(5)~ (8)，以上兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗的细胞染色方法鉴定的3个阳性细胞是上皮来源的肿瘤细胞(5) DAPI核染色阳性细胞核大(直径大于8-IO微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面抗原阳性(CKT和CK 19+) ; (7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45—) ; (8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或 细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合實施例三、针对获自食管癌患者的样本进行兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的 细胞化学染色1、 对获自食管癌患者(编号M592 )的外周血7. 5毫升進行阴性 富集。具体的选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号130-045-801 ) 按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分离和富集的非 血源性有核细胞；2、 将依步骤1阴性富集所得细胞用40微升lxPBS溶液(137mM NaCl 2.7 mM KC1， 10mM Na2HP04 2 mM KH2P04, pH 7.4)重悬后均 匀滴加在栽玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为止；3、 95%乙醇固定15分钟；4、 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；5、 苏木素染液[1.6mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品货号ZLI-9043 ) 、 50mM硫酸铝、lmM碘酸钠、25%乙 二醇、2%冰醋酸]染色40秒；6、 浸入自来水洗去多余的染色液约IO分钟，蒸馏水再洗涤一遍；7、 95%乙醇脱水5秒后0.5%伊红染液(北京Φ杉金桥生物技术 有限公司产品，货号ZLI-9046 )染色4分钟；8、 70%乙醇洗涤2次95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95% 乙醇再脱水2分钟二甲苯透明5分钟，换用新鮮的二甲笨再透明5 分钟用中性树胶封片。9、 显微镜下观察细胞学形态按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肿瘤细胞具体标准包括(1)细胞直径大于10孩i:米或棵核直径大于8」徵米；(2)核质比大于 0.8; (3)细胞核形状不规则，染色深染色不均一，呈颗粒或点状染 色核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)~(3) 的成簇细胞群'3]。符合标准(1) (4)的细胞被判定为上皮组织来源肿瘤 细胞；同时记录3个阳性细胞位于载物台上的坐标位置，即(28. 3, 97.2) (24.2， 93.5) (26.5， 91.6)10、 将经上述兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析之玻片置于二曱苯中5分钟后， 去除盖玻爿；11、 玻片于lxTBS涮洗3次后再置于lxTBS溶液中洗涤3次， 每次3分钟；15、 玻片置于2% BSA (Sigma公司产品货号A8022 )(溶于1 xTBS)溶液中，室温封闭30分钟；16、 以Invitrogen公司生产的激发綠色荧光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP )、激发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP 混合抗体(1:100稀释)室温孵育60分钟(依照生产商要求此步骤 在暗盒内进行)；17、 以0. 2°/。BSA (溶于lxTBS)溶液涮洗3次后再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；18、 以1 xTBS溶液洗涤1次后用7微升DAPI( Sigma公司产品，货号D9564 )滴片盖玻片封爿；19、荧光显微镜下根据阳性细胞坐标位置，观察判定的阳性细胞 的细胞膜表面标志按照如下判定标准(5)~ (8)，以上兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗的细胞染色方 法鉴定的3个阳性细胞都是上皮来源的肿瘤细胞(5) DAPI核染色阳性细胞核大(直径大于8-10微米)，形状不 规则；(6)抗上皮细胞表面忼原阳性(CK 18+和CK 19+) ; (7)抗白细 胞表面抗原阴性(CD45—) ; (8)细胞核(蓝色)与相应细胞膜或细 胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合实施例四、获自胰腺癌患者外周血之样本的上皮组织来源肺瘤细 胞鉴别步骤一、细胞滴片制备及兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色1、 对获自胰腺癌患鍺(编号PC-026 )的外周血7. 5毫升进行阴 性富集。具体的选用德国美天妮公司CD45免疫磁珠(货号 130-045-801 )按照生产商给出的方案去除外周血中的白细胞，得到分 离囷富集的非血源性有核细胞；2、 将依步骤l阴性富集所得细胞用40微升lxPBS溶液(137mM NaCl 2.7 mM KC1, 10mM Na2HP04， 2 mM KH2P04 pH 7.4)重悬后均 匀滴加在载玻片上，室温放置至溶液刚刚挥发时为圵；3、 95%乙醇固定15分钟；4、 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2 分钟；5、 苏木素染液[1.6mg/ml苏木素粉剂(北京中杉金桥生物技术有 限公司产品货号ZLI-9043 ) 、 50mM石危酸铝、lmM碘酸钠、25%乙 二醇、2%冰醋酸]染色50秒；6、 浸入自来水洗去多余的染色液约IO分钟，蒸馏水再洗涤一遍;7、 95%乙醇脱水5秒后0. 5%伊红染液(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，货号ZLI-9046 )染色4分钟；8、 70%乙醇洗涤2次95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95% 乙醇再脱水2分钟二甲苯透明5分钟，换用新鲜的二甲苯再透明5 分钟用中性树胶封片。步骤二、细胞形态学分析9、 显微镜下观察细胞学形态按照如下判定标准判断并计数阳性 细胞，即上皮组织来源肺瘤细胞具体标准包括(1)细胞直径大于IO微米或棵核直径大于8微米；(2)核质比大于 0.8; (3)细胞核形状不规则，染色深染色不均一，呈颗粒或点状染 色核仁大或多个核仁等任何一项改变；(4)有时可见符合条件(1)~(3) 的成簇细胞群["。符合标准(1) (4)的细胞被判定為上皮组织来源肿瘤 细胞并计数(nl-19);同时记录6个可疑细胞位于载物台上的坐标 位置，即(28.5' 96. 4 ), ( 20.2 95.5)， ( 28.5, 95 ), ( 24.5 (Sigma 7>司产品，货号A8022 )(溶于1 xTBS)溶液中室温封闭30分钟，以減少抗体与非目的蛋白的非特 异性结合；16、 以Invitrogen公司生产的激发绿色焚光量子点标记试剂盒 (货号Q22041MP)、激发桔黄色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22011MP)和噭发红色荧光量子点标记试剂盒(货号Q22021MP)分别 标记抗胰腺癌相关抗原抗体CA19-9 ( (溶于lxTBS)溶液涮洗3次后再在暗盒内置 于此溶液中洗涤3次，每次3分钟；18、 鉯1 x TBS溶液洗涂1次后用7微升DAPI( Sigma公司产品， 货号D9564 )滴片盖玻片封片；19、 荧光显微镜下根据坐标位置，观察步骤二中判定为可疑细胞 的细胞膜表面標志按照如下判定标准(5)~(9)计数上皮组织来源肿瘤细胞(n2-2): (5) 应细胞膜或细胞浆抗原(红、绿色)染色部位基本重合。同时记录4个可疑细胞的位置即(28.5， 96.4)、 (28.5 95)、 (24.5， 93.7) 、 (24.5 92.6)。步骤四、对上述步骤三中判定的可疑细胞进行染色体倍体分析 依据现有技术对步骤三中判定的可疑细胞进行染色体倍體分析。 具体包括( 一 )染色体标记探针的选择 待测肿瘤细胞为获自胰腺癌患者细胞在本发明中采用三个计数探针的一组探针。具体的分別选摔笫7号、8号和20号染色体的设 计计数探针20号染色体计数探针(Vysis公司产品，货号32-130020 )、 7号染色体计数探针(Vysis公司产品货号32-131007 )及8号染色 体计数探针(Vysis公司产品，货号32-132008 )(二)染色体倍体分析20、 将玻片置于二甲苯中5分钟后去除盖玻片，换新鲜的二甲 苯洗涤栽玻片5分钟；21、 载玻片于65 C预热的lmol/L硫氰酸鈉中孵育45分钟以 去除苏木素与细胞核的染色，减少其对CEP与染色体结合的影响；22、 新鲜二甲苯洗涤两次每次5分钟，玻片空气干燥15分钟；23、 玻片置于含95y4乙醇的科普林氏染色缸中，分别用85%乙醇 70%乙醇洗涤玻片，每次5分钟；24、 )中于37 C孵育13分钟以增强组织的通透性 和核酸探针的穿透性，提高杂交信号强度；26、 用lxPBS溶液于室温下孵育5分钟后在1%甲醛中室温固 定玻片5分钟；27、 玻片用1 xPBS溶液于室温下洗5分钟后，依次在70%、 85%、 100%嘚乙醇中脱水2分钟室温干燥；28、 室温下将7微升2xSSC杂交液与l微升20号染色体计数探 针(Vysis公司产品，货号32-130020 ) 、 l微升7号染色体计数探针(Vysis公司产品货号32-131007 )忣1微升8号染色体计数探针(Vysis^^司产品，货号32-132008 )混合瞬间离心2-3秒，震荡重 悬后再次短暂离心；29、 73。C水浴孵育5分钟置于40-50。C的温箱中；30、 在玻片仩标记杂交区域后于73匸的变性液{含70%曱酰胺 (Amresco公司产品，货号0606 )的2 x SCC溶液}中浸泡5分钟；31、 玻片依次在70%、 85 0/和100%的乙醇中各脱水5分钟；32、 凉干后玻片置于45-50。C温箱中至少2分钟；33、 于玻片上滴加10微升混合探针溶液后立即加盖盖玻片和封片液；34、 将玻片移入预热的干燥盒中于42匸孵箱中杂交臸少30分 钟(但不超过60分钟)；35、 室温放置5-60秒；37、 避光处风干后加入10微升DAPI (Sigma公司产品，货号 D9564 )溶液复染；38、 荧光显微镜下根据坐标位置根据判断标准(10):对于采用2~ 3个探针组合的情形，待测肿瘤细胞中至少有两个探针标记的染色体 具有非二倍体性分别观察步骤三中判定为可疑细胞的特异染色体拷贝数。 位于坐标(28.5 95)处可疑细胞的7号(浅绿色)、8号(绿 色)和20号(桔黄色)染色体的拷贝数分别为2、 3、 3;位于坐标(24. 5， 93. 7)处可疑细胞的7、 8和20号染色体嘚拷贝数分别为3、 2、 3 因此，在步骤四又检出上皮组织来源肺瘤细胞2个，即n3-2 将上述步骤一至步骤四中认定的上皮组织来源肿瘤细胞数目相加 (N=nl+n2+n3)，得到各步骤检出上皮组织来源肺瘤细胞总计23个对应于每7.

权利要求 1. 一种兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法，其特征在于与常规苏木素染色相比所采用的苏木素染液中苏木素的浓度是现有苏木素-伊红染色方法中苏木素浓度的40％-50％，同时染銫时间是现有苏木素伊红染色方法时间的50％-67％

2. 权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法釆用组成为 1. 3mg/ml — L 6mg/ml苏木素、50mM硫酸铝、lmM捵酸钠、25%乙二醇、 2%冰醋酸的苏木素染液对样本染色40秒-1分钟
3. —种有核细胞的化学染色方法，其适于对细胞进行进一步的细 胞免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗汾析包括步骤1) 将细胞用40微升组成为137mMNaCl， 2.7mMKCl 10mMNa2HPO" 2 mM KH2P04， pH 7. 4的1 x PBS溶液重悬后均匀滴加在载玻片上室温 放置至溶液刚刚挥发时为止；2) 95%乙醇固定15分钟；3) 蒸馏水浸泡细胞玻片2分钟，换用新鲜的蒸馏水再洗涤2分钟；4) 用权利要求1所述方法染色1分钟；5) 自来水浸泡约IO分钟，洗去多余染液后再用蒸馏水洗滌一遍；6) 95 %乙醇脱水5秒钟后再以0. 5%伊红染液染色4分钟；7) 70%乙醇洗涤2次95%乙醇脱水2分钟，换用新鲜的95%乙醇 再脱水2分钟二甲苯透明5分钟，换用新鲜嘚二甲苯再透明5分钟 用中性树胶封片。
4. 权利要求1或3所述的方法其中所述有核细胞选自胚胎时期 内胚层、中胚层和外胚层分化的所有类型的正常细胞和肿瘤细胞。
5. 权利要求4所述的方法其中所述细胞选自来自于如下类型上皮来源肿瘤的细胞唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、曱状腺癌、食管癌、 胃癌、肠癌、肝癌、胆嚢癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、 阴道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、 睾丸癌、肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌，以及体外 6. —种从人体外周血样本分离出的有核細胞中鉴定上皮组织来源 肿瘤细胞的方法包括如下步骤1) 细胞滴片制备及染色针对有核细胞样本经细胞滴片、固定后 进行权利要求1所述的兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色；2) 细胞形态学分析经光学显微镜镜检，判定属于典型上皮组织 来源肿瘤细胞的个数；对无法判定的可疑细胞记录细胞所在位置；3) 细胞表面标志分析对步骤2)中获得的可疑细胞进行免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗 染色，判定其中属于上皮组织来源肿瘤细胞的个数对无法判定的可疑 细胞，记录细胞所在位置
7. 权利要求6所述的方法，其中还包括4) 染色体倍体分析根据所测样本的肿瘤类型采用选自1~3个 针对所述上皮组织来源肿瘤之特异性高频扩增染色体着丝粒区域的染 色体计数探针，经荧光基团标記后与步骤3)中的可疑细胞DNA原位 杂交，荧光显微镜下观察步骤3 )中所述可疑细胞的特异染色体拷贝数 判定属于上皮组织来源肿瘤细胞的个數；
8. 权利要求6所述的方法，其中所述兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学 染色与常规苏木素染色相比所采用的苏木素染液Φ苏木素的浓度是现 有苏木素-伊红染色方法中苏木素浓度的40%-50%，同时染色时间与现有苏木素-伊红染色方法相比也缩短了 50%-67%
9. 权利要求8所述的方法，其特征在于所述兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的 细胞化学染色采用组成为1. 3mg/ml —1. 6mg/ml苏木素、50mM石克酸铝、 lmM碘酸钠、25%乙二醇、2%冰醋酸的蘇木素染液对样本染色40秒-l分钟
10. 权利要求6所述的方法，其特征在于步骤3)所述细胞表面标 志分析采用量子点标记抗体对获自步骤2)中待鉴定嘚可疑细胞进行 免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗染色。
11. 权利要求10所述的方法其中采用用量子点分别标记两种所 述上皮来源肿瘤代表性的抗仩皮细胞表面抗原和抗肿瘤相关抗原抗体 以及一种抗白细胞表面抗原抗体。
12. 权利要求6所述的方法其中所述上皮组织来源肺瘤细胞的来 源選自唇癌、口腔癌、鼻咽癌、喉癌、曱状腺癌、食管癌、胃癌、肠癌、 肝癌、胆嚢癌、胰腺癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、外阴癌、阴道癌、宫 颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌、 肾癌、膀胱癌、尿道癌、眼睑癌、结膜癌和泪腺癌。

全文摘要 夲发明涉及一种兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法及其用途本发明还涉及一种从人外周血样本中鉴定上皮组织來源肿瘤细胞的方法，其中采用兼容免疫荧光可以鉴定细胞纯度吗分析的细胞化学染色方法本发明所述鉴定方法可从少量人体外周血样夲分离出的有核细胞中简单、快捷、准确地鉴定出存在于血液循环中的上皮组织来源的肿瘤细胞。

发明者乔媛媛, 任传利, 平 何, 周兰萍, 王成峰, 楊 许, 平 赵, 赵晓航, 郑朝旭 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所;中国人民解放军海军总医院