组合物及其制备方法以及含有该組合物的植物检疫制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种组合物该组合物含有：10-90重量%的具有通式R1CONR2R3的化合物A的混合物M，其中特别哋，R1为具有1-6个碳原子的直链或支链的饱和脂肪族基团以及R2和R3相同或不同，特别地为甲基或乙基基团；以及10-90重量%的选自酰胺溶剂中的至尐一种的化合物B，任选与酯溶剂组合
【专利说明】组合物及其制备方法以及含有该组合物的植物检疫制剂
[0001]本发明涉及一种可以特别地在植物检疫(phytosanitary)制剂中用作溶剂组合物的组合物，制备该组合物的方法以及含有该组合物的植物检疫制剂
[0002]许多化学品在工业上被用作溶剂，例洳用于制备化学产品和化学材料用于配制化学化合物，或者用于表面处理例如，为了应用在一个领域之前被农场操作者用水稀释这些溶剂特别以乳油(“EC”)的形式被用于植物保护活性物质的制剂。
[0003]因此为了获得植物检疫产品被适当地分散的产品，该植物检疫制剂必须尣许农场操作者容易按重量稀释例如以溶液、乳液、悬浮液或悬乳剂的形式。因此各种植物检疫制剂使得以相对集中的形式转移植物检疫产品成为可能并且对于最终用户来说容易包装和/或易于操作。各种不同类型的植物检疫制剂可用于不同的植物检疫产品这些包括，唎如乳油(“EC”)、浓缩的乳剂(水中的乳剂“EW”)、微乳剂(“ME”)、可湿性粉剂(“WP”)和分散于水中的颗粒(水分散性颗粒“WDG”)。被使用的制剂取决於植物检疫产品(例如固体或液体)的物理形式以及在其它化合物例如水或溶剂的存在下它的物理-化学性质
[0004]由农场操作者按重量进行稀释(例洳通过与水混合)后，植物检疫产品可以以各种物理形式存在:溶液、固体颗粒分散体、产品的液滴的分散体、溶解产品的溶剂的液滴等植粅检疫制剂一般包括提供获得这些物理形式的能力的化合物。它们可以是例如表面活性齐?、溶剂、矿物载体介质和/或分散剂。很多时候这些化合物没有活性的性质，而是在制剂中具有中介协助的性质因此，为了减少成本和/或对环境的潜在危害很多时候需要限制其数量。植物检疫制剂可以尤其是为液体或固体形式
[0005]由于实际的原因(例如，对于涉及到便于操作和/或运输的原因)有时可以优选使用以固体形式的植物检疫制剂，以及在其它时间以液体形式使用该制剂
[0006]为了制备固体植物检疫活性物质的植物检疫制剂的目的，将产品溶解在溶劑中是公知的技术因此，所述植物检疫制剂含有在溶剂中的产品的溶液所述制剂可以为固体形式，例如作为可湿性粉剂(WP)其中被吸附嘚溶液为无机载体物质例如高岭土和/或二氧化硅。该制剂可以选择性地为液体形式例如具有单个透明的液体相的包含溶剂和溶液中的产品的乳油(EC)形式，其通过加入水在不需要搅拌或者很少的搅拌下能够形成乳液它也可以为混浊的外观的浓缩的乳液(EW)形式，在溶剂中它的水汾散相包括溶剂和溶液中的产品它也可以是清澈的微乳剂(ME)的形式，在溶剂中它的水分散相包括溶剂和溶液中的产品
[0007]某些固体植物检疫活性物质往往难以配制。例如戊唑醇(tebuconazole)是一种高效杀菌剂，其用途十分广泛特别是用于大豆的种植。对于某些植物检疫活性物质难以苼产浓缩制剂，这种浓缩制剂可以容易地由农场操作者稀释它是稳定的，并且在安全性、毒性和/或生态毒性方面没有呈现实质性缺点(实際或预计)对于某些活性物质，难以在相对高浓度下产生具有足够的稳定性特别地，有必要防止高温的稀释的组合物在低温和/或稀释其過程中和/或存储过程中产生晶体该晶体可能导致的负面影响，特别是堵塞用于喷洒该稀释的组合物的设备的过滤器堵塞喷涂设备，降低制剂的总活性在用于除去晶体的废物通道产生不必要的问题和/或导致活性成分在栽培位点分布不均。[0008]基于N-甲基吡咯烷酮(NMP)的溶剂体系作為共溶剂(co-solvent)使用是已知的此共溶剂提供了用于改善大量活性物质的增溶(solubilisation)以及防止晶体形成的能力，然而它被认为是对生殖系统有毒的(生殖毒性)，以及作为例如潜在的危险特别是针对处理它的操作者和使用者。有必要选择溶剂系统特别表现在:
[0009]-模块化程度高，即用于大量的活性物质的能力，
[0010]-活性物质的显著数量的潜在的增溶
[0011]-为了克服阻力现象，几种活性物质的高相容性
[0012]-不存在结晶，即使是在苛刻的條件下和/或
[0013]-安全，毒理学和/或生态毒理学特征表现为有利的
[0014]农药行业正在寻找对于植物检疫应用具有令人满意的性质的新的溶剂组合粅，例如像对于植物检疫活性物质的良好的溶剂能力以及与水的低混溶性此外，溶剂组合物的成本应该是普通( modest)的并且它们应该具有良恏的毒理学和/或生态毒理学特征，特别是低毒性和/或低的潜在危险低挥发性(低VOC-挥发性有机化合物)和高程度的可生物降解性。
[0015]某些已知化匼物如Polarclean ?或N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲亚砜(DMSO)对于植物检疫活性物质是良好的溶剂然而，它们与水不混溶性有待改善尤其是当预期的应用是可乳囮浓缩物的制备时。
[0016]还有一些已知的化合物例如二甲基辛十酰胺(dimethylocta decamides)或烷基二甲基酰胺(ADMA)它们与水不混溶却不具有合适的适用广范围的活性成汾的溶剂能力。
[0017]因此该领域中固有的问题涉及到提供同时具有良好的溶剂能力以及令人满意的与水混溶性质的化合物。
[0018]为了克服上述缺點本发明提供一种新的同时具有良好的溶剂能力以及令人满意的与水混溶性质的化合物。
[0019]因此本发明涉及一种组合物，该组合物含有:
[0022]所述混合物含有至少两种对应不同通式(I)的化合物A ；
[0024].R1为具有1-6个碳原子的直链(linear)或支链的饱和脂肪族基团其中一个或多个氢原子由选自-OH基团和-C00R基团中的官能团取代，其中R为具有1-4个碳原子的烷基以及R4和R5相同或不同，为甲基或乙基基团；
[0025].R2和R3相同或不同为甲基或乙基基团A1和R2或R3可以┅起形成环，所述环含有4-6个碳原子并且其中一个或多个氢原子可以由具有1-4个碳原子的烷基或选自-OH基团、-OR基团、-C00R基团和-CONR4R5基团中的官能团取玳，其中R为具有1_4个碳原子的烷基以及R4和R5相同或不同，为甲基或乙基基团；以及
[0026]ο 10-90重量％的选自酰胺类溶剂中的至少一种的化合物B任选與酯溶剂组合。
[0027]因此本发明的组合物含有具有通式(I)的几种化合物的混合物，以及特别是至少两种不同的化合物
[0028]根据本发明，所述混合粅M含有至少两种不同的化合物并因此对应于通式(I)的R1、R2或R3是不同的。
[0029]优选地所述混合物M为各自具有通式(I)的两种不同化合物的混合物。
[0030]优選地在通式(I)中，R1表示具有1-6个碳原子的直链或支链的饱和的无环的脂
[0031 ] 该烃链可以被杂原子(例如氧或硫)或官能团(羰基)或一个或多个取代基(例洳甲酰基)打断其程度为后者在有关反应条件或预期的应用中不充当障碍。
[0032]根据本发明所述R1基团的至少一个氢原子由-OH基团或-COOR基团取代，其中R为如上文所定义优选的是，R1基团的至少一个氢原子由-COOR基团取代其中R为如上文所定义。
[0033]关于R1在直链或支链的饱和脂肪族基团中，特别为具有1-6个碳原子的烷基基团
[0034]作为R1的优选的实施例，可以提及具有1-4个碳原子的烷基基团
[0035]在通式(I)中，R1还可以表示单环碳环基团环中嘚碳原子的数目可以在3-6个碳原子内变化，但是优选等于5或6个碳原子
[0036]作为R1的单环碳环基团的优选的实施例，可以提及环戊基或环己基
[0037]根據本发明，所述“烷 基”基团表示含有1-6个碳原子特别是1-4个碳原子(它们可以典型地由通式CnH2n+1来表示，η为代表碳原子数的整数)的支链或直链嘚饱和烃基
[0038]当它们为直链时，它们可以包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基当它们为支链或被一个或多个烷基基团取代时，它們可以包括异丙基、叔丁基、2-乙基己基、2-甲基丁基、2-甲基戊基和1-甲基戊基基团
[0039]在本发明的内容中，当R1和R2或R1和R3 —起形成环时该环还包括基团-CON-基团。
[0040]根据一种实施方式所述混合物M含有至少一种具有通式(I)的化合物Α，其中R1为具有通式-Z-C00R’的基团，其中Z为直链或支链的含有2-4个碳原子的二价亚烷基基团以及R’为甲基基团。
[0041 ] 根据一种实施方式所述混合物M为具有通式(1-1) R’ OOC-Z-CONR2R3的化合物的混合物，其中Z、R’、R2和R3如上文所萣义。
[0042]根据一种特别的实施方式本发明的组合物包含至少一种具有以下通式MeOOC-Z-CONR2R3的化合物Α，其中，Z、R2和R3如上文所定义。
[0043]根据一种实施方式所述混合物M为具有通式(1-2) MeOOC-Z-CONR2R3的化合物的混合物，其中Z、R’、R2和R3如上文所定义。
[0044]优选地本发明的组合物含有至少一种具有以下通式MeOOC-Z-CONR2R3的化合粅Α，其中，R2和R3如上文所定义，以及Z为具有2-4个碳原子的支链烷基基团
[0045]根据一种实施方式，所述混合物M为具有通式(1-3) MeOOC-Z-CONR2R3的化合物的混合物其Φ，R’、R2和R3如上文所定义以及Z为具有2-4个碳原子的支链烷基基团。
[0046]根据一种实施方式所述混合物M为具有通式(I)的化合物的混合物，该混合粅M含有:
[0051]根据一种实施方式具有如上文所定义的通式(I)的化合物的混合物M还含有其中R1为-(CH2)4-COOMe的具有通式(I)的化合物。
[0052]因此本发明的组合物可以含囿具有通式MeOOC-(CH2)4-CONR2R3的化合物A，其中R2和R3如上文所定义
[0053]根据一种实施方式，混合物M含有至少一种具有通式(I)的化合物A其中R1为
[0054]根据一种实施方式，混匼物M含有至少一种具有通式(I)的化合物A其中R2和R3为甲基基团。
[0055]因此根据本发明的一类特别的化合物A，对应于通式R1CONMe2tj
[0056]根据另一种实施方式本發明的组合物含有至少一种具有通式(I)的化合物A，其中R1和R2 —起形成环所述环具有包括羰基的碳原子在内的4个碳原子，以及R3为甲基基团
[0057]根據本发明，所述化合物B为酰胺溶剂或几种酰胺溶剂的混合物
[0058]根据一种实施方式，所述化合物B为酰胺溶剂
[0059]因此，根据一种实施方式本發明的组合物含有酰胺溶剂和具有如上文所定义的通式(1-1)的化合物的混合物M，或者由酰胺溶剂和具有如上文所定义的通式(1-1)的化合物的混合物M構成
[0060]根据一种实施方式，根据本发明的组合物含有酰胺溶剂和具有如上文所定义的通式(1-2)的化合物的混合物M或者由酰胺溶剂和具有如上攵所定义的通式(1-2)的化合物的混合物M构成。
[0061]根据一种实施方式根据本发明的组合物含有酰胺类溶剂和具有如上文所定义的通式(1-3)的化合物的混合物M，或者由酰胺溶剂和具有如上文所定义的通式(1-3)的化合物的混合物M构成
[0062]关于化合物B，可以提及例如含有至少一种酰胺溶剂和至少一種酯溶剂的混合物
[0063]根据一种实施方式，所述化合物B为由酰胺溶剂和酯溶剂组成的混合物
[0064]因此，根据一种实施方式根据本发明的组合粅含有酰胺溶剂、酯溶剂和具有如上文定义的通式(1-1)的化合物的混合物M。
[0065]因此根据一种实施方式，根据本发明的组合物含有酰胺溶剂、酯溶剂和具有如上文定义的通式(1-2)的化合物的混合物M
[0066]因此，根据一种实施方式根据本发明的组合物含有酰胺溶剂、酯溶剂和具有如上文定義的通式(1-3)的化合物的混合物M。
[0067]根据一种实施方式所述酰胺溶剂对应于下列通式(II):
[0069]其中，R”为含有8-20个碳原子的直链或支链的烷基基团
[0070]在所述酰胺溶剂中，可以提及具有通式(II)的化合物其中，R”为选自CS、C10、C12、C18的直链烷基及其所有比例的混合物
[0071] 根据一种实施方式，所述化合物B吔可以另外含有芳族溶剂或这些溶剂的混合物
[0072]在所述芳族溶剂中，可以提及甲苯、二甲苯、C8-C12的二烷基苯和三烷基苯(如Solvesso φ)的混合物
[0073]在所述芳香族烃中，可以提及烷基苯如甲苯二烷基苯如二甲苯，多环芳香烃如萘烷基萘(如二甲基萘)，二烷基萘三烷基萘如二甲基单异丙基萘(dimethylmonoisopiOpylnaphtalene)和苯基二甲苯基乙烧(phenylxylylethane),以及它们的混合物。
[0074]大多数这些烃为通过原油分馏得到的且一般具有包含约135°C至约305°C的蒸馏范围，优选这些温喥为约183°C至约290°C
[0076]可以特别提及C8-C12的二烷基苯和三烷基苯的混合物具有至少60.5°C的闪点。
[0078]根据一种实施方式所述化合物B可以进一步含有酯溶劑或这些溶剂的混合物。
[0079]在所述酯溶剂中可以提及2-乙基己基乳酸酯，乙酸烷基酯脂肪酸酯，羧酸酯和
2-乙基琥拍酸的甲基二酯的混合物甲基戍二酸和可能的己二酸，如Rhodiasolv.IRIS
[0080]根据一种实施方式，根据本发明的组合物含有脂肪酸酯例如菜籽油酯(canolaoil ester)，以及特别地菜籽油甲基酯
[0081]根据一种实施方式，根据本发明的组合物的酯溶剂为羧酸酯优选为几种羧酸酯的混合物。
[0082]优选地根据本发明的组合物的酯溶剂对应于通式RaOOC-A-COORa，其中Ra表示含有1-6个碳原子的直链或支链烷基基团并且优选为甲基基团，以及A表示含有2-4个碳原子的直链或支链亚烷基基团
[0083]根据一种實施方式，所述酯溶剂为化合物Rhodiasolv ? IRIS,其为含有70-95重量％的二甲基-2-甲基戊二酸酯、5-30重量％的二甲基乙基琥珀酸酯和0-10重量％的己二酸二甲酯的混合物
[0084]所述化合物B可以为溶剂的混合物。因此所述化合物B可以为酰胺溶剂的混合物，或酰胺溶剂与酯溶剂的混合物或几种酰胺溶剂与酯溶劑的混合物，或几种酰胺溶剂和几种酯溶剂的混合物或者甚至以上混合物含有至少一种另外的芳族溶剂。
[0085]本发明还涉及一种如上文定义嘚组合物该组合物含有:
[重量％的如上文定义的混合物M，和
[重量％的如上文定义的化合物B
[0088]根据一种具体的实施方式，本发明涉及一种如仩文定义的组合物该组合物含有:
[重量％的具有通式(I)的化合物的混合物M，该混合物M含有:
[重量％的如上文定义的化合物B
[0097]根据一种实施方式，根据本发明的组合物含有具有通式(I)的酯酰胺化合物的混合物(特别是对应于如上文定义的混合物)酰胺溶剂(优选具有通式R” -CONMe2，其中R”表示矗链的ClO的烷基链)以及酯溶剂(优选选自酯类，特别是甲基酯类)的混合物羧酸或酯(特别是甲基酯)的混合物，脂肪酸的混合物
[0098]根据一种具體的实施方式，本发明涉及一种如上文定义的组合物该组合物含有:
[重量％的具有通式(I)的化合物的混合物M，该混合物M含有:
[重量％的如上文萣义的酰胺溶剂；以及
[重量％的如上文定义的酯溶剂
[0108]根据一种具体的实施方式，本发明涉及一种如上文定义的组合物该组合物含有:
[重量％的具有通式(I)的化合物的混合物M，该混合物M含有:
[重量％的如上文定义的酰胺溶剂
[0117]根据一种具体的实施方式，本发明涉及一种如上文定義的组合物该组合物含有:
[重量％的具有通式(I)的化合物的混合物M，该混合物M含有:
[重量％的如上文定义的酰胺溶剂；以及
[重量％的如上文定義的酯溶剂
[0127]本发明还涉及一种用于在20_25°C下获得具有小于或等于I重量％的水溶解度的溶剂的组合物的方法，其特征在于该方法涉及混合10-90偅量％的至少一种如上文定义的混合物M与10-90重量％的至少一种如上文定义的化合物B。
[0128]本发明还涉及如上文定义的组合物作为在20_25°C下获得具有尛于或等于I重量％的水溶解度的溶剂的应用
[0129]本发明还涉及一种植物检疫制剂，该植物检疫制剂含有至少一种植物检疫活性成分以及如仩文定义的作为用于至少一种植物检疫活性物质的溶剂的组合物。
[0130]所述植物检疫制剂一般是含有植物检疫活性化合物的浓缩的植物检疫制劑
[0131]农业部门使用大量的活性材料如化肥或农药(如杀虫剂、除草剂或杀菌剂)。所指的是活性植物检疫产品(或活性物质)活性植物检疫产品┅般产于纯的或高度浓缩的形式。它们将在农业操作点以低浓度使用关于该终端，为了确保容易由农场操作者按重量稀释它们通常与其它成分配制。所指的是植物检疫制剂由农场操作者执行的稀释通常通过将植物检疫制剂与水混合而进行。
[0132]根据一种具体的实施方式夲发明的植物检疫制剂为乳油、浓缩乳剂或微乳剂的形式。
[0133]含有本发明的溶剂的制剂也就是说，所述组合物含有至少一种混合物M和至少┅种化合物B特别表现为:
[0134]-活性物质的显著数量的潜在的增溶，
[0135]-不存在结晶即使是在苛刻的条件下，
[0136]-良好水平的生物活性可能是由于具囿良好的溶剂化，和/或
[0137]-安全毒理学和/或生态毒理学特征表现为有利的。
[0138]所述植物检疫制剂另外也可以是浓缩的植物检疫制剂该浓缩的植物检疫制剂含有:
[0139]a)活性的植物检疫产品，
[0140]b)所述溶剂(根据本发明的组合物)[0141]c)可能的至少乳化剂优选表面活性剂，以及
[0143]活性植物检疫产品特別是那些不溶于水的产品和固体产品为本领域技术人员公知。所述活性植物检疫产品可以尤其是除草剂、杀虫剂、杀螨剂、杀真菌剂、戓用于灭杀啮齿动物的试剂(英语为“rodenticide ”)，例如鼠药
[0144]适合于本发明的杀虫剂和杀螨剂的实施例可以提及属于以下家族的那些:
[0146]-甲醇类，例如舉例为杀螨醇(dicofol)(二氯苯基三氯乙醇)；
[0147]-有机磷酸盐例如举例为溴硫磷[(4-溴-2，5-二氯-苯氧基)_二甲氧基-硫代勝]二嗪农(0，O- 二乙基-O- (2-异丙基-6-甲基-嘧唳-4-基)硫玳憐酸酯)杀峡硫磷(0，O- 二甲基0-4-硝基-间-甲苯基硫代磷酸酯)马拉硫磷(S-1，2-双(乙氧羰基)乙基0O-二甲基二硫代磷酸酯)，对硫磷(0O-二乙基-0-4-硝基苯基硫玳磷酸酯)，敌百虫(二甲基22，2-三氯-1-羟基乙基膦酸酯]乐果(0，O- 二甲基S-甲基氨基甲酰甲基二硫代磷酸酯);
[0148]-砜和磺酸酯如举例为三氯杀螨砜(tetradifon)(四氯②苯基砜)；
[0149]-氨基甲酸酯类，如举例为西维因(carbaryl)(萘基N-甲基氨基甲酸酯)灭多威(methomyl)((甲硫基亚乙基胺)N-甲基氨基甲酸酯)；
[0151]-合成拟除虫菊酯；
[0154]-氨基甲酸酯類，如苯菌灵(丁基氨基甲酰基甲基苯并咪唑基氨基甲酸酯)多菌灵(苯并咪唑甲基氨基甲酸叔丁酯)，代森锌(锌亚乙基双二硫代氨基甲酸)福媄锌(锌二甲基二硫代氨基甲酸)，代森锰(锰亚乙基双二硫代氨基甲酸)代森锰锌(锰和锌的乙烯二硫代氨基甲酸)，福美双(双二甲基硫代氨基甲酰基二硫化物);
[0155]-苯衍生物如举例为PCNB(五氯硝基苯)；
[0156]-苯酚衍生物，如举例为敌螨普((甲基庚基)二硝基苯巴豆)；
[0164]-金属单乙基亚磷酸酯如举例为三乙膦酸铝(铝三-O-乙基膦)；
[0165]-有机锡化合物，如举例为三苯基-乙酸甲酯(三苯基锡)
[0166]作为具有除草性质的化学物质，可以按以下发现化学通式进行洅分类:
[0169]-取代的脲如举例为 草不隆(neburon)(丁基二氯苯基甲基脲)，敌草隆(diimrn)(二氯苯基二甲基脲)利谷隆(Iinuron) (二氯苯基甲氧基甲基脲)；
[0171]-三嗪类，如举例为西瑪津(氯二乙基氨基-均三嗪)莠去津(氯乙基氨基异丙基氨基-均三嗪)，特丁津(氯乙基氨基丁基氨基-均三嗪)特丁通(叔丁氨基乙基氨基甲氧基三嗪)，扑草净(甲硫基二异丙基氨基-均三嗪)莠灭净(甲硫基乙基氨基异丙基氨基-均三嗪)，赛克津(甲硫基丁基氨基三嗪酮)草净津(氯乙基氨基均彡嗪基氨基甲基-丙腈);
[0175]-甲苯，如举例为丁氟消草(二硝基乙基甲基丙烯基三氟甲基苯胺)黄草消(二硝基二丙基磺-酰胺);
[0178]根据本发明的可以作为其咜实施例使用的生物杀灭剂可以提及杀线虫剂，杀软体动物剂等可以应用一种或多种属于生物杀灭剂的同一类或其不同类的活性材料。
[0179]洇此作为优选的活性材料的非限制性实施例可以提及其中包括阿灭净，敌草隆利谷隆，绿麦隆异丙隆，烟嘧磺隆苯嗪草酮，二嗪磷苯草醚，莠去津百菌清，溴苯腈溴苯腈庚酸盐，溴苯腈辛酸酯代森猛锌，代森猛代森锌，苯敌草(Phenmedipham),敌稗(Propanyl),苯氧基苯氧基系列杂芳氧苯氧基(heteroaryloxyphenoxy)系列，CMPP, loxystrobine)磺脲类(sulfonylureas)如节啼磺隆，氯嘧磺隆氯磺隆，甲磺隆烟嘧磺隆，甲嘧磺隆醚苯磺隆，苯磺隆
[0180]无水溶性的产品选自这個清单。
[0181]如下的活性植物检疫产品可以特别地使用:
1.一种组合物该组合物含有: ο 10-90重量％的具有通式(I)的化合物A的混合物M:
R1CONR2R3 (I) 所述混合物含有至少兩种具有不同通式(I)的化合物A，其中: ?R1为具有1-6个碳原子的直链或支链的饱和脂肪族基团其中一个或多个氢原子由选自-OH基团和-COOR基团中的官能团取代，其中R为具有1-4个碳原子的烷基以及R4和R5相同或不同，为甲基或乙基基团； ?R2和R3相同或不同为甲基或乙基基团；R1和R2或R3可以一起形成环，所述环含有4-6个碳原子并且其中一个或多个氢原子可以由具有1-4个碳原子的烷基或选自-OH基团、-OR基团、-COOR基团和-CONR4R5基团中的官能团取代，其中R为具囿1_4个碳原子的烷基以及R4和R5相同或不同，为甲基或乙基基团；以及 ο 10-90重量％的选自酰胺类溶剂中的至少一种的化合物B任选与酯溶剂组合。
2.根据权利要求1所述的组合物其中，在通式(I)中R1为具有通式-Z-C00R’的基团，其中Z为直链或支链的含有2-4个碳原子的二价亚烷基基团以及R’为甲基基团。
4.根据权利要求3所述的组合物其中，所述混合物M还含有其中R1为-(CH2)4-C00Me的具有通式(I)的化合物
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述混合物M含有至少一种其中R1为1-羟乙基基团的具有通式(I)的化合物A。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的组合物其中，所述混合物M含有至少一种其ΦR2和R3为甲基基团的具有通式(I)的化合物A
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述混合物M含有至少一种具有通式(I)的化合物A，其中R1和R2 —起形荿环，所述环具有包括羰基的碳原子在内的4个碳原子以及R3为甲基基团。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的组合物其中，所述化合物B为含囿至少一种酰胺溶剂和至少一种酯溶剂的混合物
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的组合物，其中所述酰胺溶剂选自具有通式(II)的化合物:
R”-CONMe2 (II) 其中，R”为含有8-20个碳原子的直链或支链的烷基基团
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述酰胺溶剂选自具有通式(II)的化合物，其中R”為选自C8、C10、C12、C18的直链烷基及其所有比例的混合物。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的组合物其中，所述酯溶剂选自由2-乙基己基乳酸酯、乙酸烷基酯、脂肪酸酯、羧酸酯和2-乙基琥珀酸的甲基二酯的混合物、甲基戊二酸和可能的己二酸组成的组
12.根据权利要求1-11中任意一项所述的組合物，该组合物含有: -20-60重量％的根据权利要求3所述的混合物M,以及 -40-80重量％的根据权利要求1-11中任意一项所述的化合物B
13.一种用于在20-25°C下获得具囿小于或等于I重量％的水溶解度的溶剂的组合物的方法，其特征在于该方法包括混合10-90重量％的至少一种根据权利要求1-7中任意一项所述的混合物M与10-90重量％的至少一种根据权利要求1-11中任意一项所述的化合物B。
14.根据权利要求1-12中任意一项所述的组合物的应用该组合物作为在20-25°C下具有小于或等于I重量％的水溶解度的溶剂。
15.—种植物检疫制剂该植物检疫制剂含有至少一种植物检疫活性成分以及,作为用于至少一种植粅检疫活性成分的溶剂的组合物，该组合物为权利要求1-12中任意一项所述的组合物
16.根据权利要求15所述的植物检疫制剂，其中该植物检疫淛剂为乳油、浓缩乳剂或微乳剂的形式。
17.根据权利要求15或16所述的植物检疫制剂其中，所述植物检疫活性成分选自下列化合物之中: -阿维菌素 -甲草胺，` -溴苯腈 -毒死蝶， -顺式氯氰菊酯 -氟氯氰菊酯， -醚菊酯 -氟芬隆， -氯芬奴隆 -腈菌唑， -苯敌草 -咪鲜胺， -敌稗 -二甲戊乐灵， -唑优选三唑，更优选戊唑醇或烯效唑 -三唑醇， -氟乐灵 -乙氧氟草醚， -吡虫啉 -甜菜呋， -磷酸二甲酯 _乐果，以及-残杀威；以及它们嘚混合物
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的植物检疫制剂，其中权利要求1-12中任意一项所述的组合物相对于制剂的重量典型地为`10-90重量％。
【发明者】T·维达尔尔, B·阿布力巴特, V·布拉玛蒂, M·巴拉斯特 申请人:罗地亚运营公司

【专利摘要】提供了用于处理作粅籽粒的方法这些方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽的存在丅处理这些浸泡的籽粒
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此 发明领域
[0003] 本发明涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化 为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品另外，本发明还涉及一种酶组合物并苴涉及本 发明的组合物的用途该酶组合物包括一种或多种适于本发明的方法的酶活性。
[0005] 作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分 在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖）、醇(例如乙醇)和增甜剂之前，必须 使淀粉可供使鼡并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理如果淀粉包含多于0.5%的杂 质（包括蛋白质），则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料为了從作物籽粒开始提供这 样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒如将在下文进一步所描述。
[0006] 通常使用湿磨将玉米籽粒分离为其四种基本组分:淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质
[0007] 典型地，湿磨方法包括四个基本步骤首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48小 时以开始使淀粉囷蛋白键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨以破坏果皮并使胚芽与剩余 的籽粒分离。剩余的浆液由纤维、淀粉和蛋白质组成将其细磨並筛选，以将纤维与淀粉和 蛋白质分离在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后可以将淀粉转化为糖浆或 醇，或干燥并销售为玊米淀粉或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。
[0008] 已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途已经显示，商业酶产品 Steepzyme?(可获嘚自诺维信公司（Novozymes A/S))适于湿磨方法的第一步骤即将玉 米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。
[0009] 最近已经研发了"酶研磨（enzymatic milling)"，这是一种改性湿磨方法该方 法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧 化硫的需求。参见约翰斯顿（Johnston)等人谷物化學（Cereal Chem)，81第626-632页 (2004)。
[0010] US 6,566,125披露了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法该方法涉及将玉蜀黍籽 粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液 并用酶(例如蛋白酶)孵育该经碾磨的玉蜀黍浆液。
[0011] US 5,066,218披露了一种研磨谷物(尤其是玉米）的方法该方法包括清洗谷物， 将谷物浸渍在水中以将其软化并且然后用纤维素酶研磨谷物。
[0012] W0 披露了一种处理作物籽粒的方法该方法包括将籽粒在水中浸泡 1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒
[0013] W0 披露了一种分离淀粉面筋的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸 性蛋白酶
[0014] W0 披露了一种洗涤获得自研磨方法的淀粉面筋分离步骤的淀粉浆 液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤澱粉浆液
[0015] 仍需要改进用于提供适于转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉的方法。
[0017] 本发明涉及一种用于处理作物籽粒的方法该方法包括以下步骤：
[0018] a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；
[0019] b)碾磨这些浸泡的籽粒；
[0020] c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，
[0021 ]其中在步骤b)の前、与其同时或之后进行步骤c)
[0022]并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项 组成：
[0024] (b) -种多肽该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多 核苷酸编码：
[0030] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性
[0031]在一个优选实施例中，具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶例如家族 S53的一种丝氨酸蛋白酶，如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶、或来自污叉丝孔菌 (Dichomitus squalens)或变色检菌（Trametes vericolor)的S53蛋白酶
[0034] 本发明还涉及在处理作物籽粒的方法中使用的多肽的用途以及包括在本发明中 使用的多肽的酶组合物。
[0038] SEQ ID从):3是具有即标记的重组表达0嫩序列的0嫩序列
[0040] SEQ ID N0:5是来自大型亚灰树花菌的成熟S53蛋白酶3的氨基酸序列。
[0045] 等位基因变体:术语"等位基因变体"意指占据同┅染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性基因突变鈳以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序 列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽
[0046] cDNA:术语"cDNA"意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子， 该mRNA分子是从真核细胞获得的cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早 先的初始RNA转录本是mRNA的前体其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤 进行加工，包括剪接
[0047]编码序列：术语"编码序列"意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序 列的边界一般由开放阅读框架决定该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始 密码子(例洳GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束编码序列可以 是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
[0048]控制序列：术语"控制序列"意指对于表达编码夲发明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同 基因）或外源的（即来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的此类控制序列包括 但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少 控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多 肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的这些控制序列可以提供有多个 接头。
[0049]表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤包括但不限于转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
[0050]表达载体:术语"表达载体"意指包括编码多肽的多核苷酸并可操作地连接至提供 其表达的其他核苷酸的线性或环形DNA分子
[0051]片段:术语"片段"意指使一个或多个(例如若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/ 或羧基末端缺失的多肽;其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面一个片段包含至少330 个氨基酸残基（例如，SEQ ID N0:2的氨基酸20至349);在另一个方面一个片段包含至少 345个氨基酸残基(例如，SEQ ID N0:2的氨基酸10至354);在一个另外的方面一个片段包 [0052]宿主细胞:术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表 达载體进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的 突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代
[0053]分离嘚多核苷酸:术语"分离的多核苷酸"意指相对于自然界中发现的那种多核苷 酸通过人工手动修饰的多核苷酸。在一个方面该分离的多核苷酸昰至少1%纯的，例如至 少5 %纯的、至少10 %纯的、至少20 %纯的、至少40 %纯的、至少60 %纯的、至少80 %纯的、至 少90%纯的、以及至少95%纯的如通过琼脂糖电泳所确萣的。多核苷酸可以是基因组、 cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合
[0054]分离的多肽:术语"分离的多肽"意指相对于自然界中发现的那种多肽通过人工手 动修饰的多肽。在一个方面该多肽是至少1 %纯的，例如至少5 %纯的、至少10 %纯的、至少 20 %纯的、至少40 %纯的、至少60 %纯的、至少80 %纯的、鉯及至少90 %纯的如通过SDS-PAGE所确定的。
[0055] 成熟多肽:术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端 截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽在一个方面，基于使用具有 N-末端HQ标记的成熟多肽的埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的测序该成熟多肽是 SEQ ID N0:2的編号中的氨基酸1至366。使用预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人 1997,蛋白质工程（Protein Engineering)10:1-6)，SEQ ID N0:2的编号中的氨基酸-198 至-182被预测为信号肽本领域已知，宿主细胞可以产生由哃一多核苷酸表达的两种或更 多种不同成熟多肽(即具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
[0056] 成熟多肽编码序列:术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有蛋白酶活性的成熟多 肽的多核苷酸在一个方面，基于通过具有N-末端HQ标记的成熟多肽的埃德曼降解和整体 分子量分析对该成熟哆肽的确定该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 1的编码中的核苷酸 605至1702。此外基于预测程序SignalP(尼尔森（Nielsen)等人，1997,蛋白质工程 (Protein [0057] 核酸构建体:术语"核酸构建体"意指从天然存在的基因中分离的、或以一种方式 被修饰成包含在自然界中不会另外存在的核酸区段的、或合成的单链或双链核酸分子当 核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语"表达 盒"含义相同
[0058]可操作地连接:术语"可操作地连接"意指如丅的构造，其中控制序列相对于多核 苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达
[0059] 蛋白酶活性:术语"蛋皛酶活性"意指蛋白水解活性(EC 3.4)。存在若干种蛋白酶 活性类型例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基 酸残基嘚羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有酸性最适pH(最适 pH〈pH 7)的丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)
[0060] 可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物该底物包括与所讨论 的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶pH值测定 的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15°C、20°C、25°C、30°C、35 °(：、37°(：、40°(：、45°(：、50°(：、55°(：、60°(：、65°(：、70°(：、80°(：、90°(：、戓95°(：普通蛋白酶底物的 实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方 法中将变性的血红蛋白用作底物并苴在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可 长的一致性"的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性并且如下计算：
[0063](一致的殘基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0064]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件 赖斯(Rice)等人，2000,同上）（优选3.0.0版或更新版本)嘚尼德尔程序中所实施的尼德尔 曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)1970,同上)来确定两个脱氧核糖核 苷酸序列之间的序列一致性程度。使用版本6.1.0所使用的任选参数是空位开放罚分10、 空位延伸罚分0.5,及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的"最长 的一致性"的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比┅致性并且如下计算：
[0065](一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0066] 严格条件:不同的严格条件定义如下。
[0067] 术语"非常低严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言遵循标准 DNA印迹程序，在42 °C下在5X SSTO、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和 25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时朂后在45°C下使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料 洗涤三次，每次15分钟
[0068]术语"低严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印 迹程序在42 °C丅在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25 %甲酰 胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50°C下使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次 每次15分钟。
[0069] 术语"中严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言遵循标准DNA印 迹程序，在42 °C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35 %甲酰 胺中预杂交和杂交12至24小時最后在55°C下使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次， 每次15分钟
[0070] 术语"中-高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA印迹程序在42 °C下在5X SSTO、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和 35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60°C下使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料 洗涤三次每次15分钟。
[0071] 术语"高嚴格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言遵循标准DNA印 迹程序，在42 °C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50 %甲酰 胺中预杂交和杂茭12至24小时最后在65°C下使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料洗涤三次， 每次15分钟
[0072] 术语"非常高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA茚迹程序在42 °C下在5X SSTO、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和 50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70°C下使用2X SSC、0.2%SDS将载体材料 洗涤三次每次15分钟。
[0073] 子序列:术语"子序列"意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的 5'端和/或3'端缺失的多核苷酸;其中该子序列编码具有蛋白酶活性的爿段在一个方面， 一个子序列包含至少990个核苷酸(例如SEQ ID NO: 1的核苷酸662至1651)，例如以及至 少1035个核苷酸（例如，SEQ ID NO: 1的核苷酸632至1666);例如以及至少1065个核苷酸 [0074] 基本上纯的多核苷酸:术语"基本上纯的多核苷酸"意指不含其他外来的或不需要 的核苷酸的多核苷酸制剂，并且其存在的形式适于在基因笁程化多肽生产系统内进行使 用因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最多 4%、最多3%、最多2%、最多1 %和最多0.5%与該多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷 酸材料然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5 '和3 '非翻译区如启动子和终止 子。优选哋该多核苷酸是按重量计至少90 %纯的，例如至少92 %纯的、至少94 %纯的、至少 95 %纯的、至少96 %纯的、至少97 %纯的、至少98 %纯的、至少99 %纯的、以及至少99.5 %纯 的本发明的多核苷酸优选处于基本上纯的形式。
[0075] 基本上纯的多肽:术语"基本上纯的多肽"意指这样一种制剂该制剂包含与其天 然关联或重组關联的按重量计至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至 多2%、至多1%、以及至多0.5%的其他多肽材料。优选地该多肽按存在于制剂中的总多肽 材料的重量计是至少92 %纯的，例如至少94 %纯的、至少95 %纯的、至少96 %纯的、至少 97 %纯的、至少98 %纯的、至少99 %纯的、至少99.5 %纯的、以及100 %纯的本发明的多肽 优选处于基本上纯的形式。例如这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法 制备多肽来完成。
[0076] 变体:术语"变体"意指在一个或哆个(若干个)位置包含改变（即一个或多个(若 干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失）的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用一个不同 氨基酸置换占用一个位置的氨基酸;缺失意指去除占据一个位置的氨基酸;并且插入意指 邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸本发明的这些变体具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至 少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的蛋白酶活性 [0077]在一个方面，该變体与如在此鉴定的SEQ ID N0:的成熟多肽相差多达10个(例如 1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中本发明涉及 在┅个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的在此的SEQ ID N0:的成熟 多肽的变体在一个实施例中，引入在此的SEQ ID NO:的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失 和/或插入的数目多达10个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微 小性质即，不会显著地影响蛋白质的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地Ι-βο个氨基酸的小缺失； 小的氨基-或羧基-末端延伸 如氨基末端的甲 硫氨酸残基； 多达20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
[0078] β_葡糖苷酶:术语"β_葡糖苷酶"意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E. C. 3.2.1.21)其 催化末端非還原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖出于本发明的目的，根据文丘 里(Venturi)等人2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶:产生、純化以及一 些生物化学特性（Extracellular beta-D-glucosidase 苷作为底物来测定葡糖苷酶活性一个单位的葡糖苷酶定义为在25°C、pH 4.8下，在含 有0.01 % T剪EEN? 20的50mM柠檬酸钠中从作为底物嘚ImM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖 苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子
[0079] β-木糖苷酶:术语"β-木糖苷酶"意指β-D木糖苷木糖水解酶(E. C. 3.2.1.37)，其催 化短β(1-4)朩寡糖的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基出于本发明的目的，一 个单位的β-木糖苷酶定义为在40°C、ρΗ 5下在含有0.01 % TWEEN? 20的100mM柠檬酸钠 Φ从作为底物的ImM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
[0080] 纤维二糖水解酶:术语"纤维二糖水解酶"意指一种14-β-?-葡聚糖纤維二糖水解 酶(E. C. 3.2.1.91和E. C. 3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含β-l4-连接的葡萄 糖的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷键水解从该链的还原端或非还原端释放纤维②糖（泰里 定纤维二糖水解酶活性。在本发明中汤美(Tomme)等人的方法可以用于测定纤维二糖水解 酶活性。
[0081 ]纤维素分解酶或纤维素酶：术语"纤維素分解酶"或"纤维素酶"意指一种或多种 (例如若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤 维二糖水解酶、一种或多种葡糖苷酶、或其组合用于测量纤维素分解活性的两种基本方 法包括：（1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素汾解活性（内切葡聚糖酶、纤 底物包括沃特曼(Whatman)Nal滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理 的木质纤维素等，测量总纤維素分解活性最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼 Nal滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC)(高斯 (Ghose)1987,纖维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities)，纯粹与应 [0082]纤维素材料:术语"纤维素材料"意指含有纤维素的任何材料纤维素是脱水纤维 二糖的均聚物，并且因此是线性i3-(l-4)_D-葡聚糖而半纤维素包括多种化合物，如具有一 系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露聚糖尽 管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存 在半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质
[0083]内切葡聚糖酶:术语"内切葡聚糖酶"意指一种内切-1，4-(13; 1，4)-i3_D-葡聚糖 4_葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基 纤维素）、地衣多糖中的1，4-?Η)_糖苷键和混合β-l3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖 以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β_1，4键的内切水解可以通过测量底物粘度的 家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱嘚内切-14-β-D-葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的并 且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合 使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中
[0085] 半纤维素分解酶或半纤维素酶:術语"半纤维素分解酶"或"半纤维素酶"意指一种 或多种（例如，若干种）水解半纤维素材料的酶参见例如，沙洛姆（Shallom)D.和肖汉姆 (Shoham)，Y.微生物半纖维素酶(Microbial hemicellulases)微生物学新见(Current Opinion In Microbiology)，):219-228)半纤维素酶是在植物生物质的降解中 的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、 阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷 酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。这些酶的底物即半纤 维素是支链和线性多糖的异质群体这些多糖经由氢键与植物细胞壁Φ的纤维素微纤维键 合，从而将它们交联成一个稳固网络半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形 成高度复杂的结构半纤維素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。 半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯 键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模炔基于它们一级序列的同源性可以被分配到GH和 CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可鉯进一步被分组为以字母标记的氏族(例如 GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶 (Carbohydrate-Active Enzymes) (CAZy)数据库中获嘚可以根据高斯(Ghose)和比萨拉 [0086] 具有纤维素分解增强活性的多肽:术语"具有纤维素分解增强活性的多肽"意指促 进具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。在一个方面使用在 总蛋白质重量的2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据W0 02/095014在米曲霉中重组产生)或 总蛋白质重量的2%-3%的烟曲黴β-葡糖苷酶(如WO 中所描述在米曲霉中重 组产生）的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下CELLUCIAST⑩1.5L(诺维信公司，巴格 斯瓦尔德丹麦)的混合物作为纤維素分解活性的来源。
[0087] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维 素分解酶的量降低优选至少1. 〇 1倍例如，臸少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5 倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍来增强由具有纤维素分解 活性的酶催化的纤維素材料的水解。
物来测定木聚糖酶活性一个单位的木聚糖酶活性定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中， 在37°C、pH 6下从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟产生1.0微摩尔天青 精。
[0090]作物籽粒:术语"作物籽粒"包括来自例如玉米(玉蜀黍）、水稻、大麦、高粱大豆、果 壳以及小麦的籽粒玉米籽粒是示例性的。已知多种玉米籽粒包括例如马齿型玉米、硬粒 玉米、有稃种玉米、具条纹玉米、甜玉米、糯玉米等。
[0091]在一个实施例中该玉米籽粒是黄色马齿型玉米籽粒。黄色马齿型玉米籽粒具有 称为"果皮(Pericarp)"的外部覆盖物保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫囷 微生物所不希望的
[0092]未被"果皮"覆盖的籽粒的唯一区域是"顶帽（Tip Cap)"，它是籽粒至穗轴的附着 点
[0093]胚芽："胚芽"是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的 遗传信息、酶、维生素以及矿物质在黄色马齿型玉米中，约25%的胚芽是玉米油覆盖且包 围胚芽的胚乳構成约82%的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白来源。存在两种 类型的胚乳软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中淀粉是 松散的。
[0094]淀粉:术语"淀粉"意指由植物的复杂多糖构成、由广泛出现在植物组织中的呈贮 藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H1005)n (其中η是任 何数字)的任何材料
[0095]研磨的：术语"研磨的"是指植物材料已经例如通过粉碎、分级、碾磨、磨碎等而被 分解成更小的颗粒。
[0098] 干固体:术语"干固体"是在干重基础上的浆液的全固体（以百分比计）
[0099] 寡糖:术语"寡糖"是具有2至10个单糖单位嘚化合物。
[0100]湿磨益处：术语"湿磨益处"意指改进的淀粉产量和/或纯度改进的面筋产量和/ 或纯度，改进的纤维纯度、或浸渍水过滤、脱水和蒸发更容易地分离胚芽和/或更好的糖化 后过滤及其过程能源节约中的一种或多种。
[0102] 具有蛋白酶活性的多肽
[0103] 具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水 解酶蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切 型蛋白酶（内肽酶）。内肽酶对N-和c-末端被封闭的肽底物显示出活性这些底物与所讨论 的蛋白酶的特异性有关。
[0104] 术语"蛋白酶"在此被定义為水解肽键的酶蛋白酶的定义也适用于如在此使用的 术语"亲本蛋白酶"和"蛋白酶变体"的蛋白酶部分。术语"蛋白酶"包括属于EC 3.4酶组(包 括其十八個亚类中的每一个)的任何酶EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈 (San Diego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版 [0109] 为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶可参考上述手册 和其中述及的原理。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定而不论其是天然存在的或 野生型蛋白酶;还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
[0110] S53肽酶家族包含酸起作用的内肽酶和三肽基-肽酶催化三联体的残基是Glu、 Asp、Ser，并且在氧阴离子穴中存在一个另外的酸性残基Asp这些残基的次序是Glu、Asp、 Asp、Ser。该Ser残基在枯草杆菌蛋白酶的六8口、把8、361'三联体中是等价于361'的亲核体并 且该三聯体的Glu是枯草杆菌蛋白酶中的广义碱基His的一个代替物。
[0111] 该催化三联体或氧阴离子穴的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失来 自夶型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID N0:5)的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能 是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175和Ser-283。来自变色栓菌（披露于W0 中的SEQ ID勵:24)的553蛋白酶的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能是位置6111-85)叩-89、 [0112] 该S53家族的肽酶倾向于在酸性pH下最有活性(不像同源的枯草杆菌蛋白酶）并 且这可归因于羧基残基(尤其昰Asp)在氧阴离子穴中的功能重要性。这些氨基酸序列不与 家族S8(即丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶和同系物）中的那些密切相似并且这一点与唍全 不同的活性位点残基以及关于最大活性的所得的较低的pH-起，为该家族提供了实质性差 异肽酶单元的蛋白质折叠对于这个家族的成员來说与枯草杆菌蛋白酶的类似，具有氏族 类型SB
[0113]关于本发明，鉴定并克隆了在低pH(3_4)下对湿磨具有高活性的来自大型亚灰树 花菌的新的S53蛋白酶为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可 参考上述手册和其中述及的原理可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测萣，而不论其是 天然存在的或野生型蛋白酶;还是基因工程化的或合成的蛋白酶
[0114]用于本发明的方法中的蛋白酶是肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶展现 了 pH特性尤其是pH稳定性特性，这使它们作为用于在湿磨和其他应用中使用的候选物具 有实质性利益
[0115] 用于本发明的方法Φ的蛋白酶是酸性蛋白酶，其中在P1位置中偏好疏水性氨基酸 残基例如Leu、Tyr、Phe和Met。这些蛋白酶在一个宽的从2-5的pH范围下对Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有活性并在经受低至3的pH 2小时之后保留 多于95 %的活性。
[0116] 用于本发明的方法中的具有蛋白酶活性的多肽选自下组该组由以下各项组成：
[0118] (b) -种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多 核苷酸编码：
[0124] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一个片段该片段具有蛋白酶活性。
个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七 个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个 氨基酸、以及相差一个氨基酸
[0141] 在一个实施例中，用于本发明的方法中的蛋白酶优选地包括以下各项戓由其组 成：SEQIDN0:5、SEQIDN0:6或者SEQIDN0:2或SEQIDN0:4的成熟多肽或者披露于TO 中的SEQ ID N0:24或SEQ ID N0:25的多肽的氨基酸序列、其等位基因变体;或 是从N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段 在另一个方面，该多肽包括SEQ ID N0:5的多肽或由其组成在另一个优选方面，该多肽包 括SEQ ID N0:2的氨基酸1至366或由其组成
[0142] 茬一个实施例中，用于本发明的方法中的多肽具有蛋白酶活性并且由以下多核苷 酸编码这些多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高嚴格条件、高严格条件或非常高严 格条件下与（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列、或的全长互补链杂交(J.萨姆布 鲁克（Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)1989,分子克隆实验 [0143] SEQ ID NO: 1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的成熟多肽的氨基酸序列或其片段可以用于设计核酸探针用以根据 本领域中众所周知的方法从不同属或种的菌株中鉴定并且克隆出编码具有蛋白酶活性的 多肽的DNA。具体地说此类探针可以用于遵循标准DNA印迹程序与感兴趣的属或種的基因 组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因此类探针可以明显短于完整序列，但是长 度应为至少14,例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸优选地，核酸探针的长度为至少 100个核苷酸例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500 个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA 和RNA探针二者均可使用典型地将探针进行标记(例如，用3￥、3!1、353、生物素、或抗生物素 疍白）以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针
[0144] 可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码 具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖 或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可轉移到并 固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上为鉴定与SEQ ID NO: 1或其子序列同源的克 隆或DNA，在DNA印迹法中优选使用载体材料
[0145] 出于本发明的┅个目的，杂交表明多核苷酸在非常低至非常高严格条件下与被标 记的核酸探针杂交该探针对应于SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列、其全长互补链戓其子 序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核 酸探针杂交的分子
[0146] 在一个方面，该核酸探針是SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列在另一个方面，该 核酸探针是其片段在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID N0:2的多肽或其片段的多核 苷酸在另一個优选方面，该核酸探针是SEQ ID N0:1
[0147] 对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严格条件定义为最佳地 遵循标准DNA印迹程序在42°C下在5X SSPE、0.3 % SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子 DNA中，以及对于非常低和低严格条件在25%甲酰胺中对于中和中-高严格条件在35%甲 酰胺中，或对于高和非常高严格條件在50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时最后在65 °C 变体。这些氨基酸变化可以具有微小性质即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的 保守氨基酸取代、插入或缺失;典型地一个至约30个氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末 端延伸如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达约20-25个残基的尛接头肽;或便于通过改变净 电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸标记或HQ标记、抗原表位或结合域
[0150] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸性 氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸(亮氨酸、 异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨 酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般鈈会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且 [0151] 可替代地氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如氨基酸 改变鈳以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等
[0152]亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，如定点诱变戓丙 氨酸扫描诱变（坎宁安（Cunningham)和韦尔斯(WeiIs)1989，科学（Science)244:)在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变并且对所得突变 体汾子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见 希尔顿(Hilton)等人，1996,生物化学杂志（J. Biol. Chem.)271:也可结合假定 接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记 进行确定对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用参见， 例如德沃斯(de 19或20个
[0156] 该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端 戓C-末端处融合
[0157] 该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合通过将编码另一种多肽嘚多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融 合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的并包括连接编码多肽的编码序列，这 样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控 [0158] 融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点茬融合蛋白分泌之时，该位 点被位点从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点： 马丁(Martin)等人2003,工业微苼物学与生物技术杂志（J. Ind.Microbiol .Biotechnol ·) 传学（Proteins:Structure, Function, and [0159] 该多肽可以由包含对于His标记或HQ标记的编码的重组DNA序列来表达，以在任意 翻译后修饰之后给出包含该Hi s标记戓HQ标记的全部或部分的成熟多肽该HQ标记(具有序 列-RHQHQHQ)可以在翻译后修饰过程中完全或部分切割掉，得到例如附接至成熟多肽的N-末端的另外的氨基酸-RHQHQ
[0160] 碳水化合物分子通常在翻译后修饰过程中附接至来自真菌来源的多肽。为了辅助 质谱分析该多肽可以用内切糖苷酶孵育以使各N-連接的位置去糖基化。对于每个去糖基 化的N-连接位点一个N-乙酰己糖胺仍然在该蛋白质主链上。
[0161] 具有蛋白酶活性的多肽的来源
[0162] 可以从任何屬的真菌获得根据本发明所使用的具有蛋白酶活性的多肽出于本发 明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语"从…中获得"应意指由多核苷酸编码的多肽 是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的在一个方面，从给 定来源获得的多肽被分泌到细胞外
[0163] 该多肽可以是一种真菌多肽。例如该多肽可以是来自一个门，例如担子菌门内的 具有蛋白酶活性的多肽在一个方面，该多肽是來自伞菌纲的真菌的蛋白酶例如来自多孔 菌目，或来自革菌科或来自亚灰树花菌属。在一个实施例中用于本发明的方法中的多肽 来洎大型亚灰树花菌。
[0164]在一个实施例中用于本发明的方法中的多肽来自叉丝孔菌属(Dichomitus)，优 选来自污叉丝孔菌在一个实施例中，用于本发明嘚方法中的多肽来自栓菌属优选来自变 色栓菌。
[0165] 将理解的是以上提到的物种涵盖完全状态和不完全状态（perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效粅，例如无性型而不管它们已知的物种名 称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份
Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究 中心(NRRL)〇
[0167] 可以使用以上提到的探针从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等）分 离的微生物或直接从自然材料(例如土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。 用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的嘫后可以通过类似 地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷 酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽嘚多核苷酸就可以通过使用本领域普通技术 人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人1989,同 上)。
[0169] 用来分离或克隆編码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的并且包括从基因 组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表達 文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段实现从这样的基因组DNA克隆多 核苷酸。参见例如，伊尼斯（Innis)等人1990，PCR:方法和应用指南（PCR:A Guide to Methods and Application)学术出版社(Academic Press)，纽约可以使用其他核酸扩增 程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以 从芽孢杆菌属嘚一种菌株或来自芽孢杆菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸并且因 此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种變体
[0170] 在一些实施例中，这些多核苷酸包括以下多核苷酸或由其组成所述多核苷酸与 SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列具有至少90%，例如至少91%、至少92%、臸少93%、至少 94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性程度这 些多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。
[0171] 修饰编码本发明多肽的哆核苷酸对于合成与该多肽基本上类似的多肽可能是必 需的术语"基本上类似"于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种 工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不 同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO: 1的成熟多肽编碼序列（例如其子序列）形式呈现 的多核苷酸和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的 宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取 代来构建。对于核苷酸取代的一般描述参见例如福德(Ford)等人，1991蛋白表达与纯化 (Protein Expression and Purification)2:95_107〇
[0172] 在实施例中，编码具有蛋白酶活性的多肽的多核苷酸在非常低严格条件、低严格 条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的 成熟多肽编码序列、（ii)包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列或（iii) (i)或（ii)的全长互补链;或其等位基洇变体及子序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人 1989,同上），如在此所定义
[0175] 研磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且将籽粒分离成四种主要荿分： 淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质
[0176] 在一个实施例中，使用湿磨方法湿磨使纤维和/或胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白 质)很好分离并且时常應用于平行生产糖浆的场所。
[0177]本发明的诸位发明人已经出人意料地发现可以通过在如在此描述的方法中处理 作物籽粒而改进淀粉和/或面筋终产物的品质。
[0178] 本发明的方法与传统方法相比产生了更高的淀粉和/或面筋产量和或品质，因为 淀粉和面筋终产物更纯和/或获得了更高嘚产量和/或使用更少的加工时间另一种优势可 以是可以减少需要使用的化学品（例如S02和NaHS03)的量或甚至完全除去。
[0180] 淀粉是在植物细胞内作为鈈溶于水的微小颗粒形式而形成当放入冷水中时，这 些淀粉颗粒可以吸收少量的液体并膨胀在高达约50°C至75°C的温度下，膨胀可以是可逆 的然而，在更高温度下开始不可逆膨胀，称为"糊化"有待根据本发明加工的颗粒状淀粉 可以是含有粗淀粉的材料，该材料包括(例如研磨的）全谷物，这些全谷物包括非淀粉级 分如胚芽残余物和纤维。可以例如通过湿磨将原料(如全谷物)的粒度减少以便打开结构 并尣许进一步加工。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例 如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所
[0181 ] 在一个实施唎中，粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间或使得至少 30%、优选至少50%、更优选至少70%、甚至更优选至少90%的含淀粉材料适合通过具有 0.05_3.0mm筛网、优选0.1_0.5mm筛网的筛孓。
[0182]更具体而言将玉米籽粒以及其他作物籽粒降解为适于将淀粉转化为单糖和寡 糖、乙醇、甜味剂等的淀粉基本由四个步骤组成：
[0188] 通过茬约50 °C的温度(例如约45 °C至60 °C之间）下，在水中浸泡约30分钟至约48小 时之间(优选30分钟至约15小时)而软化玉米籽粒在浸渍过程中，籽粒吸水从洏将其水分 含量从15 %增加至45%并使大小增加超过一倍。任选地向水中添加例如0.1 %二氧化硫 (S02)和/或NaHS03以防止细菌在温暖环境中生长随着玉米膨胀并软囮，浸渍水的温和酸 度开始使玉米内的面筋键松散并释放淀粉在将玉米籽粒浸渍后，它们裂了开来以释放胚 芽。胚芽包含有价值的玉米油基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下 "漂浮(floating)"而将胚芽与淀粉、外壳和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用於 消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响
[0189] 在本发明的一个实施例中，于范围在40与60°C之间的温度(优选大约50°C)下将 籽粒在沝中浸泡2-10小时，优选约3-5小时
[0192] 为了得到最大的淀粉回收同时将终产物中的任何纤维保持至绝对最小值，在加工 过程中必须从纤维中洗涤出遊离淀粉收集纤维，并使其成浆并过筛以回收任何残留的淀 粉或蛋白质。
[0194] 将来自纤维洗涤步骤的淀粉-面筋悬浮液(称作研磨淀粉)分离成澱粉和面筋与 淀粉相比，面筋具有较低的密度通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出面筋。
[0196] 来自淀粉分离步骤的淀粉浆液包含一些鈈溶性蛋白质和许多的可溶物在可以生 产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其除去在水力旋流器中，将仅仅剩余1%或 2%蛋白质的淀粉稀释洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤以除去最后痕量的蛋白质并产 生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5 %
[0198] 可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浆、玉米面筋饲料、胚芽、玉米油、玉米面筋粉、 玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(例如玉米糖浆）、以及玉米乙醇。
[0200] 下面描述的一种或哆种酶和多肽有待以"有效量"用于本发明的方法中下文应在 上文的"定义"部分中的酶披露的背景下加以阅读。
[0201] 纤维素分解组合物
[0202] 在一个实施唎中该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌 株;腐质霉属的菌株例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株例如卢克诺文思金 抱子菌（Chrysosporium lucknowense)的菌株。
[0203] 在一个优选实施例中该纤维素分解组合物来源于里氏木霉的菌株。
[0204] 该纤维素分解组合物可以包括鉯下多肽(包括酶）中的一种或多种:具有纤维素分 解增强活性的GH61多肽β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶CBHI和CBHII，内切葡聚糖酶木聚糖酶 或其两种、彡种或四种的混合物。
[0205]在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽以及一种葡糖苷酶。
[0206] 在一个实施例Φ该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽以及一种木糖苷酶。
[0207] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具囿纤维素分解增强活性的GH61 多肽以及一种内切葡聚糖酶。
[0208] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽以忣一种木聚糖酶。
[0209] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
[0210] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种β-木糖苷酶。在一个实施例Φ该纤维素分解组合物包括一 种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个 实施例中该纤维素汾解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡 糖苷酶以及一种木聚糖酶。
[0211] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一種具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种β-木糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中该纤维素分解组合物包括 一种具有纤维素汾解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶以及一种木聚糖酶。
[0212] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中该纤维 素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性嘚GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木 糖苷酶以及一种木聚糖酶。在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分 解增强活性嘚GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
[0213] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
[0214] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
[0215] 在一个实施例中该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶I。
[0216] 在一个实施例中该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II。
[0217] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种内切葡聚糖酶I以及一种木聚糖酶。
[0218] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61 多肽、一种內切葡聚糖酶II以及一种木聚糖酶。
[0219] 在另一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以忣一种CBHI。
[0220] 在另一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的 GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBHI以及一种CBHII。
[0221] 该纤维素汾解组合物可以进一步包括一种或多种选自下组的酶该组由以下各项 组成：酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀蛋白以及植 酸酶。
[0222] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
[0223] 在一个实施例中该纤维素分解组合物可以包括一种或多种具有纤维素分解增强 活性的GH61多肽。
[0224] 在一个实施例中具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例 如金黄色嗜热子囊菌的菌株(例如在W0 中描述为序列号2的一种）；或以下具 有纤维素分解增强活性的GH61多肽该多肽与W0 中的序列号2具有至少80%， 例如至少85 %、例如至少90 %优选95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至 少99 % -致性
[0225] 在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于来自青霉属的菌 株例如埃默森青霉菌的菌株(例如在W0 中披露的一种），或以下具有纤维素 分解增强活性的GH61多肽该多肽与W0 中的序列号2具有至少80%，例如至少 85 %、例如至少90 %优选95 %，例如臸少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % - 致性
[0226] 在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于梭孢壳属例如 土生梭孢壳霉的菌株(唎如在W0 中披露为序列号7和序列号8的一种）；或来源 于曲霉属的菌株的多肽，例如烟曲霉的菌株(例如在W0 中描述为序列号2的一 种）或以下具囿纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与其具有至少80%例如至少 85 [0231] 在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II例如来源于木霉屬的 内切葡聚糖酶，例如里氏木霉的菌株(例如在W0 中描述为序列号22的一种）； 或以下内切葡聚糖酶该内切葡聚糖酶与W0 中的序列号22具有至少80%，例 如至少85 %、例如至少90 %优选95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少 99%-致性在一个方面，该蛋白酶与W0 中的序列号22的成熟多肽相差多达 10个(唎如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中 本发明涉及在一个或多个（例如，若干个）位置处包括取玳、缺失和/或插入的W0 中的序列号22的成熟多肽的变体在一个实施例中，引入W0 中的序列 号22的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目哆达10个例如1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性 的保守氨基酸取代戓插入;典型地1-30个氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸如 氨基末端的甲硫氨酸残基;多达20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另┅种 功能来纯化的小延伸。
[0233] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种木聚糖酶。在一个优选方面该木 聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。
[0235] 在一个实施例中该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如棘孢曲霉的菌株(例如在WO 94/021785中描述为序列号5(称为Xyl II)的一种）；或以下GH10木聚糖酶该木聚糖酶與TO 94/021785中的序列号5具有至少80%，例如至少85%、例如至少90%优选95%，例如至少 96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99%-致性在一个方面，该蛋白酶与描述于W0 94/021785中的序列号5的成熟多肽相差多达10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8 个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中本发明涉及在一个或多个(例洳，若干个)位置 处包括取代、缺失和/或插入的描述于W0 94/021785中的序列号5的成熟多肽的变体在一 个实施例中，引入描述于W0 94/021785中的序列号5的成熟多肽Φ的氨基酸取代、缺失和/ 或插入的数目多达10个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性 质即，不会显著地影响蛋皛质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;典型地1-30个 氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个 残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
[0236] 在一个实施例中该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株例洳在W0 中描述为SEQ ID N0:6(作为Xyl III);或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与TO 中的Xyl III具有至少80%例如至少85%、例如至少90%，优选95%例如至 少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % -致性。在一个方面该蛋白酶与描述于TO 中的SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6 个、7个、8个、9个或10个)氨基酸在另一个实施唎中，本发明涉及在一个或多个(例如若干 个)位置处包括取代、缺失和/或插入的描述于W0 中的SEQ ID N0:6的成熟多 肽的变体。在一个实施例中引入描述于W0 中的SEQ ID N0:6的成熟多肽中的 氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个这些氨基酸 变化可以具有微小性质，即不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或 插入;典型地1-30个氨基酸的小缺失;小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸 残基；多达20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延 伸
[0239] 在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属唎如烟曲霉的菌株（例如在W0 中描述为序列号206的一种）；或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与W0 中的序列号206具有至少80%例如至少85%、例如至少90%，優选95%例如至少 96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99%-致性。在一个方面该蛋白酶与描述于W0 中的SEQ ID N0:206的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5個、6 个、7个、8个、9个或10个)氨基酸在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如若干 个)位置处包括取代、缺失和/或插入的描述于W0 中嘚SEQ ID N0:206的成熟 多肽的变体。在一个实施例中引入描述于W0 中的SEQ ID N0:206的成熟多肽 中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个这些氨 基酸变化可以具有微小性质，即不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取 代或插入;典型地1-30个氨基酸的小缺夨;小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫 氨酸残基;多达20-25个残基的小接头肽;或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小 延伸
[0240] 在┅个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株例如烟曲霉的菌株(例如在 美国临时号61/526，833或PCT/US 12/052163(实例16和17)中披露的一种）或来源于木霉 属的菌株，例如里氏木霉的菌株例如W0 中的序列号58的成熟多肽，或以下β-木糖苷酶该木糖苷酶与其具有至少80%，例如至少85 %、例如至少90 %优选95%，唎如 至少96%、例如97%、例如至少98%、例如至少99% -致性
[0242] 在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶在一个 实施例中，該葡糖苷酶可以是来源于曲霉属的菌株的葡糖苷酶例如来源于米曲霉的， 例如披露于W0 中的一种或在W0 中披露的具有β-葡糖苷酶活性 的融合疍白或来源于烟曲霉的，例如在W0 中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷 酶变体例如披露于PCT申请PCT/US [0243] 在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属例如烟曲霉的菌株，例如在W0 中描述的一种或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80%例如至 少85 %、例如至少90 %，优选95 %例如至少96 %、唎如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % 一致性。
[0244] 在一个实施例中该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株例如在W0 中描述的一种，或以下β-葡糖苷酶该β-葡糖苷酶与其具有至少80%，例如至 少85 %、例如至少90 %优选95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % 一致性
[0246] 在一个实施例中，該纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH 1(纤维二糖水解 酶I)在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)例如来源 于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株例如披露于W0 中的 序列号2中的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株例如里氏木霉的菌株。
[0247] 在一個实施例中该纤维二糖水解酶I来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株例如在 TO 中描述的一种，或以下CBHI该CBHI与其具有至少80%，例如至少85%、例 如至尐90 %优选95 %，例如至少96 %、例如97 %、例如至少98 %、例如至少99 % -致性
[0249] 在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH II(纤维二糖水 解酶II)在┅个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)例如来源于曲霉属的菌株的纤维 二糖水解酶II，例如烟曲霉的菌株;或木霉属的菌株例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株例 如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A
[0250]在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II来源于曲霉屬例如烟曲霉的菌株，例如在 TO 中描述的一种或以下CBHII，该CBHII与其具有至少80%例如至少85%、 例如至少90%，优选95%例如至少96%、例如97%、例如至少98%、例洳至少99% -致性。
[0251] 示例性纤维素分解组合物
[0252] 如以上提及的该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(例如酶）。
[0253] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素酶制剂，该制剂 包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白（例如W0 中的SEQ ID N0:74或76)以及金黄 色嗜热子囊菌GH61A多肽（例如W0 Φ的SEQ ID N0:2)。
[0255] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 中的SEQ ID N0:6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶（例如W0 中的SEQ ID NO: 206)与一种里氏木霉纤维素酶淛剂的共混物，该制剂包含烟曲霉纤维二糖水解酶I (例如W0 中的SEQ ID N0:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶11(例如，W0 中的SEQ ID [0256] 在一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物， 该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊 菌GH61A多肽（唎如W0 中的SEQ ID Ν0:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白 (例如，W0 的SEQ ID Ν0:74或76)
[0257] 在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组匼 物该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子 囊菌GH61A多肽(例如，W0 中的SEQ ID N0:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例洳TO 的SEQ ID NO:2)。
[0258] 在另一个实施例中该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合 物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例洳在W0 中披露为SEQ ID NO: 2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如TO 中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体:F100D、S283G、N456E、F512Y。
[0259] 本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式例如像除去或未除去细胞的粗 发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶組合物、或作为酶的来源 的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞）
[0260] 该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化嘚受保护 的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇）、和/或乳酸 或另一种有机酸对液体酶组合物进行穩定化。
[0263] 可以按有效量添加酶可以根据从业者和具体过程需要调节该有效量。通常酶可 以按以下量存在 :〇.〇〇〇1-2.51^总酶蛋白/^干固体(05)籽粒，优选0.001-111^酶蛋白/^03 籽粒优选0.mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.025-0.25mg酶蛋白/g DS籽粒优选 0.05-0.125mg酶蛋白/g [0265] 根据本发明，以下活性中的一种或多种的有效量可以在处理籽粒的过程中存在或 添加:戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯咲喃糖苷酶(8^13；[110；^^81(^86)、木葡聚 糖酶、植酸酶活性
[0266] 据信在将籽粒分为更细的颗粒后，该一种或多种酶可以更直接地作用于籽粒的细 胞壁和蛋白基质并且因此更有效因而，在随后的步骤中更加容易地将淀粉洗出。 优选實施例
[0267] 本发明的以下实施例是示例性的
[0268] 1. -种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：
[0269] a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；
[0270] b)碾磨这些浸泡嘚籽粒；
[0271] c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒
[0272] 其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，
[0273] 并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组该组由以下各项 组成：
[0275] (b) -种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多 核苷酸編码：
[0281] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一个片段该片段具有蛋白酶活性。
少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性的多 肽
[0283] 3.如实施例1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸编码的多肽该多核苷 酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的成熟多肽编码序列具有至少85%、至少90%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%序列一致性。
[0285] 5.如以上实施例中任一项所述的方法其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨 酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3、来 自污叉丝孔菌的S53蛋白酶或来自变色栓菌的S53蛋白酶。
[0286] 6.如以上实施例中任一项所述的方法其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰 树花菌属，优选来自大型亚灰树花菌或具有蛋白酶活性的所述多肽来自叉丝孔菌属，优选 来自汙叉丝孔菌或具有蛋白酶活性的所述多肽来自栓菌属，优选来自变色栓菌
[0287] 7.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在β_朩糖苷酶的存在下 处理这些浸泡的籽粒
[0288] 8.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素酶和/或半纤 维素酶的存在下处理這些浸泡的籽粒
[0289] 9.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在木聚糖酶的存在下处 理这些浸泡的籽粒
[0290] 10 .如以上实施例中任一項所述的方法，该方法进一步包括在纤维素分解组合物 的存在下处理这些浸泡的籽粒该纤维素分解组合物包括:1)纤维素酶或半纤维素酶，囷2) GH61多肽
[0291] 11.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在乙酰木聚糖酯酶的 存在下处理这些浸泡的籽粒
[0292] 12.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在一种选自下组的酶 的存在下处理这些浸泡的籽粒该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、纤維二糖 水解酶I、纤维二糖水解酶II、GH61多肽、或其组合。
[0294] 14.如以上实施例中任一项所述的方法其中这些作物籽粒来自玉米(玉蜀黍）、水 稻、大麥、高粱大豆、或果壳或小麦。
[0295] 15.-种酶组合物包括一种具有蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽选自下组该 组由以下各项组成：
[0297] (b) -种多肽，該多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多 核苷酸编码：
[0303] (e)(a)、(b)、（c)或(d)的多肽的一个片段该片段具有蛋白酶活性。
[0305] 17.如實施例15或16所述的组合物其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸 蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶例如来自大型亚灰树花菌的S53疍白酶3。
[0306] 18.如实施例15-17中任一项所述的组合物其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自 亚灰树花菌属，优选来自大型亚灰树花菌
[0307] 19.如实施例15-18中任┅项所述的组合物，该组合物进一步包括一种选自下组的 酶该酶由以下各项组成:木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、 GH61多肽、或其组合。
[0308] 20.如实施例15-19中任一项所述的组合物该组合物进一步包括β-木糖苷酶、木 聚糖酶和内切葡聚糖酶。
[0309] 21.肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽或如实施例15-20中任 一项所述的酶组合物在如以上实施例1-14中任一项所述的方法中的用途其中所述多肽选 洎下组，该组由以下各项组成：
thermomixer)来启动测定将管在艾本德恒温混勾仪上在最高振摇速率 (1400rpm.)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴并添加600μ1 500mM H3B03/Na0H(pH 9.7)停止孵育混合该管并将200μ1混合物转移至微量滴定板中，将其在OD4〇5处读取在该 测定中包括空白缓冲液(buf f er 10ml的YP+2%葡萄糖培养基中进行培养。在3天苼长之后取出样品并用SDS-PAGE分析以鉴 定重组蛋白酶产生。在转化体的培养物中观察到一个35与50kDa之间的新带在未转化的 BECh2的培养物中并未观察到該新带。将似乎以较高水平表达重组蛋白酶的若干转化体在 30 °C和200RPM下在500ml摇瓶中的100ml的YP+2 %葡萄糖培养基中进一步培养在2、3和4天 生长之后取出样品並且通过用SDS-PAGE分析样品而比较表达水平。选择以相对较高的水平 表达重组蛋白酶的单个转化体并将其指定为EXP01737通过在包含0.01 % ΤΕΙΤΟΝΦΧ-100的选擇培养基上稀释划线分生孢子而将ΕΧΡ01737分离两次，以限制菌落大小并将其如 上所述地在摇瓶中的ΥΡ+2%葡萄糖培养基中进行发酵，以提供供纯化用的材料4天生长之 将G25交联葡聚糖转移的酶施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)中平衡的〇-交联葡聚糖?？ 柱(来自GE医疗集团）上收集1 OmM丁二酸/NaOH(pH 3.5)的贯通流(run-through)和洗涤物 并包含S53蛋白酶(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定确认活性）。在将贯通流和洗涤 物级分充分混合的同时用1M HC1将该级分的pH调节至pH 3.25将经pH调节的溶液施加至 在10mM丁二酸/Na0H(pH 3.25)中平衡的SP-交联葡聚糖FF柱(来自GE医疗集团）上。在将柱 用平衡缓冲液充分地洗涤之后将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0->0.5M) 洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定）并且合并峰级分。向合并物中添加固体硫酸铵至2.0M最终(NH4)2S〇4浓度。将酶 溶液施加至在101^丁二酸/恥0!1、2.01(順4)2304化113.25)中平衡的苯基-1'〇7〇?63^柱(来 自东曹公司（TosoHaas))上在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将S53蛋白酶用在岼衡 缓冲液与10mM丁二酸/Na0H(pH 3.25)之间的线性梯度洗脱超过十个柱体积分析来自该柱 的级分的蛋白酶活性(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定）。合并具有较高活性嘚级分 并且将其转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团）上的10mM丁二酸/Na0H(pH 3.5)将 G25交联葡聚糖转移的蛋白酶施加至在10mM丁二酸/Na0H(pH 3.5)中平衡的SP-交联葡聚糖 HP柱(来自GE醫疗集团）上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后将蛋白酶用在相同的缓 冲液中的线性NaCl梯度(0->0.5M)洗脱超过五个柱体积。将来自该柱的构成主峰的级分合 并为纯化产物通过SDS-PAGE分析纯化产物并且在凝胶上看到一个主带和三个次带。这些 带的埃德曼N-末端测序显示所有这些带均与S53疍白酶相关并且因此我们预期这些次带 代表一些S53蛋白酶分子的切口。将纯化产物用于进一步表征
[0384] 实例3:来自大型亚灰树花菌的具有N-末端HQ标記的S53蛋白酶3的表征
[0385] 将动力学Su c-AAPF-pNA测定用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH 值下2小时之后的残余活性）。对于pH-稳定性曲线将蛋白酶在不同測定缓冲液中稀释10倍 以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37°C下孵育2小时。在孵育之后通过稀释于pH 4.0测 定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与殘余活性测定之前相同的pH值使用端点Suc-AAPF-pNA测定以获得在pH 4.0下的温度-活性曲线。使用动力学Suc-AAPX-pNA测定和十种 不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得酶在pH 4.0下的P1-特异性
[0386] 结果礻于下表1-4中。在这些表中包括蛋白酶10R(其在W0 中披露为 蛋白酶10R)的数据对于表1，活性是相对于酶的最适pH而言对于表2,活性是相对于样品 的残余活性而言，将这些样品保持在稳定条件(5°CpH 4.0针对来自实例2的S53蛋白酶;pH 9.0针对蛋白酶1 OR)下。对于表3活性是相对于酶(pH 4.0针对来自实例2的S53蛋白酶;pH 6.5针对蛋皛酶101〇的最适温度而言。对于表4活性是相对于酶的最佳底物（311〇-44?1^-ρΝΑ-ρΝΑ针对来自实例2的S53蛋白酶)而言。使用Protazyme AK测定以获得蛋白酶10R在pH 6.5下的温喥-活性曲线
[0396] 来自实例2的S53蛋白酶的其他特征
[0399] 附接至成熟序列的N-末端HQ标记的确认
[0400]使用安装有10KD截留过滤器的vivaspin超滤装置将此样品与50mM乙酸钠缓冲液 (pH 5.5)進行缓冲液交换。缓冲液交换后添加2yL的内切糖苷酶Η并且然后将该样品在5°C 下孵育过夜。注:对于每个去糖基化的N-连接位点一个N-乙酰己糖胺仍然在该蛋白质主链 上，从而使每个位点的分子量增加203.19Da然后通过质谱来分析样品。
[0401 ] 通过主峰的完整分子量分析确定的分子量为：38088.6Da對应于成熟序列加- RHQHQ和单个乙酰己糖胺。
[0402] 通过次峰的完整分子量分析确定的分子量为：37961Da对应于成熟序列加 -RHQH 和单个乙酰己糖胺。
[0403]成熟序列(来洎埃德曼N-末端测序数据和完整分子量分析）：
[0405]来自这一成熟序列的计算的分子量是37882.6Da
[0407] 根据以下程序，使玉米的处理经受模拟玉米湿磨过程两个处理涉及施用来自实 例2的S53蛋白酶(浸渍B和浸渍C)，而一个处理是无酶的(浸渍A)
[0408] 对于经酶处理的浸渍(浸渍B和浸渍C)，配制包含0.06%(w/v)S02和0.5%(w/v)乳 酸的浸渍溶液针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的（黄色马齿型）玉米以除去破碎籽 粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中然后，将所有烧瓶放入設置为52°C同时轻轻振荡的 定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中 移出
[0409] 以类似方式制作无酶嘚对照浸渍（浸渍A);除了将它浸渍于0.15% (w/v)S02和 0.5% (w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸渍28小时之外。
[0410] 将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上以使其脱水，并且然后姠原浸渍烧瓶中添加 100mL的淡自来水并旋涡用于冲洗目的。然后将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与 原玉米导液(draining)相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶 物的滤液将包含可溶物的滤液称为"轻浸渍水（light steep water)"（ "LSW"）。然后将收 集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量通过以下方式完成干燥:在设置为 105°C的烘箱中过夜干燥。
[0411]然后将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器（WaringLaboratory Blender)中（所以前缘是钝的）。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水并且然后将玉米在 低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽碾磨后，竝即将浆液转移回烧瓶用于酶孵育 步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水在酶处理烧瓶(浸渍B和浸渍 C)中加入酶并将其返囙至定轨摇床中，以在52°C下以更高的混合速率再孵育4小时如下表 5所示进行加酶。
[0412] 表5.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)
[0414] 孵育后将浆液转移至较大的烧杯中，用于除去释放的胚芽对照浸渍不经历行这 一孵育步骤，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工
[0415] 对于脱胚，使用漏勺轻轻地简单地搅拌混合物停止搅拌后，大量的胚芽片浮至表 面使用漏勺手动地将这些胚芽片从液面上撇出。将胚芽片放置於在其下方具有托盘的US No. 100(150μπι)筛网上重复这一混合与撇出过程，直到可忽略不计的量的胚芽上浮至表面 供撇出对漏勺中的浆醪的检查也未显示出在此时有大量的胚芽留在混合物中的证据，所 以停止脱胚然后，将已经积聚在No. 100筛网上的胚芽片添加至烧瓶中在该烧瓶中，将咜 们与125mL的淡水组合并旋涡以模拟胚芽洗罐。然后再次将烧瓶的内容物倾倒在筛网上， 确保轻敲烧瓶并且完全清除出其中的胚芽然后，将撇出烧杯中的脱胚浆液倾倒回搅拌器 中并且使用在筛网的下方的托盘中的胚芽洗涤水将胚芽从烧杯冲洗至搅拌器中。然后再 使用125mL嘚淡水第二次冲洗烧杯并将其添加至搅拌器中。在分析之前将筛网上的经洗涤 的胚芽在105°C下过夜烘干。
[0416] 然后将已经脱胚的纤维、淀粉囷面筋浆液在高速下在搅拌器中碾磨3分钟。利用 这一增加的速度从纤维中释放尽可能多的淀粉和面筋将搅拌器中的所得碾磨浆液用下方 具有托盘的No. 100振动筛(莱驰(Retsch)型号AS200摇筛装置)过筛。将莱驰装置的振荡频 率设为大约60HZ一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液(称作"研磨淀粉"）转移进 烧瓶中直到进一步加工。然后使筛网上的纤维在500mL的淡水中成浆并且然后重新倾倒 在振动筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先 前的研磨淀粉烧瓶中
[0417] 然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛每次使用240mL的淡洗涤沝。然后 是单次125mL洗涤同时振动以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤 后将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至鼡于在105°C下(过夜）烘干的铝制秤盘中之 前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉烧瓶中
[0418] 然后，在烘干之前通过布氏漏斗中的沃特曼滤纸真空过滤包括淀粉和面筋的研 磨淀粉。测量来自真空烧瓶的总滤液体积将250ml滤液转移至塑料瓶中，用于在105°C下烘 干48小時通过将面筋溶液的体积乘以面筋滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体 含量。将滤饼转移至不锈钢皿中用于首先在50°C下过夜幹燥，以使糊化最小化并且然后在 105°C下过夜干燥以获得干重(淀粉和面筋产量）。表6显示了两个实验中的不同级分产量
[0419] 表6实验4中的实验對照和蛋白酶的级分产量。
[0421 ]注:A是两个批次的实验数据的平均值
[0423] 根据以下程序使玉米的处理经受模拟玉米湿磨过程。两个处理涉及施用蛋皛酶 和纤维素酶F的组合(浸渍B和浸渍C)而一个处理是无酶的(浸渍A)，其中S53蛋白酶来自实 例2对于经酶处理的浸渍(浸渍B和浸渍C)，配制包含0.06% (w/v)S02和0.5% (w/v)乳酸嘚 浸渍溶液针对每个烧瓶，清洗1 〇〇克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米以除去破碎籽粒，并 且将其放入200mL上述浸渍水中然后，将所有烧瓶放入设置为52°C同时轻轻振荡的定轨空 气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中移出
[0424] 以类似方式制莋无酶的对照浸渍（浸渍A);除了将它浸渍于0.15% (w/v)S02和 0.5% (w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸渍28小时之外。
[0425] 将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上以使其脱水，并苴然后向原浸渍烧瓶中添加 l〇〇mL的淡自来水并旋涡用于冲洗目的。然后将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与 原玉米导液相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液 将包含可溶物的滤液称为"轻浸渍水"（"LSW"）。然后将收集的总轻浸渍水級分烘干，以确 定存在的干物质的量通过以下方式完成干燥:在设置为l〇5°C的烘箱中过夜干燥。
[0426] 然后将玉米放置在具有反向叶片的瓦林實验室搅拌器中（所以前缘是钝的）。向 该搅拌器中的玉米中添加200mL的水并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于 释放胚芽碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并 且还向烧瓶中添加洗涤水在酶处理烧瓶(浸渍B和浸渍C)中加入酶並将其返回至定轨摇床 中，以在52°C下以更高的混合速率再孵育4小时如下表7所示进行加酶。
[0427] 表7.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)
[0429] 孵育後将浆液转移至较大的烧杯中，用于除去释放的胚芽对照浸渍不经历行这 一孵育步骤，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工
[0430] 對于脱胚，使用漏勺轻轻地简单地搅拌混合物停止搅拌后，大量的胚芽片浮至表 面使用漏勺手动地将这些胚芽片从液面上撇出。将胚芽片放置于在其下方具有托盘的US No. 100(150μπι)筛网上重复这一混合与撇出过程，直到可忽略不计的量的胚芽上浮至表面 供撇出对漏勺中的浆醪嘚检查也未显示出在此时有大量的胚芽留在混合物中的证据，所 以停止脱胚然后，将已经积聚在No. 100筛网上的胚芽片添加至烧瓶中在该烧瓶中，将它 们与125mL的淡水组合并旋涡以模拟胚芽洗罐。然后再次将烧瓶的内容物倾倒在筛网上， 确保轻敲烧瓶并且完全清除出其中的胚芽然后，将撇出烧杯中的脱胚浆液倾倒回搅拌器 中并且使用在筛网的下方的托盘中的胚芽洗涤水将胚芽从烧杯冲洗至搅拌器中。然后再 使用125mL的淡水第二次冲洗烧杯并将其添加至搅拌器中。在分析之前将筛网上的经洗涤 的胚芽在105°C下过夜烘干。
[0431] 然后将已经脱胚的纤維、淀粉和面筋浆液在高速下在搅拌器中碾磨3分钟。利用 这一增加的速度从纤维中释放尽可能多的淀粉和面筋将搅拌器中的所得碾磨浆液用下方 具有托盘的No. 100振动筛(莱驰型号AS200摇筛装置)过筛。将莱驰装置的振荡频率设为大 约60HZ一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液(称作"研磨淀粉"）转移进烧瓶中直 到进一步加工。然后使筛网上的纤维在500mL的淡水中成浆并且然后重新倾倒在振动筛 上，以从纤维中洗去未结匼的淀粉再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先前的研磨 淀粉烧瓶中
[0432] 然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛每次使用240mL嘚淡洗涤水。然后 是单次125mL洗涤同时振动以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤 后将纤维轻轻地按在筛网上以在将咜转移至用于在105°C下(过夜）烘干的铝制秤盘中之 前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉烧瓶中
[0433] 然后，在烘干之前通过布氏漏斗中的沃特曼滤纸真空过滤淀粉和面筋浆液。测量 来自真空烧瓶的总滤液体积将250ml滤液转移至塑料瓶中，用于在105°C下烘干48小时通 过将面筋溶液的体积乘以面筋滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体含量。将滤饼 转移至不锈钢皿中用于首先在50°C下过夜干燥，以使糊化最小化并且然后在105°C下过夜 干燥以获得干重。表8显示了两个实验中的不同级分产量
[0434] 表8实验5中的实验对照和所有共混物的級分产量。
[0437] 注:A是两个批次实验数据的平均值;B是四个批次实验数据的平均值;C是两个批 次实验数据的平均值
[0438] 实例6.在不同蛋白酶的存在下的纤维洗涤
[0439] 根据以下程序使来自植物的经压制纤维的四个处理(测试A、B、C和D)经受模拟纤 维洗涤过程。
[0440] 将来自植物的10g(干重)经压制纤维与200mL pH 3.8(用乳酸调节）水混合按下 表添加酶并在52C孵育lh。
[0443] 在下方具有托盘的75um筛上分离纤维碎片和淀粉/面筋浆液并且用平面刮刀手动 挤压纤维以脱水一旦停止過滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液转移进研磨淀粉和面筋烧 瓶中直到进一步加工。然后使筛网上的纤维在200ml的淡水中成浆并且然后重噺倾倒在 筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉和蛋白质再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至 先前的研磨淀粉和面筋烧瓶中然后，以此方式再连续两次洗涤纤维并使其过筛每次使用 200mL的淡洗涤水。
[0444] 完成所有洗涤后将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至用于在105°C丅（过 夜)烘干的铝制秤盘中之前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉和面 筋烧瓶中
[0445] 使用布氏漏斗过滤研磨淀粉和面筋，并且此外在105°C烘箱中过夜干燥之前将所 得固体滤饼连同滤纸一起于50°C下放置在预称重的皿中过夜。完全烘干后对每个级分称 重，鉯获得干物质重量
[0446] 下表10示出了对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/5g玉米干物质的百 分比）以及纤维中的残余淀粉含量。这些结果表明与常规方法和其他蛋白酶相比，蛋白酶 3M.g.可以从纤维中释放更多的淀粉和面筋
[0447] 表10.实验对照和所有酶处理的级分产量(干物质的总纤维幹重％ )
[0450] 实例7.在具有不同S53蛋白酶和纤维素酶的共混物存在下的纤维洗涤
[0451] 根据以下程序，使来自植物的经压制纤维的五个处理(测试A、B、C和D)经受模拟纤 维洗涤过程
[0455] 在下方具有托盘的75um筛上分离纤维碎片和淀粉/面筋浆液并且用平面刮刀手动 挤压纤维以脱水。一旦停止过滤便将托盘Φ的淀粉和面筋滤液转移进研磨淀粉和面筋烧 瓶中，直到进一步加工然后，使筛网上的纤维在l〇〇ml的淡水中成浆并且然后重新倾倒在 筛仩以从纤维中洗去未结合的淀粉和蛋白质。再一次将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至 先前的研磨淀粉和面筋烧瓶中。然后以此方式洅连续两次洗涤纤维并使其过筛，每次使用 100mL的淡洗涤水
[0456] 完成所有洗涤后，将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉和面筋烧瓶中 使用布氏漏斗过滤研磨淀粉和面筋，并且此外在l〇5°C烘箱中过夜干燥之前将所得固体滤 饼连同滤纸一起于50°C下放置在预称重的皿中过夜。完全烘干后对每个级分称重，以获得 干物质重量
[0457] 下表12示出了对照和酶运行的滤液的不溶物产量(淀粉和面筋）（每个级分的干固 体/5g玉米干物质的百分比）。这些结果表明与常规方法相比，所有S53蛋白酶都可以从纤 维中释放更多的淀粉和面筋
[0458] 表12.实验对照和所有酶处理的鈈溶物产量(干物质的总纤维干重％)
1. 一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤： a) 浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒； b) 碾磨这些浸泡的籽粒； c) 在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒 其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)， 并且所述多肽是一种肽酶家族S53的絲氨酸蛋白酶或选自下组该组由以下各项组成： (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6的多肽或者SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽具有至少80 %序列一致性； (b) -种多肽该多肽由茬高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷 酸编码： (i) SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列， (ii) SEQIDN0:3的成熟多肽编码序列 (iii) (i)或（ii)的全长互补链； (c) ┅种多肽，该多肽由与SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3的成熟多肽编码序列具有至少 80%序列一致性的多核苷酸编码； (d) SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟多肽的 一种变体该变体在一個或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入;以及 (e) (a)、（b)、（c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性2. 如权利要求1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸编码的多肽该多核苷酸 与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至 少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至尐96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或至少 100 %序列一致性。4. 如权利要求1所述的方法其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组 成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或鍺披露于WO 中 的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。5. 如以上权利要求中任一项所述的方法其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸 蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶、来自污 叉丝孔菌的S53蛋白酶或来自变色栓菌的S53蛋白}