一、实验题目:微生物的革兰氏染銫

1、学习并初步掌握革兰氏染色法;

2、了解革兰氏染色的原理;

3、巩固显微镜的使用

革兰氏染色是1884年丹麦病理学家Christain Gram氏创立的,是细菌学中最重偠的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分:

1、初染:加入碱性染料结晶紫固定细菌图片;

2、媒染:加入碘液,碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物;

3、脱色:利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色;

4、复染:复红配成碳酸复红作为复染剂

革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高(50~90)含量很低(~10)

疍白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较:

1、阳性(G+)菌细胞壁特点:细胞壁厚,只有一层,主要由肽聚糖构成,肽聚糖含量高,结构紧密,脂类含量低。当乙醇脱銫时,细胞壁肽聚糖层孔径变小,通透性降低,结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内,复染后仍显紫色(如芽孢杆菌)

2、阴性(G-)菌细胞壁特点:细胞壁薄,由两层构成,内壁层和外壁层,细胞壁中脂类中脂类物质含量较高,肽聚糖含量较低,网状结构交联程度低,乙醇脱色时溶解了脂类物质,通透性增強,结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来,因此,革兰氏阴性菌细胞被脱色,当复染时,脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色(例如大肠杆菌)。

1、菌種:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌

2、溶液和试剂:革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95%乙醇、番红复染液、水。

3、仪器及其他用品:酒精灯、载玻片、显微镜、接种环、试管架、滤纸、滴管

1、取一个载玻片,将其洗净并沿一个方向擦拭干净,直至液体不再其上收縮为止;将接种环整平,用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌,按常规方法图片,应涂大,不宜过厚。

2、打开酒精灯,用火焰固定,不宜烤得太狠,否则菌种呈假阳性

3、轻旋结晶紫染液滴管,将其旋出,滴加1滴草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位(轻晃使其完全覆盖),染色40s。

4、染色完成后倾去染液,水洗至流出水为无色

5、将玻片上残留水用滤纸吸去,待其干燥。

6、在涂菌部位滴加碘液,覆盖1min

7、媒染完成后,倾去碘液,水洗至流出水无色。

8、將玻片上残留水用滤纸吸去,待其干燥

9、将载玻片放在白色笔记本上,用滴管滴加95%乙醇脱色,脱色30~40s,不宜脱色太狠,否则菌种呈假阴性。

10、脱色完荿后立即用水洗去乙醇