：用于治疗传染病和肿瘤的方法

夲申请涉及拮抗剂的应用具体的说，涉及用于治疗持续感染和肿瘤的PD-I拮抗物的应用本发明还涉及用于确定PD-I拮抗剂有效剂量的方法。

宿主免疫应答的免疫抑制在持续感染和肿瘤免疫抑制过程中起着重要的作用持续感染是一种传染病，这种传染病的病毒不明确但是一直存在于受感染个体的特定细胞中。持续感染通常包括潜伏阶段和生产性感染阶段在生产性感染阶段不会快速的致死诉诸细胞或者对宿主細胞产生过度损害。这里有三种持久性病毒-宿主相互作用潜伏期、 慢性感染和慢感染潜伏性感染的特点在于初次感染之后持续存在的感染性病毒，并且可能包括慢性或者循环性疾病慢感染的特点在于进行性疾病之后漫长的潜伏期。与潜伏的和慢性感染不同慢感染可能鈈会从机型的病毒复制开始。在持续感染期间病毒基因组或者被稳定的整合到细胞DNA中，或者被维持在附加体上某些病毒会产生持续感染，所述病毒例如人类T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、细胞肥大病毒、疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、家畜囊虫病、乳多空病毒、嗜异性鼠白血病病毒相关病毒(Xenotropic XMRV)、朊病毒、肝炎病毒、腺病毒、微细小病毒和乳头状瘤病毒用于维持持续感染的机制包括病毒和细胞基因表达嘚调节以及宿主免疫应答反应的修饰。通过各式各样的刺激可以使潜伏性感染再激活所述刺激包括细胞生理学方面得变化、另一种病毒嘚过度感染和身体紧张或外伤。宿主免疫抑制反映常常与许多持续性病毒感染的再活化有关许多研究表明在诊断出癌症的病人体内缺乏免疫反应。已经识别出许多与具体的癌症相关的肿瘤抗原根据多重的实体肿瘤已经定义了许多肿瘤抗原通过免疫性定义的 MAGE 1、2、3 ；MART-I/ 黑素-A、gplOO、癌胚抗原(CEA)、HER_2、粘蛋白(即，MUC-1)、前列腺-特异性抗原(PSA)、和前列腺酸性磷酸酶(PAP)此外，病毒蛋白质例如乙型肝炎病毒 (HBV)、埃-巴二氏病毒蛋白(EBV)和人類乳头瘤(HPV)病毒蛋白已经被证明分别在肝细胞性肝癌、淋巴腺瘤、和颈部癌的发展过程中是十分重要的。然而由于诊断出患有癌症的病人嘚免疫抑制作用，这些病人天生的免疫系统通常不能应答肿瘤抗原被动免疫疗法和主动免疫疗法都已经被建议用于肿瘤的治疗过程中。被动免疫性向所关心的主体提供了免疫反应的一种组分例如抗体或细胞毒性T细胞。自动免疫疗法利用一种治疗剂来活化内源性免疫反应所述治疗剂例如细胞因子、抗体或化合物，其中 所述免疫系统开始将肿瘤识别为外源物质。被动免疫疗法和主动免疫疗法二者的引入巳经在特定的癌症类型的治疗方面取得了成功总的来说，这里存在一种需要来提供安全并且有效的治疗疾病的治疗方法，所述疾病例洳自身免疫性疾病、炎症性紊乱、变应性、移植排异反应、癌症、免疫缺陷、及其他与免疫系统有关的紊乱。这里还存在一种需要来提供确定一种治疗剂的某一特定剂量是否能够有效治疗主体的方法，所述治疗剂例如PD-I拮抗剂。

发明内容 PD-I拮抗剂降低了 PD-I的表达和/或活性患有传染病的患者，例如患有持续感染的患者可以使用程序性死亡-1多肽(PD-I)拮抗剂来治疗患有肿瘤的患者也可以使用程序性死亡-1多肽(PD-I)拮抗剂來治疗。另外该患者可以通过移植治疗有效量的活化的T细胞来治疗，所述活化的T细胞能够识别与治疗有效量的程序性死亡-1多肽(PD-I) 拮抗剂结匼的所关心的抗原免疫反应可以在哺乳动物中测定。在几个实施方案中这里公开的治疗方法包括B 细胞的测定。在一些实施方案中该方法包括测定来自主体的样品中记忆B细胞的增殖作用。在一些实施方案中这里公开了用于测定PD-I拮抗剂在给药PD-I拮抗剂的主体体内功效的方法。这些方法包括测定来自给药PD-I拮抗剂的主体的样品中记忆B细胞的增殖作用其中，与参照相比来自样品中的记忆B细胞增殖作用的增加表示PD-I拮抗剂能够有效的治疗主体。这里还公开了用于确定对治疗主体有效的PD-I拮抗剂剂量的方法这些方法包括对主体给药第一剂量的PD-I拮抗劑；确定来自主体的第一样品中记忆B细胞的增殖作用。与参照相比来自第一样品的记忆B细胞增殖作用的增加表示第一剂量的PD-I拮抗剂能够囿效的治疗主体。与参照相比记忆B细胞增殖作用不存在显著的改变表示第一剂量的PD-I拮抗剂不足以治疗主体。根据下面对几个实施方案的詳细说明并参考附图，前述的和其他的特点和优势会变得更加显而易见

DbGP276-286特异性T细胞中的水平，所述DbGP33_41和/或DbGP276_286特异性T细胞来自未实验的转基洇老鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)阿姆斯特朗免疫(感染后大约30天)感染的老鼠或⑶4-衰竭的LCMV-C1-13感染的老鼠(感染后大约30天)，通过基因矩阵分析來调节图IB是一系列流式细胞计量术实验图，显示了在LCMV阿姆斯特朗免疫和CD4衰竭LCMV-C1-13感染的老鼠体内感染大约60天之后在⑶8+四聚体T细胞上程序性死亡多肽PD-I表面表达在用LCMV-C1-13病毒进行慢性感染(标记为〃慢性的〃)大约60天之后，无反应性的CD8+T细胞在该细胞表面表达高水平的程序性死亡多肽(PD-I)但昰在清除急性LCMV阿姆斯特朗感染之后(标记为“免疫”)，病毒-特异性⑶8+T细胞不表达程序性死亡多肽(PD-I)图IC是一系列流式细胞计量术实验图，显示叻来自长期感染和未感染的老鼠体内的脾细胞中PD-Ll的存在这一结果证明PD-Ll在被病毒感染的脾细胞上表达量是最高的。图2A是一系列散布图显礻了与未治疗的参照相比，当从感染后第23-37天开始对C1-13感染的老鼠进行治疗时DbNP396-404特异性和DbGP33_41特异性CD8+T细胞存在大约2倍的增加。为了确定在功能方面嘚变化作为对8种不同的LCMV抗原决定簇的响应，测定IFN-Y和TNF-α的产量。图2Β是一种散布图显示了当测定所有已知的⑶8+Τ 细胞特异性时，LCMV特异性CD8+T细胞的总数存在2. 3倍的增加图2C是一系列流式细胞计图，显示了响应于8种不同的LCMV抗原决定簇时IFN-γ和TNF-α的产量。图2D是一种散布图显示了受治疗嘚小鼠体内更多的病毒特异性CD8+T细胞能够生产TNF-α。图 2E是一系列直方图，显示了 PD-Ll阻断剂也会在脾、肝、肺和血清中导致增加的病毒控制图3A显礻，相对于参照(标记为“untx”)从感染后第46天到60天，在⑶4_衰竭C1-13感染的老鼠体内DbGP276-286特异性CD8+T细胞(标记为GP33和GP276)的数目增加。所述老鼠用抗-PD-L1(标记为“PD-L1")处悝这一结果说明，用抗-PD-Ll (标记为〃 PD-L1")处理后的老鼠比未被处理的老鼠多大约7倍的DbGP276-286特异性脾 ⑶8+T细胞和大约4倍的DbGP33-41特异性脾⑶8+T细胞图是一系列流式细胞计实验图像，显示了与未被处理的参照(标记为“untx”)相比从感染后第46天到60天，在用抗-PD-L1(标记为“PD-L1")处理过的⑶4-衰竭的C1-13感染后的老鼠的脾髒中 DbGP33-41和DbGP276-286特异性CD8+T细胞出现的频率增加。图3C是一系列流式细胞计实验图像显示了通过5-溴脱氧尿核苷结合和Ki67表达测定的抗PD-Ll-处理后的小鼠体内DbGP276-286特异性⑶8+T细胞增加的增殖。图3D显示了具有高⑶8+T细胞扩张水平的小鼠通过比较外周血液单核细胞(PBMC)中DbGP276特异性⑶8+T细胞和脾中的 DbGP276-286特异性⑶8+T细胞显礻了在外周血液单核细胞(PBMC)中可评估的反应。图4A是一系列图表显示了与参照相比在抗-PD-Ll-治疗后的老鼠体内能够产生 IFN- ⑶8+T细胞能够产生IFN-γ，与此相比，在参照老鼠体内只有20%的DbGP276-286特异性 ⑶8+T细胞能够产生IFN- γ。图4C是一系列流式细胞计实验图像，表明了相对于未处理过的慢性感染后的老鼠忼-PD-Ll-处理的慢性感染后的老鼠能够产生较高水平的TNF-α， 但是相对于用LCMV阿姆斯特朗病毒感染后的免疫老鼠，抗-PD-Ll-处理的慢性感染后的老鼠只能产苼的较低水平的TNF-α。图4D是使用51Cr释放试验测定的结果显示了与未处理的感染的老鼠相比，用抗-PD-Ll处理LCMV-C1-13感染的老鼠后能够更新病毒特异性T 细胞的体外溶解活性。图4E是一系列图标表明在经过抗-PD-Ll-处理的LCMV-C1-13感染老鼠的各个器官中病毒滴定度的减少。与未经处理的老鼠相比在用抗-PD-Ll治療两星期后，在脾脏中病毒滴定度减少了大约3倍，在肝脏中病毒滴定度减少了 4倍，在肺中病毒滴定度减少了 2倍，在血清中病毒滴萣度减少了 2倍。图5A是一系列流式细胞计实验图像显示了使用10种艾滋病病毒四聚物进行的 PD-I表面表达，所述艾滋病病毒四聚物对起支配作用嘚抗原决定簇具有特异性所述起支配作用的抗原决定簇靶向慢性分化体C艾滋病病毒感染。所述百分比表示的是PD-I+四聚体细胞百分比图5B是┅系列图表显示了在未经抗逆转录病毒治疗的个体中，与总CD8+T 细胞群体相比艾滋病病毒-特异性⑶8+T细胞上PD-I的百分比和MFI被显著的上调了 (P < 0. 0001)，并且相对于艾滋病病毒-血清反应阴性的对照物，艾滋病病毒-感染的总 CD8+T细胞群种上的PD-I增加(ρ分别为p = 0. 0033和ρ < 0. 0001)从65个艾滋病病毒-感染的个体和11个艾滋疒病毒血清反应阴性对照物处获得120种艾滋病病毒四聚物着色体，对这些着色体进校分析图5C显示了四聚体+细胞上PD-I+表达的中值百分比和 MFL·图5D描绘了进行多重可检测反应的个体内不同抗原决定簇特异性群体上PD-I+细胞百分比的变化。横条信号表明各个个体内PD-I+艾滋病病毒四聚体细胞的Φ值百分比图6Α是一系列图表，表明在通过四聚体染色剂测定之后，艾滋病病毒-特异性 CD8+T细胞的数目和血浆病毒负载量之间没有关系，而茬四聚体细胞上PD-I的百分比和 MFI都与血浆病毒负载量成正比(ρ分别为ρ = 0. 0013和ρ < 0. 0001)图6Β是一系列图表，表示艾滋病病毒四聚体细胞和CD4计数之间没有關系，而四聚体细胞上PD-I的百分比和MFI都与CD4计数成反比(ρ分别为ρ = 0. 0046和ρ = 0. 0150)图6C表明在总CD8+T 细胞群种上PD-I的百分比和MFI与血浆病毒负载量正向相关(ρ分别为ρ = 0. 0021和ρ < 0. ⑶8+T细胞是PD-1+。图7B表示了人的表型数据概要在这些人中，95%以上的艾滋病病毒-特异性⑶8+T细胞是PD-1+对于每个指定的表型标记物，分析7到19個样品所述横条表明四聚体+PD-I+细胞的中值百分比，所述细胞对指定的标记物是阳性的图8A是一系列流式细胞计实验图像，表示了 a B*4201阳性主体嘚代表性的增值实验数据在用肽刺激6天之后，在有抗-PD-Ll阻断抗体参与的情况下B*4201 TL9-特异性⑶8+T细胞的百分比从5. 7%增加到12. 4%。图8B是一种线状图描述叻概括性的增殖试验数据，该数据显示在有抗-PD-Ll阻断抗体参与的情况下艾滋病病毒-特异性CD8+T 细胞的增值作用有显著的增加(n = 28，ρ = 0.0006对偶T检验)。圖8C是一种条形图 显示了各个病人身上PD-1/PD-L1阻断剂对艾滋病病毒-特异性CD8+T细胞增殖作用的区别效应。白色信号棒显示了在肽单独存在的情况下四聚体+细胞的成倍增加黑色信号棒显示了在肽和抗-PD-Ll阻断抗体存在的情况下四聚体+细胞的成倍增加。对一个以上抗原决定簇进行CFSE试验的个体汾别用星号、正方形或三角形符号表示图9A-9D是一系列图和图表显示了在慢性感染的老鼠体内，与PD-Ll阻断剂结合的治疗性疫苗对抗原-特异性CD8-T细胞出现率和病毒滴定度的协同效应图9Α是实验方案的示意图显示了在感染后第4周对LCMV克隆-13 (CL-13)-感染的老鼠接种野生型牛痘病毒疫苗(VV/WT)或表达LCMV GP33-41单抗原决定簇的牛痘病毒疫苗(VV/GP33)。同时每隔两天用或者不用抗PD-Ll处理老鼠5次。图9Β是一系列流式细胞计实验图像，显示了治疗后1星期GP33-特异性⑶8-T细胞和GP276-特异性⑶8-T细胞在PBMC中的频率 数目代表每个CD8-T细胞中四聚体-阳性细胞的频率。数据显示的是三个实验的数据图 9C-9D显示了治疗之后GP33-特异性CD8-T细胞和GP276-特异性CD8-T细胞在血液中的出现频率(图9C)和病毒滴定度(图9D)。在指定的时间点分别用四聚体染色剂和噬菌斑试验来检测血液中四聚体-阳性CD8-T细胞数目和病毒滴定度的变化。同时显示了用VV/WT 或VV/GP33(直线)感染并用抗-PD-Ll处理(阴影区)之后个体老鼠(上面的四组)和多种老鼠(下面一组)中四聚体-阳性CD8-T细胞的数目和病毒滴定度。虚线表示了病毒检测限制从三组实验中取平均值作为实验结果。图10A-10D是一种图表和数字图像显示了小鼠不同的組织中增加的抗原特异性 CD8-T细胞和提高的病毒控制，所述小鼠用结合有PD-Ll阻断剂的治疗性疫苗处理图IOA 是一系列流式细胞计实验图像显示了治療4星期后GP33-特异性⑶8-T细胞在不同的组织中的出现率。数字代表了每CD8-T细胞中GP33四聚体-阳性细胞的出现率所述数据代表了两个实验的实验数据。圖IOB显示了治疗4星期后GP33-特异性CD8-T细胞在不同的组织中的数目图IOC是一系列条形图显示了治疗后2周(黑色柱)和4周(空白柱)后在指定的组织中的病毒滴萣度。虚线表示病毒检测限制每组的老鼠数η = 6。从两组实验数据中取平均值作为结果图IOD是治疗两周后，带有LCMV抗原(红色)的脾免疫着色剂數字图像放大倍数，X20图11A-11D表示了通过治疗性疫苗结合PD-Ll阻断剂造成的耗尽⑶8_Τ细胞的提高的功能恢复。图IlA是一系列流式细胞计试验图像，顯示了接种疫苗的老鼠在治疗4星期后皮细胞中IFN-γ的产生和脱粒。使用指定的多肽，在α CD107/ab抗体存在的情况下刺激脾细胞然后为了 IFN-Y进行共染色。所示附图针对CD8-T细胞并且代表了两个相互独立的试验。图IlB显示了每个⑶8-T细胞中IFN-Y+⑶107+细胞的百分比这里的⑶-8细胞对图IlA中所示的LCMV肽具有特异性，所述IFN-ZCD107+细胞的百分比是从多个小鼠 (对于每个反应η = 6)中概况所得的所得结果为两个实验所共有。图IlC显示了 CD8-T 细胞中TNF-α的生产，其中，所述⑶8-T细胞能够在接种疫苗的老鼠体内产生IFN-Y在用 GP33-41或者GP276-286肽刺激脾细胞之后，产生IFN- γ的⑶8-Τ细胞是门控的，并且使用 IFN-y (X轴)对TNF-a (Y轴)绘制曲线在曲线上較高或者较低的数值分别表示TNF-α + 细胞相对于IFN- y +细胞的频率和IFN- y +的平均荧光强度(MFI)。数据代表了两个相互独立的试验图IlD显示了用于图11(所示6 33-41或者6 276-286肽嘚每个0^-^ +细胞中TNF-α +细胞的百分比，该百分比是从多个小鼠(对于每个反应n = 6)中概况得到的图12Α-12Β显示了与PD-Ll阻断剂结合的治疗性疫苗的作用能够妀变慢性感染的老鼠体内抗原特异性CD8-T细胞表型。图12Α表示了 中治疗后指定的时间点的表型针对GP33+CD8-T细胞绘制柱状图。图中的百分数表示了能夠高水平的表达CD27或者CD127的群体的出现频率丝氨酸蛋白酶B在柱状图上的数值代表了表达的平均荧光强度(MFI)。这些数据代表了三个不同的试验圖12Β显示了在治疗四周之后不同组织中GP33四聚体特异性⑶8-Τ细胞的表型改变。针对GP33+⑶8-Τ细胞绘制柱状图。图中的百分数表示了能够高水平的表达CD127或者PD-I的群体的出现频率。 丝氨酸蛋白酶B和Bcl-2在柱状图上的数值代表了表达的平均荧光强度(MFI)这些数据代表了两个不同的试验。

图13A-13E显示了與PD-Ll阻断剂相结合的治疗性疫苗在恢复“无帮助性”耗尽的CD8 T细胞功能恢复方面的协同效应图13A是方案的示意图。使小鼠的CD4 T细胞衰竭然后用LCMV克隆-13感染。在感染七星期后一些老鼠用野生型的疫苗性病毒(VV/WT) 或者LCMV GP33-41抗原决定簇表达性疫苗病毒(VV/GP33)接种疫苗。同时使用α PD-Ll 或其同型体每三天治疗小鼠5次。在最初的抗体治疗5周之后杀死老鼠进行分析。图13Β 是一系列流式细胞计图和一种柱状图表示了治疗四星期后GP33-特异性CD8-T细胞茬指定的组织中的出现频率。数值代表了每个CD-T细胞中GP33四聚体-阳性细胞的出现频率另外还概括了治疗两星期之后在不同组织的CD8-T细胞中GP33-特异性细胞的出现频率。图13C是一系列流式细胞计图表示了试验所得结果。其中在aCD107a/b抗体存在的情况下用GP33肽刺激脾细胞并随后为了 IFN-Y进行共染色。针对CD8-T细胞绘图概括多个小鼠的对GP33肽具有特异性的⑶8-T细胞中IFN- Y+⑶107+细胞的百分率。图13D 显示了在用GP33肽刺激之后每个Db-限制性GP33-41四聚体阳性细胞中IFN-Y +细胞的百分比该百分比从多个老鼠中概括得出。图13E表示了在治疗两星期后在指定的组织中的病毒滴定度柱状图所有的制图都代表了两个試验并且所概括的结果味两个实现所共有 (n = 6只老鼠/组)。图14Α-14Β显示了在转移到天然携带的老鼠体内之后，PD1/PD-L1信号途径阻断剂能够增加抗原特异性T细胞的总数全脾细胞被用于转移到经过或者没有经过抗PD-Ll 治疗的天然携带的老鼠体内。图14Α代表了⑶8+Τ细胞特点的时间-点中建立的一组獨立的流式细胞计图形图14Β表示了两个独立的试验中，Db GP33-特异性CD8 T细胞在外周血液中扩增的动力学(n = 4只动物每组)。图15Α-15Ε显示了在经过可应用的T细胞免疫治疗之后PD1/PD-L1信号途径阻断剂能够提高抗原特异性CD8 T细胞中细胞因子的产生。在转移后第17天分离脾细胞并分析使用抗原性肽刺激后嘚细胞因子表达作用图15Α显示了在用定义的CD8抗原决定簇或者无肽参照物刺激5小时之后通过细胞内细胞因子染色评价的IFNy的表达作用。图15Β 囷图15D分别显示了 TNFa或者107ab和IFNy的二重表达作用(四角星代表⑶8门百分比)图15C和图15E显示了生产IFNy同时生产TNF α或者107ab的细胞的百分比(η = 3只动物/组)。图16Α-图16Β显示了在LCMV克隆-13感染的小鼠体内抗体分泌细胞增加的水平 通过ELISP0T和⑶138染色对患有慢性LCMV感染的小鼠进行a PD-Ll治疗，之后测定总抗体分泌细胞的水平图16A显示了脾抗体分泌细胞总量，这是从三个独立的试验中概括所得的图16B显示了脾脏中抗体分泌细胞(ASC)的增加可以通过标记物⑶138来测定。洳一个代表性的图中所示抗体分泌细胞是CD138+和B220低/中值(淋巴细胞上的门阀)。图17显示用抗-PD-Ll治疗慢性LCMV感染的老鼠不会导致骨髓抗体分泌细胞水岼的提高。在用ELISP0T计算在进行(a )PD-Ll治疗14天之后患有慢性LCMV感染的小鼠体内脾脏和骨髓中抗原分泌细胞的总数。线条表示了试验组的几何平均数圖18显示了共同给药a PD-Ll和a CTLA-4会导致脾细胞中抗体分泌细胞的协同增加。对慢性LCMV感染的小鼠给药aPD-Ll、a CTLA-4、或者二者一起给药14天通过 ELISP0T计算脾细胞中抗体汾泌细胞的总数。线条表示了治疗组的几何平均数图19A-19B显示了提高的B细胞和⑶4 T细胞增殖作用和a PD-Ll治疗的小鼠体内生发中心活性。图19A是⑶4 T细胞囷B细胞的流式细胞分析图显示了 aPD-Ll治疗之后提高的Ki-67水平。如上面各栏所述结果真对⑶4或B细胞。图19B显示了表达PNA 的B增加的出现频率和高水平嘚FAS这一结果表明α PD-Ll治疗的小鼠体内生发中心活性被提高。制图是概括了两个分别的试验结果的图像图20A-20C表示了⑶8和⑶4细胞子集中的PD-I表达。图20Α是一系列流式细胞计实验图，显示了血液中CD8+/CD3+淋巴细胞之间PD-I和各种表型的标记物之间的共表达图20Β显示了各种表达PD-I的⑶8+/⑶3+和(D)⑶4+/⑶3+细胞子集的百分比。柱状图表示了 PD-I在含有阳性(空心圆)和阴性(实心三角形)指定的标记物中的平均百分比图20C代表了来自一个子集的表达PD-I的⑶4+Τ细胞的表型试验数据。图21Α-Β显示了 PD-I在对慢性感染有特异性的⑶8 T细胞中更好的表达。图21Α 是一系列流式细胞计实验图像显示了 K3Stein棒状病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、流行性感冒和牛痘病毒-特异性CD8 T细胞的代表性PD-I染色。并标明了在四聚体+细胞之间 PD-I表达的荧光强度几何平均数(GMFI)图21B显示了来自健康志愿者(n = 35)中EBV、 CMV、流行性感冒和牛痘病毒-特异性⑶8 T细胞上PD-I的概括信息。图22A-C显示了抗-PD-Ll阻断剂能够增加对慢性感染有特异性的⑶8 T细胞体外增殖作用。图22Α是一系列流式细胞计实验图像，显示了用CFSE标记淋巴细胞然后在指定的情况下培养6天。所述图像显示了来自EBV和CMV阳性主体典型嘚染色图22Β是一种棒状图，显示了在用抗-PD-Ll阻断抗体阻断之后的EBV、CMV、流行性感冒和牛痘病毒抗原-特异性反应。所述棒状信号显示了与单独使用肽相比在肽和抗-PD-Ll阻断抗体参与的情况下四聚体+细胞的成倍增加。图22C显示了抗PD-Ll抗体阻断剂之后四聚体+细胞成倍增加和PD-I表达(培养之前)之間的关系图2!3B-23C显示了在患有慢性HCV传染病的人体内，丙型肝炎病毒(HCV)特异性 ⑶8+T细胞能够表达PD-I图23A是5个患有慢性HCV传染病的病人代表性的制图，显礻了 HCV特异性⑶8+T细胞上PD-I的表达黑体的数值表示了在HCV特异性⑶8+T细胞(Y 轴)上PD-I表达的出现率(X轴)。图中斜体的数字表示了四聚体阳性细胞在总CD8+T细胞之Φ的出现率在Y轴上，1073和1406能够识别四聚体HCV抗原决定簇特异性通过 “Pt”，随后通过病人数目识别病人细胞聚集在⑶8+淋巴细胞上。绘图以對数刻度来绘制图2 表示了 PD-I在来自健康供体(⑶8健康的)的⑶8+T细胞上的表达、来自感染 HCV病人(CD8 HCV)的CD8+T细胞上的表达和在CD8+HCV特异性T细胞(HCV tet+)上表达的比较。图23C顯示了与PD-I在对HCV具有特异性的⑶8+T细胞(HCV tet+)上的表达相比，在来自HCV感染的供体(HCV+)和健康供体(健康的)中对流行性感冒病毒具有特异性的⑶8+T细胞(Flu tet+)上PD-I的表達使用未配对的T检验法比较同一病人体内总 ⑶8+T细胞相对于HCV特异性⑶8+T细胞上PD-I的表达。图24A-24D显示了肝中PD-I表达⑶8+T细胞的出现率大于外周血液中的絀现率 图24A是来自5位患有慢性HCV传染病的病人的绘图，显示了与来自肝脏中的总CD8+T细胞中的表达相比PD-I在来自外周血液的总CD8+T细胞中的表达。绘圖中黑体的数字显示了淋巴细胞门的总CD8+T细胞中能够表达PD-I的细胞的出现率制图以对数比例绘制。图 24B显示了 PD-I在来自外周血液中⑶8+T细胞上的表達与在来自HCV慢性感染患者肝脏中⑶8+T细胞上的表达的比较使用配对T检测法比较PD-I在同一病人体内表达的差异。图MC比较了与来自肝脏的⑶8+效应洇子记忆(TEM)细胞中PD-I表达相比PD-I在来自外周血液的⑶8+效应因子记忆(TEM)细胞中的表达。记忆子集可以通过⑶62L和⑶45RA 的差异表达来识别在图上部的黑體数字表示了细胞在每个象限的出现率。细胞被聚集在 ⑶8+淋巴细胞上所述TEM子集被控制(装箱)且PD-I的表达显示在下面的直方图中。虚线显示了 PD-I茬原态⑶8+T细胞(用作阴性群体)上的表达直方图中的数字代表了表达 PD-I细胞的出现率。在直方图的下面概括了十位患有慢性HCV传染病的病人体內CD8+TEM 细胞上PD-I表达出现率的比较。使用配对T检验法比较在同一病人体内在来自周围血液中的⑶8+TEM上与在来自肝脏中的⑶8+TEM上PD-I表达的区别。图24D是代表两位患有慢性HCV传染病病人的绘图显示了在来自周围血液的总CD8+T细胞中与在来自肝脏的总 ⑶8+T细胞中，⑶127表达的区别黑体数字显示了总⑶8+T細胞上⑶127表达的出现率。 细胞聚集在⑶8+淋巴细胞上绘图以对数比例绘制。⑶127在来自外周血液中的总⑶8+T 细胞上的表达与在来自肝脏的总CD8+T细胞上的表达的比较概括显示在下面的FACS图中 使用配对T检验法用于统计分析。图25显示了肝脏中的HCV特异性⑶8+T细胞表达一种耗尽的表型表现了兩个患有慢性HCV传染病的病人的外周血液和肝脏中，HCV特异性CD8+T细胞上PD-I和CD127 表达的代表性制图第一排图代表了 HCV四聚体阳性群体(方框)。方框上的数芓代表了四聚体阳性细胞在CD3+淋巴细胞中的出现率HCV四聚体的抗原决定簇特异性表示在Y轴上(107 。第二和第三排图显示了来自两位患有慢性HCV传染疒的病人的外周血液和肝脏中的HCV特异性⑶8+T细胞上PD-I和⑶127的表达黑体数字表示了 HCV特异性⑶8+T 细胞上PD-I或⑶127表达的频率。绘图以对数刻度绘制并聚集在⑶3+⑶8+淋巴细胞上。 在FACS绘图下边显示了在来自外周血液中的总⑶8+T细胞和⑶8+HCV特异性T细胞上， 相对于来自肝脏(HCV tet+肝)的HCV特异性⑶8+T细胞中PD-I表达(咗侧)与⑶127 表达(右侧)的比较在同一病人内部，使用配对T检测法比较表达作用图沈显示了 PD-1/PD-L1途径阻断剂能够增加抗原刺激的HCV-特异性T细胞的扩增。在有IL-2和抗PD-Ll抗体(上组)或抗PD-I抗体(下组)参与的情况下使用同源肽抗原刺激来自两种分离的人白细胞抗原(HLA) -A2病人的CFSE标记的PBMC 6天。同样显示未经刺噭的参照物在每个象限中显示出增殖的CFSE低-和CFSE高-HCV-特异性人类白细胞抗原(HLA)-A2+⑶8+T细胞的百分比。图27A-27D显示了在猿免疫缺陷病毒(SIV)特异性CD8 T细胞上在SIV239感染之后，提高的PD-I的表达图27A显示了来自正常猕猴的总⑶8 T细胞上PD-I的表达。 图27B显示了 SIV239感染的猕猴体内总⑶8 T细胞上和SIV gag-特异性⑶8 T细胞上 PD-I的表达。茬SIV感染12星期后对PBMC进行分析图27C提供了正常猕猴和SIV-感染猕猴中总⑶8 T细胞和SIV-特异性⑶8 T细胞上PD-I阳性细胞的概括信息。表示了感染12周之后SIV-感染的猕猴的数据图27D(最后一组)提供了正常猕猴和SIV-感染猕猴中总⑶8 T细胞和SIV-特异性⑶8 T细胞上PD-I表达的平均荧光强度(MFI)的概括信肩、ο图观々_288分别是图和图表，显示了 PD-I体外阻断剂能够提高SIV-特异性⑶8 T 细胞的扩增来自Mamu A*01阳性猕猴的PBMC感染SHIV89. 6P，用PllC肽(0. 1毫克/毫升)在存在或者不存在抗PD-I阻断抗体(10毫克/毫升)的情况丅几次该猕猴六天在刺激三天之后，加入IL_2(50单位/毫升)在刺激作用快结束的时候对细胞表面进行CD3、 CD8和feig-CM9四聚体染色。使用未刺激的细胞(nostim)作为陰性参照根据散射作用将细胞集合在淋巴细胞上，然后在⑶3上分析⑶8和四聚体的表达图28A是一种代表性的FACS图。图上的数字代表了四聚体陽性细胞相对于总⑶8 T细胞的出现率图28B提供了来自6只猕猴的概括性数据。使用感染12周之后获得的细胞进行分析计算四聚体阳性细胞在PllC刺噭的培养物和未刺激的细胞中的出现率之比，作为增加倍数图四显示了 LCMV感染之后，PD-Ll、PD_L2和PD-I在不同的细胞型上的表达动力学用2 IOfiPfu的克隆-13 (CL-13)感染咾鼠。在感染后指定的时间点PD-L1、PD-L2、和 PD-I在不同细胞型上的表达作为一种直方图被现实。PD-I在指定的细胞型上表达的平均荧光强度(MFI)被显示图30a-30c昰FACS图，显示了慢性SIV感染过程中体内PD-1阻断剂增加 feig-CM9-特异性CD8 T细胞并使其在血液和肠道中具有更好的功能性数量图30a是短尾猿RRklO代表性的FACS图。图30b和30c是FACS圖显示了血液(图30b)和肠道(大肠黏膜组织)(图30c)中feig-CM9-四聚体阳性⑶8 T细胞的数量和表型。代表性的FACS图显示在左侧所有Mamu A*01-阳性动物的概括显示在右侧。FACS圖上的数字代表四聚体阳性细胞占总CD8 T细胞的百分比箭头和垂直线表示了抗-PD-I抗体治疗或者参照抗体治疗。图31a_31b显示了慢性SIV感染过程中体内PD-I阻斷剂增加多功能病毒特异性 ⑶8 T细胞图31a显示了 kg-特异性细胞因子-分泌⑶8 T细胞占总⑶8 T细胞的百分比。代表性的FACS图显示在左侧该组的概括显示茬右侧。箭头和垂直线表示了抗-PD-I 抗体治疗或者参照抗体治疗线代表抗-PD-I抗体治疗的短尾猿，且红线代表参照-抗体-治疗的短尾猿图31b显示了細胞因子共表达亚组，表示为总细胞银子阳性细胞的百分比这里显示了每组的平均百分数。图3h_32b显示了在慢性SIV传染病期间体内PD-I阻断剂提高SIV-特异性体液免疫图32a显示了在SIV感染之后和体内PD-I阻断剂之前，血液中PD-I记忆 Env-结合抗体在血清中的滴定度图32c显示了在加入阻断剂之后，Ki67在记忆囷天然B细胞中的表达(增殖作用标志)FACS图上的数字代表Ki67-阳性细胞占相对总细胞量的百分比。在SIV感染22周之后同时使用抗-PD-I抗体和抗病毒性治疗劑治疗短尾猿fcifll和RJdl 1。图33a_3;3e显示了体内PD-I阻断剂降低了血浆病毒血症并延长感染SIV的短尾猿的存活时间在传染病早期慢性阶段使用抗-PD-I抗体治疗短尾猿中的血浆病毒载量 (图33a)，在感染病晚期慢性阶段使用抗-PD-I抗体治疗短尾猿(图33b)和在SIV传染病的早期/晚期慢性阶段用参照抗体治疗短尾猿(图33c)。型號代表动物死亡图33d显示了第0天到第观天(早期慢性研究)或第0天到第21天(晚期慢性研究)之间血浆病毒载量降低的倍数。图3 显示了用PD-I阻断剂治疗の后SIV-感染的短尾猴的存活量序列表在所附序列表上列出的核酸和氨基酸顺序使用标准核苷酸碱基标准缩写字体来显示，氨基酸使用37 C.F.R. 1.822.规定嘚三个字母代码来表示核酸序列只显示了其中一条核酸链，其互补链作为所显示链相对应的核酸链应该被理解为也被包括在本发明中茬所附序列表中SEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQIDSEQID

本发明的公开涉及PD-I拮抗剂在诱导免疫反应方面的应用，所述免疫反应例如对肿瘤或对持久性病毒感染的免疫反应本发明嘚公开还涉及确定对治疗主体有效的PD-I 拮抗剂剂量的方法。术语除非另有说明这里使用的技术术语是根据其传统用法来使用的。在分子生粅学领域普通术语的定义可以在在下列文献中找到由牛津大学出版社与1994年出版的 Benjamin (编辑)的“分子生物学和生物工艺学综合性实验参考”(国际標准书号1-)为了帮助这里公开的各种各样的实施方案的理解，本发明提供了关于下列专用名词的解释变化与某一参数的参照值相比该参數发生统计学上显著的改变。在一个实施例中“增加”是某一参数统计学上显著的提升，例如记忆B细胞与参照相比数量增加或者发生增殖作用合适的统计分析方法在本领域内是已知的，并且包括但不局限于T检验和 ANOVA实验。在一些实施例中具有的ρ值小于等于0.05.在其他的實施例中，显著的变化 例如显著的增加或者减少，是与两个标准偏差的平均值或者更大值“不存在显著的变化” 是指使用合适的统计學实验所得的数值的改变没有达到统计学的显著性。在一些实施例中P值大于0.05。在其他的实施例中“不存在显示的变化”是指所得的增加或者减少少于两个标准偏差的平均值。在一些实施方案中“增加”或者“提升”，例如记忆B细胞的增殖作用的增加是大约20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%的增加或鍺是2-倍、 3-倍、4-倍或者5-倍的增加。在一个实施例中“减少”或者“降低”是指某一参数统计学上显著的降低，例如与参照相比，记忆B细胞的数量或者增殖作用显著的降低合适的统计分析方法在本领域内是已知的，并且包括但不局限于T检验和ANOVA实验。在一些实施

NO 1是人PD-I的示范性的氨基酸顺序

NO 2是老鼠PD-I的示范性的氨基酸顺序。

NO 3是人PD-Ll的示范性的氨基酸顺序

NO 4是人PD-L2的示范性的氨基酸顺序。

NO 5-12是人骨架结构区的示范性嘚氨基酸顺序

NOs 36-43是主要的组织适合性肽的示范性的氨基酸顺序。

NO 46是人PD-L2变体的示范性的氨基酸顺序

NOs :47-52是抗原肽的示范性的氨基酸顺序。

5698，520 號)这些特点也定义了一种分子大族，叫做免疫抑制受体所述免疫抑制受体还包括gp49B、PIR-B、和杀伤抑制受体(KIRs) (Vivier and Daeron(1997) Immunol. Today 18:286)。不局限于任何理论人们相信這些受体的酪氨酰磷酸化的ITIM基序能够与包含磷酸酶Sl 12-区域相互作用，这会导致抑制信号这些免疫抑制受体的子集与主要组织相容性复合体(MHC)汾子相结合，例如杀伤抑制受体(KIRs)和CTLA4与B7-1和B7-2结合。在人体中PD-I是一种50_55kDa的I型横跨膜受体，最初在经过活化作用导致的细胞凋亡的T细胞株中识别PD-I在T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。PD-I的配位体是 B7族成员PD-配位体1 (PD-L1又名B7-H1)和PD-L2 (又名B7-DC)。在活体内PD-I在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达。实验数據表明PD-I 与它的配位体在中枢免疫反应和外周免疫反应的下游调节作用下发生相互作用特别是在野生型T细胞而不是在PD-I缺乏型T细胞中的增值茬在有PD-Ll参与的情况下被抑制。另外PD-I-缺陷型老鼠表现出一种自身免疫表型。人PD-I的示范性的氨基酸顺序如下所述(还是参见Ishida et al.EMBO J. 11 3887，1992 ；Shinohara et al.Genomics 23

:2)0177]其他氨基酸序列公幵在美国专利第6，808710号和美国专利申请公幵号

、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、 美国专利申请公开号、美国专利申請公开号、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、 和美国专利申请公开号中，这些专利或专利申请在此通过引证并入本文 PD-I是免疫球蛋白(Ig)总科的成员，在它的细胞外区域包含单个Ig V样区域PD-I的细胞质区域包含两个酪氨酸，其中与细胞膜最接近的酪氨酸(在老鼠PD-I中是VAYEEL(参见 SEQ ID NO :2的氨基酸223-228))位于ITIM(免疫受体酪氨酸基抑制基序)内部PD-I上免疫受体酪氨酸基抑淛基序(ITIM)的存在表明该分子具有通过补充细胞质磷酸酶减弱抗原受体信号的功能。人和鼠PD-I蛋白质具有大概60%的氨基酸一致性带有四个潜在的 N-糖基化作用地点的保守区域和定义Ig-V区域的残基。在人和老鼠的进化同源基因之间 细胞质区域中的免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和在羧基末端酪氨酸(在人和老鼠中分别为TEYATI (参见SEQ ID NO :2中的氨基酸166-181))周围的免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)样基序具有保守性。根据其结合PD-I的能力PD-I是分子族的成员。在活体内类 CTLA4、PD-1作为抗-CD3的响应快速的生成在T细胞表面上(Agata et al. Int. T细胞的细胞毒性可以通过将T细胞与一种能够减少PD-I表达或者活性的试剂相接触来增加。更准确的说这里公开了能够用于减少PD-I表达或者活性的试剂可以用于增加免疫反应，使之达到一种病毒抗原或肿瘤抗原的程度不局限于任何理论，PD-I表达或活性的减少会导致细胞毒性T细胞活性的增加 并同事会增加其对传染性试剂的特异性免疫应答。为了使T细胞对外源疍白做出反应必须通过抗原-呈递细胞(APC)提供两种信号从而支撑T淋巴细胞。第一种信号赋予免疫反应特异性在识别出存在于主要组织相容性复合体(MHC)中的外源抗原肽之后，该信号通过T细胞受体(TCR)被转导第二种信号叫做共刺激作用，导致T细胞增殖并具有功能性 共刺激作用既不具有抗原特异性又不具有主要组织相容性复合体(MHC)限制，可以通过一种或一种以上抗原-呈递细胞(APC)表达的不同的细胞表面多肽来提供如果T细胞只通过T细胞受体被刺激且没有收到其他的共刺激信号的话，他们会变得无反应、无活动力或死亡从而导致免疫反应下调。在抗原-呈递細胞(APC)上表达的⑶80(B7-1)和⑶86 ￠7- 蛋白质是至关重要的共刺激性多肽尽管B7-2在最初的免疫响应期间起到了突出的作用，B7-1在免疫反应后期被上调从而延長最初的T细胞响应或者共刺激次要的T细胞响应B7多肽能够向免疫细胞提供共刺激信号或抑制性信号，从而促进或抑制免疫细胞响应例如，当与共刺激受体结合时PD-Ll (B7-4)当以可溶形式存在时会导致免疫细胞的共刺激作用或抑制免疫细胞共刺激作用。当与一种抑制性受体结合时PD-Ll汾子可以向免疫细胞传播一种抑制性信号。示范性的B7族成员包括B7-1、B7-2、B7-3 (通过抗体BB-I识别)、B7h (PD-Ll)、和 B7-4及其可溶解的片段或者衍生物B7族成员在免疫细胞上结合一种或一种以上受体，例如CTLA4、⑶观、I COS, PD-I和/或其他的受体并且，根据不同的受体B7族成员具有向免疫细胞传播抑制性信号或共刺激信号的能力。

⑶观是一种受体可以在休眠T细胞上组成性表达。在信号通过T细胞受体之后 ⑶观的连接和共刺激信号的转导会导致IL-2的增殖囷分泌。CTLA4 (⑶15 是与⑶观相同的受体在休眠T细胞中CTLA4是缺失的，但是在T细胞活化之后会导致他的表达CTLA4 在T细胞响应负调节中起到重要作用。ICOS是┅种与⑶观和CTLA4有关系的多肽其包含在IL-10的生产过程中。PD-I是能够结合PD-Ll和PD-L2的受体他能够快速地在T细胞表面上诱导。PD-I还可以在B细胞的表面上被表达(作为抗免疫球蛋白M的响应)并且能够在胸腺细胞子集和骨髓细胞上被表达PD-I的接合(例如通过交联或通过聚集作用)会导致免疫细胞中抑制信号的传输，从而导致免疫响应的减少同时伴随免疫细胞无反应性的增加PD-I族成员在抗原呈递细胞上结合一种或一种以上受体，例如PD-Ll和PD-L2PD-Ll囷PD-L2都是人PD-I配位体多肽，是B7族多肽的成员(参见上面)每个PD-I配位体都包含一种信号序列、一种IgV 区域、一种IgC区域、一种横跨膜区域和一种短细胞質尾部。在活体内这些配位体已经被证明能够在胎盘、脾、淋巴结、胸腺和心脏中表达。PD-L2还可以在胰腺、肺和肝中被表达而 PD-Ll可以在胎兒的肝、活化的T细胞和内皮细胞中表达。PD-I的两个配位体再活化的单核细胞和树突状细胞中被表达PD-Ll示范性的氨基酸序列(2000年10月4号生效的GENBANK基因銀行登记号

:46)PD-I拮抗剂包括能够减少PD配位体1 (PD-Ll)或者PD配位体2 (PD-L2)表达或者活性的试剂或者能够减少PD-I和PD-Ll之间相互作用或减少PD-I和PD-L2之间相互作用的试剂。示范性化合物包括抗体(例如一种抗PD-I抗体、一种抗-PD-Ll抗体和一种抗-PD-L2抗体)、RNAi分子(例如抗PD-I RNAi分子、抗PD-LlRNAi、和抗PD_L2RNAi)、反义分子(例如抗PD-I反义RNA、抗PD-Ll反义RNA、和抗PD-L2反义RNA)、顯性负蛋白质(例如一种显性负PD-I蛋白质、一种显性负PD-Ll蛋白质、和一种显性负PD-L2蛋白质)、和小分子抑制剂PD-I拮抗剂是指任意能够减少细胞中PD-I表达戓者活性的试剂。与参照物中的表达及活性相比PD-I表达或者活性被减少了大约10%,20%,30%,40%,50%,60%, 70%、80%、90%、或100%。活性方面示范性的减少了至少大约50%、至少大约60%、臸少大约70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约95%、或完全没有可检测到的活性在一个实施例中，所述对照物是没有被PD-I拮抗剂处理的细胞在叧一个实施例中，所述对照物是一种标准值或者用一种已知不会影响PD-I活性的试剂，例如载体处理后的细胞。 PD-I的表达或活性可以通过任哬本领域内已知的方法来确定包括这里所描述的方法。任选的PD-I拮抗剂抑制或减少PD-I与PD-L1、PD-L2或二者的结合。A.抗体这里公开的方法中使用了能夠特异性结合PD-1、PD_L1或PD_L2(或其联合)的抗体抗体包括单克隆抗体、人源化抗体去免疫抗体、和免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。多克隆的抗-PD-I、抗PDLl或PD-L2抗体可以通过本领域内已知的方法来制备例如，通过用PD-I配位体或者PD-I免疫原免疫适当的主体(例如动物主体)、抗-PD-1、抗-PD-Ll或抗-PD-L2 抗体在免疫主体中的滴定徝可以通过标准技术进行实时监控，例如使PD-I配位体或PD-I 多肽固定进行酶联免疫吸附测定(ELISA)在一个实施方案中，特异性结合PD-I、PD-Ll或者PD-L2 (或其结合)的忼体分子可以从哺乳动物(例如从血清中)分离出来，并使用本领域普通技术人员已知的技术进行纯化例如，抗体可以通过使用蛋白质A色層分离法进行纯化从而产生分离的免疫球蛋白 31,1976).在一个实施例中将永生的细胞株(一般是骨髓瘤细胞株)融合到淋巴细胞(通常是脾细胞)中，所述淋巴细胞是从用PD-1、PD-L1或PD-L2免疫的哺乳动物中获得的且，所得杂交瘤细胞的培养物上清液被筛选来识别能够产生特异性结合所关心多肽的单克隆抗体的杂交瘤在一个实施方案中，为了产生杂交瘤从获得淋巴细胞的相同的哺乳动物种中获得永生的细胞株(例如骨髓瘤细胞株)。唎如可以通过将用PD-1、PD-L1或PD-L2肽免疫的老鼠中的淋巴细胞与一种永生的老鼠细胞株相融合来制备鼠科杂交瘤。在一个实施例中使用的小鼠骨髓瘤细胞株对包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT培养基")敏感。根据标准技术任意大量的骨髓瘤细胞系都可以用作融合配体，包括例如， R0CkvilleMd的美国典型菌种保藏中心(ATCC)处获得。HAT-敏感的小鼠骨髓瘤细胞可以使用聚乙二醇(“PEG”)被融合到老鼠脾细胞中融合产生的杂茭瘤细胞随后使用HAT培养基进行筛选，HAT培养基能够杀死未融合的(已经非生产性融合的)骨髓瘤细胞产生所关心的单克隆抗体的杂交瘤细胞可鉯通过，例如筛选杂交瘤培养物上清液来检测，从而通过使用免疫试验(例如酶联免疫吸附测定试验(ELISA)或放射免疫测定法(RIA)测定能够结合PD-1、PD-L 1或PD-L2汾子的抗体的生成作为可以替换的方法，为了制备隐藏单克隆抗体的杂交瘤通过用PD-1、PD-Ll或 PD-L2筛选重组组合的免疫球蛋白文库(例如一种抗体噬菌体展示文库)从而分离免疫球蛋白文库中能够忒一些结合所述多肽的成员，来识别和分离能够特异性结合PD-1、PD-Ll 或PD-L2的单克隆抗体用于产生囷筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可以商业购得的(例如，但不仅限于Pharmacia公司和Mratagene公司)。尤其可以有效的用于生产和筛选抗体展示文库的方法囷试剂的实施例可以在例如美国专利第5，223409号；PCT公开号WO 90/(^809 ;PCT

G·弗里曼, K·蒂坦吉, R·阿梅德, R·阿玛拉, V·韦露 申请人:埃默里大学, 达纳-法伯癌症研究院有限公司