Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers | Protocol (Translated to Danish)
Automatic Translation
This translation into Danish was automatically generated through Google Translate. |
&JoVE Medicine
Vaskulaer genoverf?rsel fra Metallic Stent overflader ved hjaelp adenovirusvektorerne t?jret gennem hydrolyserbare Tvaerbindere
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania
Enter your email to receive a free trial:
Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!
Date Published: 8/12/2014, ; doi:
Keywords: , , , , , , , , ,
Fishbein, I., Forbes, S. P., Adamo, R. F., Chorny, M., Levy, R. J., Alferiev, I. S. Vascular Gene Transfer from Metallic Stent Surfaces Using Adenoviral Vectors Tethered through Hydrolysable Cross-linkers. J. Vis. Exp. (90), e51653, doi:10. (2014).
In-stent restenose er en stor komplikation af stent-baserede revaskulariseringsprocedurer udbredte at genetablere blodstr?mmen gennem kritisk indsnaevret segmenter af koronare og perifere arterier. Endovaskulaere stenter stand tunable frigivelse af gener med anti-restenotiske aktivitet kan udg?re en alternativ strategi for ?jeblikket anvendte stof-stents. For at opn? klinisk oversaettelsen skal gen-stents udviser forudsigelige kinetikker af stent-immobiliserede genvektor frigivelse og stedspecifik transduktion af vaskulatur, og samtidig undg? en overdreven inflammatorisk reaktion typisk er forbundet med de polymere belaegninger, der anvendes til fysisk indfangning af vektoren. Dette papir beskriver en detaljeret metode til coatless opbinding af adenovirale genvektorer til stenter baseret p? en reversibel binding af adenoviruspartikler polyallylamin bisphosphonat (PABT) -modificeret rustfrit st?l overflade via hydrolyserbare krydsbindere (HC). En familie afbifunktionelt (amin- og thiol-reaktive) HC med en gennemsnitlig t 1/2 af den i kaede esterhydrolyse spaender mellem 5 og 50 dage blev anvendt til at forbinde vektor med stenten. Vektoren immobilisering procedure udf?res typisk inden for 9 timer, og best?r af flere trin: 1) inkubation af metalpr?ver i en vandig opl?sning af PABT (4 timer); 2) afbeskyttelse af thiolgrupper installeret i PABT med tris (2-carboxyethyl) phosphin (20 min); 3) udvidelse af thiolreaktiv kapacitet metaloverfladen ved omsaetning af pr?verne med polyethylenimin derivatiseret med pyridyldithiogrupper (PDT) grupper (2 timer); 4) omdannelse af PDT grupper thioler med dithiothreitol (10 min); 5) aendring af adenovirusser med HC (1 time); 6) oprensning af modificerede adenovirale partikler med st?r-s?jlekromatografi (15 min) og 7) immobilisering af thiolreaktive adenovirale partikler p? thiolerede st?loverflade (1 time). Denne teknik har bred potentiel anvendelighed over stenter,ved at lette overflade manipulation af bioprotetiske enheder for at forbedre deres biokompatibilitet gennem substratet-gentilf?rsel til cellerne graenseflade implanterede fremmed materiale.
Effektiviteten af genterapi som en terapeutisk modalitet er haemmet af den d?rlig m?lretning kapacitet genterapivektorer 1,2. Manglen p? ordentlig m?lretning resulterer i sub-terapeutiske niveauer af transgen ekspression p? m?let placering og f?rer til en bred formidling af vektorer til ikke-m?lorganer 3, herunder de ansvarlige for montering af immunreaktioner mod b?de vektor og kodet terapeutisk produkt 4, 5. Et potentielt middel til at udligne promiskuitet af transduktion og fremme m?lretning er at indf?re genvektorer p? det ?nskede sted i en form, der udelukker deres frie udbredelse via blod og lymfe. Typisk s?danne bestraebelser stole p? en lokalt injicerbare afgivelsessystemer best?ende af enten virale eller ikke-virale vektorer blandet med fibrin, collagen eller hyaluronsyre hydrogelmatricer 6-10, der er i stand til transient sustaining genvektorer p? injektionsstedet ved fysisk at indeslutte them i et polymert netvaerk.
Et andet generelt accepteret paradigme for lokaliseret genterapi udnytter immobilisering af genvektorer p? overfladen af implanterede proteser 11,12. Permanente medicinske implantater (endovaskulaere, bronkier, urologiske og gastrointestinale stents, pacemakere, kunstige led, kirurgiske og gynaekologiske masker mv.) Anvendes ?rligt i snesevis af millioner af patienter 13. Mens generelt effektive, disse enheder er tilb?jelige til at komplikationer, der ikke er tilstraekkeligt kontrolleret for de nuvaerende laegepraksis 14-17. Implanterbare proteseindretninger praesentere en unik mulighed for at fungere som proxy platforme for lokaliseret genterapi behandling. Fra farmakokinetisk synspunkt overflade derivatisering af medicinske implantater med relativt lave doser input af genvektorer resulterer i at n? begge h?je lokale koncentrationer af genvektorer p? implantatet / vaevsgraensefladen og langsommere kinetik their elimination fra denne placering. Som f?lge af langvarig ophold og forbedret optagelse af den m?lrettede cellepopulation, vektor immobilisering minimerer spredning af genet vektor. S?ledes utilsigtet inokulation af ikke-m?lvaev reduceres.
Overflade opbinde genvektorer p? implanterbare biomaterialer (som ogs? benaevnes som substrat-gentilf?rsel eller fast fase genlevering) er blevet gennemf?rt i celle kultur og dyrefors?g ved hjaelp af b?de specifikke (antigen-antistof 18-20, avidin- biotin 21,22) og ikke-specifik 23-26 (charge, van der Waals-interaktioner). Den kovalente binding af vektorer til overfladen af den implanterede enhed er tidligere blevet betragtet som ikke-funktionelle, eftersom overdrevent staerke bindinger med overfladen hinder vektor internalisering af m?lceller. For nylig blev det p?vist, at denne begraensning kan overvindes ved anvendelse af spontant hydrolyserbar krydsbinder anvendes som tethendes mellem den modificerede metaloverflade stenten og capsidproteiner af adenovirusvektoren 27,28. Endvidere kan vektoren frigivelseshastighed og tidsforl?bet af transgenekspression in vitro og in vivo, moduleres med anvendelse af hydrolyserbare tvaerbindere udviser forskellige kinetik hydrolyse 28.
Naervaerende dokument indeholder en detaljeret protokol for reversibel kovalent binding af adenovirusvektorer til aktiveret metaloverflade og indf?rer en nyttig fors?gsopstilling for at studere efterf?lgende transduktion begivenheder in vitro i dyrkede glatte muskulatur og endotelceller og in vivo i rotter carotis model af stent angioplastik . Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
1. Fremstilling af Cy3-maerket adenovirus for frigivelse Eksperimenter
Suspender 2 x 10 12 partikler af Ad tomme (ca. 2 x 10 11 infekti?se enheder) i 650 pi af carbonat / bicarbonatbuffer (CBB,
Opl?s indholdet af 1 haetteglas (0,2 mg) af amin-reaktive fluorescerende farvestof (Cy3 (NHS) 2) i 1 ml CBB til en endelig koncentration p? 0,2 mg / ml.
Tilsaet 100 ul af farveopl?sning til virussuspension, vortex i 5 sekunder og inkuberes i 1 time ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm).
AEkvilibrer en 20 ml Sepharose 6B-s?jle med PBS. Tilf?j 750 pi Cy3-maerket Ad suspensionen dr?bevis til centrum af gellejet.
Efter virussuspension gennemsyrer harpiks, tilsaettes 5 ml PBS. Kassér eluatet.
Tilsaet 0,5 ml PBS, og eluatet opsamles i en maerket glasbeholder. Gentag dette trin 10x indsamle alt ti 0,5 ml fraktioner.
Assay the indsamlede fraktioner ved spektrofotometri (260 og 280 nm) for viral DNA-indhold.
Pool fraktionerne indeholdende mere end 10% af den samlede (summen af F1 til F10) optisk densitet (OD) ved 260 nm. Bemaerk: Typisk fraktionerne F3, F4, F5 og F6 samles og blandes.
Re-assay blandede poolede fraktioner ved spektrofotometri (260 og 280 nm), og analyse ved fluorometri (550 ex / 570 em nm) i virus-DNA-indhold og Cy3-maerkede capsid protein. Bemaerk: En Cy3 (NHS) 2 kalibreringskurven daekker 10 -9 -10 -13 mol / L-serien er forberedt og fluorimetrisk analyseret p? den samme plade som de samlede fraktioner.
Beregn maerkede virusudbytte og maerkning taethed. Antag, at 1,19 x 10 12 viruspartikler / ml svarer til 1
enhed til en 1 cm vejlaengde 29. Brug formlen: Udbytte = [(OD 260 nm /1.19)*10 12 * V / input Ad bel?b] * 100, hvor OD 260 nm er den optiske density af poolede formulering ved 260 nm, og V er rumfanget af den poolede formulering (ml) til at beregne Ad udvindingsudbytte (%). Brug formlen: Maerkning Densitet = C * 6,02 * 10 23 / (OD 260 nm /1.19)*10 12, hvor C er Cy3 koncentration af de faelles formulering (mol / ml) og OD 260 nm er den optiske taethed af de faelles formulering p? 260 nm for at beregne gennemsnittet Cy3 maerkning taethed. BEMAERK: En typisk genvinding af maerket virus er& 70% af den tilf?rte dosis. Maerkningen densitet er 600-800 fluoroforen molekyler pr enkelt viruspartikel.
Alikvot Cy3-maerket Ad tom i mindre portioner (typisk 5 x 10 11 partikler) er egnede til de enkelte frigivelse eksperimenter. BEMAERK: Aktuel protokol specificerer brugen af Cy3-maerket Annonce udelukkende i frigivelsen eksperiment. Alle transduktion unders?gelser udf?res med umaerkede vektorer.
2. Aktivering af metalpr?ver
Vask af rustfrit st?l mesh diske eller rustfrit st?l stenter hinanden i isopropanol (5 min x 2) og chloroform (5 min x 2) ved 55 ° C med rystning (100 rpm). Opl?sningsmidlet fjernes.
Opvarm pr?verne i 30 minutter ved 200 ° C.
Opl?s polyallylamin bisphosphonat med installerede latente thiolgrupper (PABT 27,28,30) i vand (1-2% w / v) ved 72 ° C med rystning (100 rpm). Justér pH til 4,5-5 med KHCO3.
Inkuber metalpr?ver i PABT opl?sning 2-4 timer ved 72 ° C med omrystning (100-200 rpm). BEMAERK: Proceduren kan saettes p? pause p? dette punkt. Pr?verne er stabile i 3 dage ved 4 ° C.
Skyl pr?verne tre gange med dobbelt destilleret vand (DDW).
Bring pr?verne tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, 15 mg / ml i 0,1 M eddikesyre-buffer) i 15 minutter ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm).
Skyl 5x i afgasset DDW.
Expose pr?verne til 2% polyethylenimin med installerede pyridyldithiogrupper (PEI <sub& PDT 27,28,30) i afgasset DDW i en argonatmosfaere i 2 timer ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm). BEMAERK: Proceduren kan saettes p? pause p? dette punkt. Pr?verne er stabile i 2 uger ved 4 ° C.
Skyl pr?verne tre gange med DDW.
Expose pr?verne til 10 mg / ml ditiotreitol / DDW at konvertere pyridyldithiogrupper til thioler.
Skyl 5x igen i afgasset DDW.
3. Adenovirus Aktivering og Metaloverflade Immobilization
Suspender 5 x 10 11 partikler af enten Ad eGFP eller Ad Luc (ca. 5 x 10 10 infekti?se enheder) i 487,5 til 495 ul karbonat / bikarbonat buffer (CBB, pH 9,3). Bemaerk: Ved unders?gelserne frigivelse, skal du bruge 5 x 10 11 af Cy3 maerket Ad tomme partikler (justere lydstyrken til 487,5 til 495 pi med CBB).
Opl?s HC med varierende hydrolysehastigheder 28 [(hurtigt (t 1/2 = 5 d), mellemliggende (t 1 /2 = 12 d) og langsomt (t 1/2 = 50 d) HC, dvs RHC IHC eller SHC, figur 1] eller ikke-hydrolyserbare tvaerbinder (NHC), sulfo-LC-SPDP i CBB 20 mM.
Tilf?je Umiddelbart 5-12.5 pi krydsbinder l?sning p? virussuspension til et samlet volumen p? 500 pi (200-500 pM slutkoncentration af tvaerbindingsmiddel), vortex, og der inkuberes i 1 time ved 28 ° C med rystning (100- 200 rpm).
AEkvilibrer en 20 ml Sepharose 6B-s?jle med afgasset 5 mM EDTA / PBS (EPBD). Tilsaettes dr?bevis 500 pi tvaerbinder-modificerede Ad suspensionen til centrum af harpiks-bed&#39;en.
Der tilsaettes 5 ml afgasset EPBD. Kassér eluatet.
Tilsaet 0,5 ml afgasset EPBD og eluatet opsamles i en maerket glasbeholder. Gentag dette trin 10 gange indsamler alt ti 0,5 ml fraktioner.
Bestem OD af de indsamlede fraktioner ved hjaelp af spektrofotometri ved 260 og 280 nm og konvertere OD til virustitere (1,19 x 10 12 / ml Correrer til 1 OD) 29.
Pool fraktionerne indeholdende& 10% af den eluerede virus (Bemaerk: Typisk fraktionerne F3-F6). Gentag spektrofotometrisk titer assay for poolede suspension.
Overf?rsel viral suspensionen til haetteglasset med de aktiverede metalpr?ver (som pr 2.11). Inkuber i en argonatmosfaere i 1 time ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm). Bemaerk: Ad-t?jret metalpr?ver opn?et i dette trin er yderligere anvendt i de efterf?lgende frigivelse og transduktion eksperimenter beskrevet i protokollen afsnittene 5-7.
4. Kvantificering af Overflade-associeret Ad Illustrationer ved
Forbered masker formuleret med overfladeimmobiliseret Ad eGFP t?jret via NHC, SHC, IHC og RHC (n = 3 for hver type) som beskrevet i afsnit 2 og 3.
Brug et QIAamp DNA Micro kit til at isolere viralt DNA. Placer maskerne individuelt i 1,5 ml plastr?r indeholdende 200 pi blanding af 180 pi ATL Buffer og 20 pi proteinase K (begge fra saettet). Tilf?j kendt maengde Ad eGFP partikler (som standarder for kalibreringskurven) ind i separate r?r, der indeholder den samme blanding. Inkuber ved 56 ° C natten over uden omrystning.
Tilsaet 200 pi af AL-buffer (fra saettet), vortexes, tilsaettes 200 ul 100% ethanol, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
Overf?r blandingen fra hvert r?r p? en individuel MinElite s?jle (fra saettet) og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min. Skyl mesh-holdige r?r med 180 ul frisk ALT buffer, tilsaettes p? de respektive s?jler og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min. Kassér eluaterne.
Tilsaet 500 pi AW1 puffer (fra saettet) i kolonnerne og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min. Kassér eluaterne.
Tilsaet 500 pi AW2 puffer (fra saettet) i kolonnerne og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min.
Kassér eluaterne.
Centrifugering ved 14.000 rpm i yderligere 3 minutter until s?jlerne er helt t?rre. Kassér eluaterne.
Der tilsaettes 50 ul af MilliQ-kvalitet vand i kolonnerne. Spin ved 14.000 rpm i 5 minutter. Collect 50 pi af eluatet fra hver kolonne i individuelle opsamlingsr?r (fra saettet).
Forbered PCR Master Mix l?sning ved at kombinere ganger af f?lgende (12,5 ul Power Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 pi 10 pM eGFP senseprimer [5&#39;ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 &#39;], 0,63 pi 10 uM eGFP anti-sense-primer [5&#39;-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 &#39;], 6,3 ul af MilliQ-kvalitet vand). Formere disse maengder med antallet af planlagte reaktioner inklusive &ingen DNA& kontroller.
Belastning 5 ul Ad eGFP DNA (fra trin 4.8) og 20 ul PCR Master Mix til tredobbelte br?nde i en MicroAmpTM Optical 96 br?nde Reaktion plade. Forsegle skiltet med MicroAmpTM optisk selvklaebende film. Spin pladen ved 1.000 rpm i 1 min for at fjerne luftbobler. Pladen anbringes i beholderen i en 7500 Real-Time PCR motor. I hovedmenuen i 7500 System SDS Software (v1.4 eller h?jere) skal du vaelge &Opret nyt eksperiment&. Klik p? &Naeste&. I &Ny eksperiment guiden& skaerm vaelge Sybr Green fra en rulle-down menuen og klik p? &Tilf?j&. Klik p? &Naeste& for at f? et layout af pladen. Fremhaev alle br?nde, der skal analyseres, skal du vaelge Sybr Green. Fremhaev fortl?bende ingen DNA-kontrol br?nde, Ad eGFP DNA standarder og ubekendte, og markere dem ved hjaelp af de respektive betegnelser fra scroll-down menuen.
Skift til fanen instrumentet. Vaelg &tilf?j dissociation fase&, aendre s?vel volumen fra standard 50 ul til 25 ul. Klik p? Start.
Analyser PCR-resultater ved hjaelp af efter kontrol QC sammendrag for afvigere og andre uregelmaessigheder.
5. Frigivelse Kinetik af hydrolyserbare tvaerbindingsmiddel-t?jret Vector Partikler fra Model St?lnet
Vask masken pr?verne derivatiseret med Cy3-maerket annonce via RHC, IHC, SHC og NHC (som pr 3.9) i 1% BSA / PBS (1 time x 3) med rystning (100-200 rpm).
Brug sterile fin pincet placere maskerne i individuelle br?nde i en 96-br?nds plade udfyldt med 200 pi elueringspuffer (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
Tag fluorescerende billeder af en central del af hver maske. Optag indstillingerne for mikroskop og CCD-kameraet bruges til billedbehandling erhvervelse.
Analysere pladen fluorimetrisk (550 ex / 570 em) i godt scanning med maksimal reduktion. Brug br?ndene med ikke-derivatiserede masker som baggrund kontrol.
Inkubér pladen ved 37 ° C med omrystning (50 rpm).
P? forudbestemte tidspunkter (1-30 dage interval) aspirere elueringsbufferen uden at forstyrre de masker og der tilsaettes 200 ul frisk elueringsbuffer. Gentag trin 4,3-4,5 efter udskiftning af buffer.
6. transduktion af kulturperler Cells af Mesh-immobiliserede Ad-vektorer
Vask Ad eGFP - eller Ad Luc -derivatized masker tre gange med sterilt PBS i 5 minutter med rystning (100 rpm).
Brug fine steril pincet fjerne mesh diske én efter én og individuelt placere dem i br?ndene p? en 96-br?nds plade med celletypen af interesse i log-fase af vaekst.
Inkubér cellerne i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
Brug det respektive ikke-terminale endpoint assay (fluorescerende mikroskopi, fluorometri til eGFP eller bioluminescens billeddannelse til luciferase) for at fastsl? omfanget og den geografiske fordeling af genekspression i br?ndene.
Eventuelt til erstatning medium til PBS ?ge f?lsomheden af fluorometriassay assay (485/535 nm), s?fremt der forventes lav eGFP udtryk. Bemaerk: Hvis et fluorometer er udstyret med godt scan kapacitet, laese pladen i et godt scanning for at vurdere den rumlige fordeling af eGFP-udtrykkende celler i br?ndene. Exchange PBS til medium efter endt fluorometri.
Billede de transducerede celler i br?ndene med Ad eGFP -eluting masker (b?de underliggende og randomr?der den mesh) under anvendelse af FITC-filter saet. Tag repraesentative billeder p? 40-200X forst?rrelse. Optag de n?jagtige indstillinger af fluorescerende mikroskop og CCD kamera, der anvendes til erhvervelse af billeder.
Der tilsaettes 5 ul luciferin lager i PBS (10 mg / ml) direkte til br?nde med Ad Luc -eluting masker til en slutkoncentration p? 500 ug / ml og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 minutter forud for bioluminescens billeddannelse . Aspirer medier og erstatte med luciferin-frie medier efter billedbehandling.
Gentag endpoint analyser p? forudbestemte tidspunkter (op til 2 uger) til at studere kinetik reporter genekspression efter substrat-medieret genoverf?rsel.
7. Validering af konserverede transduktionsevne ved udskydelse af tid Points
Forbered Ad eGFP derivatized maskerne med RHC, IHC, SHC og NHC til vektor tethering (som pr 2,1-2,11 og 3,1-3,9) og individuelt placere maskerne i br?ndene i en 96-br?nds plade med 60-80% sammenflydende bovine aortaendotelceller (BAEC ).
Analyser transduktion af dyrket BAEC med mesh-immobiliserede Ad eGFP ved 1 og 2 dage efter mesh placering ved hjaelp af fluorescensmikroskopi og fluorometri (som pr 6,4-6,5).
48 timer efter p?begyndelsen af transduktion vaske mesh-holdige br?nde med PBS to gange.
Tilsaet 200 pi af 0,25%
/ EDTA til hver br?nd og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C med rystning (100 rpm). Vask 3 x med PBS.
Brug fluorescerende mikroskopi og fluorometri at fastsl? fuldstaendig fjernelse af alle eGFP-positive celler i forbindelse med maskerne.
Fr? frisk passeret BAEC i br?ndene med delvist frigivet masker p? en 60-80% indledende podningstaethed (2-2,7 x 10 4 celler / br?nd).
Inkubér pladen ved 37 ° C og 5% CO <sub& 2 for forudbestemte perioder (1-10 dage) forud for vurdering af &nye& transduktion begivenheder ved fluorescerende mikroskopi og fluorometri.
8. Ad-eluering Stent Deployment i Rat carotis Model of Stent Angioplasti
Alle dyr, der er beskrevet i denne protokol i overensstemmelse med f?derale regler for brugen af fors?gsdyr, og blev godkendt af IACUC af B?rnenes Hospital i Philadelphia. At holde sig til aseptiske kirurgiske betingelser alle instrumenter er autoklave steriliseret. For at sikre kontinuerlig sterilitet en perle sterilisator er ansat mellem brug af de instrumenter i op til fem p? hinanden f?lgende dyr.
Forbered Ad Luc -eluting stenter if?lge 2,1-2,11 og 3,1-3,9. Opbevar virus-derivatiserede stenter i sterilt PBS ved 4 ° C ikke laengere end 24 timer f?r brug.
Bed?ver Sprague-Dawley rotter (400-450 g) med IP-injektion af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg). DeTermine anaestesidybden ved pote knivspids respons og muskeltonus. P?f?r oftalmologiske dyrlaege salve for at forhindre t?rhed af hornhinden og sclera. Bemaerk: Det inhalationsanaestesi med 4% og 2% isofluran (1 l / min) til induktion og vedligeholdelse af anaestesi, henholdsvis er mulig, men hindrer fri adgang til halsregionen af dyret og derfor anbefales ikke til en uerfaren bruger.
Revurdere anaestesidybden ved t? knivspids. Shave og aseptisk prep hals og ?vre bryst-regionen. Indgives antibiotikum (cefazolin, 20 mg / kg, IM) analgetikum (meloxicam, 0,5 mg / kg, SC) og saltvand (10 ml / kg, SC). Selvkaterisation halevenen med en 24 G kateter og administrere heparin (200 IE / IV). Bemaerk: En dosis p? 10 mg / kg (IM) enrofloxacin (Baytril) kan anvendes i stedet for cefazolin. Undg? anvendelse af antibiotika, der mangler vaesentlig aktivitet mod Gram-positive bakterier. 10-15 mg / kg carprofen (Rimadyl), kan anvendes i stedet for meloxicam som et forebyggende analgetisk. Narkotiske analgetika (e.eks. b?r morfin, buprenorphin) undg?s p? grund af deres ?ndedraet-deprimerende egenskaber.
Udf?r en midtlinjeincision gennem huden og halsen fascia. Brug stump dissektion teknikker til at isolere den venstre ydre carotidarterie. Tie-off den ydre halspuls?re p? det mest distale ubureaukratiske site. P?f?r en glidende midlertidig ligatur til oprindelsen af det indre halspuls?re.
Lav en 2 mm arteriotomi snit i venstre ydre carotidarterie.
Saet et 2-French Fogarty kateter i arteria carotis communis gennem snittet i den ydre halspuls?re. Pump spidsen af kateteret med saltvand og videregive 3x fra aortabuen til carotis forgreningen med henblik p? at denude endotelet.
Skub et stykke slange (1.04 mm OD, 0,99 mm indvendig diameter) over Fogarty kateteret og ind i den faelles halspuls?re. Traek Fogarty kateter.
Mount og krympe en annonce Luc -derivatized stent over ballonen af en 1,5mm angioplastik kateter. Indsaet stenten gennem teflonr?r og fremme det i midtersektionen af den faelles halspuls?re. Undg? gnide stenten mod r?ret eller karvaeggen.
Implementer stenten ved 12 atm i 30 sek og traekke angioplastik kateter.
Tie-off ydre carotidarterie proximalt til arteriotomistedet og slip midlertidig ligatur p? den indre halspuls?re.
Reparer operationss?r i lag med at k?re 4.0 Vicryl sutur og haefte huden.
Recover dyret p? en opvarmning pad indtil ambulant og vende tilbage til sin isolerede bur. Mens ingen tegn p? smerte eller ubehag typisk udstillet af postoperative dyr ud over den f?rste 12 timer efter indgrebet, overveje en udvidelse af meloxicam behandling (0,5 mg / kg, SC dagligt) i 72 timer.
9. Bioluminescens Imaging af Arteriel Gene Expression
P? forudbestemte tidspunkter (1 dag - 3uger interval) efter gen sk stent indsaettelse i den faelles halspuls?re, bed?ver rotten anvendes isofluran inhalation anaestesi (2-4% isofluran i oxygen).
Fjern de kirurgiske haefteklammer, aseptisk forberede sitet og gen?bne det operationss?r. Ved stump dissektion, re-f? adgang til den venstre, faelles carotidarterie og adskille den fra vagusnerven og tilst?dende bindevaev.
Klarg?r en blanding af 50 mg / ml Luciferin i PBS og 25% Pluronic F-127 i PBS (1: 4 v / v) og gemme den p? is. Bemaerk: Denne formulering viser sig som en viskos opl?sning ved 4 ° C og straks bliver til gel ved kontakt med vaev ved 37 ° C.
P?f?r 200 pi af en k?let Luciferin / Pluronic blanding direkte til den eksponerede del af den faelles carotidarterie og kontrollere gel soliditet.
Placer dyret i liggende position i imaging kammer IVIS-Spektrum-apparatet og opretholde isofluran anaestesi med en ansigtsmaske.
I acquisitip? kontrolpanelet vindue (Living Image, version 4.2 eller h?jere) vaelge position &B& (6,6 cm kamera til at g?re indsigelse afstand) og udsmidningen faktor &medium& fra dropdown menuerne titlen &synsfelt& og &Binning& hhv. Indtast &2,5 cm& i emne h?jde kassen. Vaelg &Min& som en enhed af tid i &eksponeringstid& boksen, og vaelg en numerisk vaerdi p? &2&.
Tre minutter efter anvendelse af Luciferin / Pluronic gel, start billede erhvervelse ved at klikke p? knappen &Acquire& p? skaermen. BEMAERK: Billede erhvervelse tid kan variere fra 1 til 6 minutter, afhaengigt af den forventede signalstyrke.
Efter modtagelsen af billedet, vaskes gelen af med saltvand og dup periarterial rum med steril gaze og bomuld applikatorer.
Lukke s?ret med Vicryl sutur og haefte huden.
Recover dyret og vende tilbage til sit bur. Gentag billeddannelse p? senere time punkter for at studere tidsforl?bet af arteriel ekspression fremkaldt af stent-immobiliseret Ad-vektorer.
Alternativt udf?re billedbehandling efter en systemisk administration af luciferin. Anesthetize og prep dyret pr 9.1-9.2. Selvkaterisation halevenen med en 24 G kateter og sikker kateter med haefteplaster.
Der fremstilles en opl?sning af luciferin i PBS (50 mg / ml) og injicere 1 ml af opl?sningen gennem katetret over en 10 sek interval. Et min efter injektion startbillede k?b pr 9,7-9,8. Bemaerk: En hurtigere injektion sats (&10 sek) kan fremprovokere anfald og respirationsstop. Dyret skal aflives, hvis anfald eller respirationsstop forekomme under billedbehandling.
F?lg trin 9.10. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Vektor frigivelsesfors?g
Deling af adenovirusvektorer til overfladen af implantater, herunder interventionelle enheder s?som endovaskulaere stenter, tilnaermer vektoren sygdomsstedet delvis overfl?digg?re manglende vektorer fysiske m?lretning. For at vaere i stand til at opn? terapeutiske effekter via transduktion af m?lvaevet skal vektoren frigives fra overfladen (figur 2). Anvendelse af hydrolyserbare tvaerbindere Hypotesen var at muligg?re en) effektiv fastg?relse af vektorer til polybisphosphonate modificerede, thiol installeret metalimplantater og 2) sustained release medieres ved hydrolyse af tvaerbinderen.
Antallet af genomiske kopier af Ad eGFP vektor forbundet med mesh diske ved udgangen af derivatisering procedure bestemmes ved PCR af virus-DNA med eGFP-specifikke primere (figur 3). Afhaengigt afspecifik tvaerbinder anvendes, maengden af bundet Ad vektor b?r variere mellem 3,5 x 10 9 og 5.7 x 10 9 partikler / mesh. Dette bel?b er i rimelig korrespondance med den estimerede maksimale kapacitet (2,5 x 10 9) af en enkelt maskest?rrelse skive med et samlet areal p? 0,25 cm2 til at rumme 100 nm Ad-partikler i et monolag arrangement. Da grundbel?bet af Ad-vektor p? trin af krydsbinder modifikation er 5 x 10 11 partikler er kun ~ 1% af den modificerede vektor sidst immobiliseret p? PABT / PEI PDT -derivatized rustfrit st?l overflade.
B?de antallet af in-kaede ester hydrolyse og antallet af links mellem vektor og biomateriale forventes at p?virke de overordnede kinetik af Ad vektor frig?relse fra overfladen.
For at lette frigivelsen eksperimenter adenoviruspartikler kan prae-maerket med Cy3 fluorophor (protokol afsnit 1) forud for krydsbinder aendringer udvition og overflade immobilisering (protokol afsnit 3). Faldet i overflade-associeret fluorescens over tid vurderes samtidig ved fluorometri (figur 4A) og fluorescensmikroskopi (Figur 4B), kan derefter anvendes som en indirekte metode til overv?gning vektor frigivelse i fysiologisk buffer. Ad-vektorer knyttet gennem RHC og IHC bindinger b?r udvise betydeligt hurtigere frigivelse i sammenligning med deres SHC- og NHC-vedhaeftede modstykker. I det givne eksempel blev en 45% og et tab 39% af overflade-associeret vektor observeret med RHC og IHC-t?jret vektor ved dag 30, henholdsvis mens mindre end 20% af t?jret vektor blev observeret til at blive frigivet i SHC og NHC -immobilized pr?ver (figur 4a).
Derudover Ad-vektorer immobiliseres ved anvendelse af forskellige koncentrationer af den samme HC og dermed formodentlig have forskellige antal t?jr mellem vektoren og metalsubstratet skal haveuens kinetik for vektor frigivelse. Faktisk vektor aendringen med 0,1 mM RHC resulterede i signifikant hurtigere frigivelse satser end observeret for vektor immobiliseret med 0,5 mM RHC (figur 4A). Fluorescens mikroskopi data (figur 4B) korrelerer godt med den kvantitative vektor frigivelse analyse fluorometri-baseret, hvilket viser en hurtigere og mere dybtg?ende fald p? overfladen-associeret fluorescens med mesh pr?ver formuleret ved hjaelp IHC-, RHC- og isaer lav koncentrationslejre RHC-forankrede vektorer i sammenligning med deres NHC- og SHC-t?jret modstykker.
In vitro Transduktion med Mesh immobiliseret Ad-vektorer
Ved at vaere kompatibel med b?de kvantitativt udtryk analyse (fluorometri) og rumlige observationer (fluorescensmikroskopi), Ad eGFP er den foretrukne reporter vektor til at overv?ge transduktion i SMC og endotelcellekulturer behandlet med b?de gratis og mesh-immobiliserede Ad-vektorer. Kemisk modifikation af Ad capsidet med RHC (figur 5) samt med andre krydsbindere (ikke vist) i koncentrationer p? over 75 uM vaesentlig grad svaekker transduktion effektivitet af vektor ikke-immobiliserede in vitro, sandsynligvis p? grund af maskering og omkonfigurere fiber knop domaener udnyttes af Ad for binding til cellerne gennem Coxsackie-Adenovirus-receptorer (bil). Imidlertid rolle knop-CAR interaktioner er mindre afg?rende for transduktion med substrat immobiliseret vektor eftersom vektoren tilbageholdes i naerheden af m?lrettede celler ved tethering til substrat. I cellekultur fors?g uanset HC type mesh-associerede Ad-vektorer er konsekvent i stand til rumligt begraense transduktion begivenheder til celler beliggende inden for 300-500 um fra mesh graenser (6a og 6c). Typisk peak niveauer af transgene udtryk opn?s 3-5 dage efter anbringelsen af Ad eGFP -loaded masker ind i SMC (figur 6A og 6B) eller BAEC (figur 6C og 6D) kulturer. P? samme vektor belastning, peak eGFP ekspressionsniveauer ?ges i f?lgende raekkef?lge: NHC-, SHC-, IHC- og RHC-t?jret vektor, hvilket afspejler forskellene i deres respektive frigivelseskinetik profiler (Figur 4). Endvidere observeres mere holdbare transgen ekspression i celler behandlet med IHC formulerede masker i sammenligning med celler behandlet med RHC formulerede modstykker (figur 6D).
Det udnyttede celledyrkningssystem praesenterer en bekvem opsaetning for unders?gelse af forsinkede transduktion begivenheder fremkaldt af vektor partikler frigivet fra metaloverfladen p? eller senere end 48 timer efter mesh placering. I denne ans?gning, efter at bestemme eGFP udtryk ved fluorometry og fluorescens mikroskopi ved 48 timer efter p?begyndelsen af transduktion er BAEC trypsiniseres og suget ud af br?ndene uden at forstyrre maskerne. Frisk passeret ikke-transduceret BAEC derefter igen forgyldt p? de delvist frigivet masker. &Nye& transduktion begivenheder for?rsaget af viruspartikler frigives fra masken luftfartsselskab efter 2 dages tidspunktet vurderes derefter ved fluorescens mikroskopi og fluorometri (7A og 7B). Robust eGFP udtryk demonstrerer den karakteristiske rumlige begraensning til en maske locale typisk observeret i disse &nye& kulturer (Figur 7), bekraefter en velbevaret transduktionsevne af mesh-bundne Ad-vektorer, selv efter 48 timers udsaettelse for at fuldf?re cellekulturmedium ved 37 ° C.
In vivo-unders?gelser
For at unders?ge de potentielle virkninger i forbindelse med uSE forskellige HC p? arteriel transduktion, dyr implanteret med Ad Luc -eluting stenter tilberedt med RHC-, IHC-, SHC- og NHC-modificerede vektor undergik bioluminiscerende billeddannelse 1 og 8 dage efter stent indsaettelse (figur 8). Den billeddannelse blev udf?rt efter lokal perivaskulaer indgift af luciferin (2 mg) co-formuleret med Pluronic gel. Denne formulering er en viskos vaeske, n?r afk?let p? is, men underg?r ?jeblikkelig faseovergang til gel, n?r de bringes i kontakt med vaev ved 37 ° C. Indledende fors?g (ikke vist) viste, at perivaskulaer levering af luciferin resulterer i mere stabile og reproducerbare luminescens-signaler i Ad Luc -transduced karvaev sammenlignet med systemisk (intraperitoneal eller intraven?s) luciferin administration.
Hvis virus t?jring til stenten og stentudvidelsesindretning kirurgi var teknisk lyd, et veldefineret signal, der svarer til den stentbehandlede segment afrotte carotidarterie udsendes og registreres. En dag efter stent implantering dyr behandlet med RHC formulerede Ad Luc stents udviser typisk den h?jeste luminescens signal efterfulgt af de rotter, der modtog IHC- og SHC- formulerede stenter (figur 8A og 8B). Der observeres ingen maerkbar signal i gruppen af rotter implanteret med stents fremstillet under anvendelse NHC-t?jret Ad Luc, hvilket understreger betydningen af uhindret vektor frigivelse fra stenten for effektiv transduktion af karvaev (figur 8A og 8B). Ved dag 8 var den gennemsnitlige intensitet af
ekspression med RHC formulerede stenter dr?ber adskillige gange, mens det ?ger 1,4-og 1,8-fold med IHC- og SHC formulerede stenter, henholdsvis (figur 8A og 8B). Dette resultat er i overensstemmelse med hypotesen om mere holdbare vaskulaer transduktion med gen-stents udviser en langsommere p?r?rendeETICS af vektor frigivelse fra stenten overfladen.
Figur 1. Strukturelle formler af krydsbindere (NHC, SHC, IHC og RHC), der anvendes i hele de beskrevne unders?gelser (modificeret med tilladelse 28).
Figur 2. En ordning, der repraesenterer Ad vektor tethering til en PABT / PEI PDT -modificeret rustfrit st?l overflade via en HC og efterf?lgende frigivelse af vektoren ved krydsbinder hydrolyse (modificeret med tilladelse 28).
Figur 3. PCR-baseret Quantverifikationsprogrammet Ad eGFP immobiliseret via tvaerbindingsmiddel tethering p? overfladen af PABT / PEI PDT -modificeret rustfrit st?l masker. De rustfrie masker blev formuleret med Ad eGFP immobiliseret via RHC IHC, SHC eller NHC (n = 3 for hver tilstand ). Efter proteinase K-behandling, blev viralt DNA elueret og oprenset ved anvendelse MinElute kolonner. Amplifikation af viral DNA under anvendelse eGFP-specifikke primere blev udf?rt i en 7500 Real-Time PCR motor og blev p?vist med Sybr Green. Data normalisering var baseret p? en kalibreringskurve fremstillet med en kendt maengde af ikke-immobiliserede Ad eGFP (modificeret med tilladelse 28).
Figur 4. frigivelseskinetikken af Ad-vektor t?jret til metalsubstrater med HC. Stainless st?l masker blev derivatiseret med ~ 2 x 10 9 Cy3-maerkede Ad partikler knyttet til PABT / PEI PDT -modificeret overflade efter modifikation med 500 uM NHC, SHC, IHC, RHC og 100 um RHC (betegnet som RHC-L). Frigivelsen af fluorescensmaerket Ad-partikler blev unders?gt ved de angivne tidspunkter ved (A) godt-scan fluorometri ved 550/570 nm og (B) fluorescerende mikroskopi (rhodaminfilteret saet, original forst?rrelse 200X). Fluorometri Resultaterne er praesenteret som middelvaerdi ± SEM, n = 8-10; p &0,001 for alle sammenligninger mellem NHC og SHC vs IHC, RHC og RHC-L-grupper blev bestemt ved ANOVA med en post-hoc Tukey-test (modificeret med tilladelse 28).
Figur 5. Transduktion effektiviteten af ikke-immobiliserede Ad eGFP f?lgende aendring med RHC. Rotte embryonale aorta-afledte SMC (A10 linje) blev transduceret ved en MOI p? 1,000 med enten umodificeret Ad eGFP eller vektor modificeret med RHC som angivet. En reporter ekspression blev bestemt fluorometrisk (485/535 nm) 48 timer efter transduktion (modificeret med tilladelse 27).
Figur 6. transduktion af dyrket SMC og BAEC med Ad vektor immobiliseret til rustfrit st?l masker med HC. Masker blev derivatiseret med ~ 2 x 10 9 Ad eGFP partikler vedhaeftede via NHC, SHC, IHC, og RHC. Masker blev derefter anbragt individuelt oven af sub-sammenflydende A10 (A, B) og BAEC (C, D) monolag. Transduktion (udtrykt som eGFP ekspressionsniveauer) af celler behandlet med Ad vektor-forankrede masker blev vurderet ved fluorescence mikroskopi (A, C, FITC-filter saet, original forst?rrelse 100X) og godt-scan fluorometri (B, D). Fluorometriassay Resultaterne er praesenteret som betyder ± SEM, n = 4 (modificeret med tilladelse 28).
Figur 7. Transduktion kompetence substrat immobiliseret Ad-vektorer ved forsinkede tidspunkter. Ad eGFP blev immobiliseret p? st?l masker gennem NHC, SHC, IHC eller RHC bindsler. Maskerne blev placeret p? subkonfluente baec monolag. To dage efter placering blev BAEC trypsineret og fjernes uden at forstyrre maskerne. Ny, ikke-transducerede BAEC blev derefter podet over masker. AdeGFP transduktion kompetence blev m?lt ved eGFP ekspression under anvendelse af fluorescensmikroskopi (A FITC- oprindelige forst?rrelse 100X) og fluorometri (B). M?linger blev taget ved angivne dage blev repraesentative billeder, brugt og fluorometriassay resultater er middel ± SEM, n = 4 (aendret fra med tilladelse 28).
Figur 8. transduktionseffektivitet af stent-immobiliseret Ad Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 partikler) blev t?jret til endovaskulaere stenter via NHC, SHC, IHC eller RHC (n = 3-4 for alle grupper). Transduktionseffektivitet af Ad Luc &/ Sub& elueres fra stenter blev m?lt ved bioluminescens imaging (IVIS Spectrum) 1 og 8 dage efter stent indsaettelse (A), og plottet ved hjaelp af en logaritmisk skala (B) (modificeret fra med tilladelse 28).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Den praesenterede protokol beskriver en operationel metode til substrat gentilf?rsel opn?s gennem reversibel fastg?relse af adenovirusvektorer at coatless overflader i rustfrit st?l. Mens der er udviklet til det specifikke form?l at stent-baserede genterapi af vaskulaer restenose, denne teknik har meget bredere anvendelser inden for omr?derne biomaterialer, biomedicinske implantater og genterapi.
Selvom praesenteret unders?gelser udelukkende har udnyttet rustfrit st?l som et prototypisk metalsubstrat PABT binder andre metallegeringer, s?som kobolt / krom og nitinol med sammenlignelig affinitet (ikke offentliggjort). Den indiscriminant vekselvirkning PABT med metaller udvider markant antallet af potentielle biomedicinske anvendelser for denne teknologi 31. Endvidere er anvendelsen af HC-t?jret genvektorer, omend kraeve andre metoder thiol montering p? materialeoverfladen, er muligt med andre typer af biomaterialer. Indholdsproduktion && Mens Ad genvektorer opn? solid transduktion i mange humane celletyper og vaev, deres kliniske betydning er begraenset af staerke inflammatoriske og immunreaktioner af Adenoviridae 4. Til dette form?l forlaenget (4 m?neder) arteriel udtryk med gen stents formuleret ved hjaelp af HC modifikation af luciferase-udtrykkende adenoassocierede virale vektorer er for nylig blevet vist (ikke offentliggjort).
Metodikken er robust. Sm? afvigelser fra den vigtigste protokol generelt ikke f?re til betydelige aendringer i genekspression in vitro og in vivo. Alligevel blev flere kritiske sp?rgsm?l, der kan p?virke resultaterne identificeret.
F?rst, som navnet antyder, hydrolyserbare tvaerbindere er spaltelig ved reaktion med vand p? grund af hydrolyse af i-kaede-ester. Desuden amin-reaktive del, N -sulfosuccinimidyl er hydrolyserbar samt. Krydskoblere skal opbevares under en argonatmosfaere ved -20 ° C for at bevare deres aktivitet. Af de samme grunde, efter forberedelsen opl?sninger af HC (protokol afsnit 3.2) fortsaetter straks med tilsaetning af HC l?sninger p? virus preps.
For det andet er thiolgrupper, der dannes p? metaloverfladen i adskillige mellemliggende trin af praesenterede bioconjugation sekvens hurtigt oxideres af luftens ilt. For at forhindre dette, skal de s?rbare metalpr?ver nedsaenket i afgasset vand p? alle tidspunkter.
For det tredje er en perfekt tilpasning af indgreb med bunden af br?nden kraeves for en vellykket transduktion. Du m? ikke b?je mesh diske under h?ndteringen.
For det fjerde, undg? overdreven gnidning af gen-stents mod teflon kappe og karvaeggen under stentindsaetning at forhindre l?sner af overflade-associerede Ad-vektorer.
Kovalent binding af genvektor til overfladen af implanterbare biomaterials har en tilsyneladende fordel af en bedre kontrol over vektor frigivelseskinetik end realiseres med ikke-kovalent t?jring af vektorerne. Ved fastsaettelsen af gen-levering fra stent platform fleste unders?gelser indberette fuldstaendige frigivelse af virale og ikke-virale vektorer indenfor 1-7 dage efter stent indsaettelse 32-34. P? den anden side, Ad vektor immobilisering via HC demonstreret frigivelse af kun 20-45% af vektoren belastning i den f?rste m?ned (figur 4A og 4B). Desuden er en delvis modulering af frigivelse og transduktion kinetik er opn?eligt med brug af forskellige HC udviser uens hydrolysesituationer kinetik eller ved at variere koncentrationen af HC ansat til virus overflade modifikation. Derudover en samtidig co-modifikation af vektoren med forskellige tvaerbindingsmolekyler, men ikke udforsket i naervaerende unders?gelse, giver endnu en mulighed for finjustering vektor frigivelse og transduktion. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Catalog Number
316 stainless steel mesh disks
Electon Microscopy Sciences
Generic 304-grade stainless steel stents
custom order
University of Pennsylvania Vector Core
AD-5-PV0504
University of Pennsylvania Vector Core
AD-5-PV1028
University of Pennsylvania Vector Core
GE Healthcare
Sepharose 6B
Sigma-Aldrich
6B100-500ML
UV 96-well plates
Fluorometry 96-well plates
Cell culture 96-well plates
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)
Pierce Thermo Scientific
Dithiothreitol (DTT)
Pierce Thermo Scientific
sulfo-LC-SPDP
Pierce Thermo Scientific
Spectrophotometer
Molecular Devices&
SpectraMax 190
Spectrofluorometer
Molecular Devices
SpectraMax Gemini EM
Orbital shaker incubator
Horizontal airflow oven
Centra-CL2 centrifuge&
International Equipment Company
Digital vortex mixerer
Fisher Thermo Scientific
02-215-370
Eclipse TE300 fluorescence microscope
DC 500 CCD camera
7500 Real-Time PCR system
Applied Biosystems
not available
IVIS Spectrum bioluminescence station
Perkins-Elmer
not available
EDTA dipotassium salt
Sigma-Aldrich
Bovine serum albumin fraction V (BSA)
Fisher Thermo Scientific
Sigma-Aldrich
Dumont forceps
Fine Science Tools
A10 cell line&
Bovine aortic endothelial cells
Luciferin, potassium salt
Gold Biotechnology
Pluronic F-127
Sigma-Aldrich
PBS without calcium and magnesium
Fetal bovine serum
Gemini Bio-Products
Penicillin/Streptomycin solution
DMEM, high glucose
Corning cellgro
0.25% Trypsin/EDTA
QIAamp DNA micro kit
Power Sybr Green PCR Master Mix
Applied Biosystems
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate
Applied Biosystems
MicroAmp Optical Adhesive Film
Applied Biosystems
Cephazolin&
not available
Loxicom (Meloxicam)
not available
Heparin sodium
APP Pharmaceuticals
not available
Ketavet (Ketamine)
not available
Anased (Xylazine)&
not available
Forane (Isoflurane)&
not available
Curved Moria iris forceps
Fine Science tools
Curved extra-fine Graefe forceps
Fine Science Tools
Dumont #5 forceps
Fine Science Tools
Vannas spring scissors
Fine Science Tools
Fine scissors - ToughCut
Fine Science Tools
Surgical scissors
Fine Science Tools
Vicryl suture (5-0)
Suture thread (4/0 silk)&
Fine Science Tools
Michel suture clips
Fine Science Tools
Wound dilator (Lancaster eye specula)
KLS Martin
Hot bead sterilizer
Fine Science Tools
Michel suture clip applicator
Fine Science Tools
Insyte Autoguard 24 G IV catheter
Beckton-Dickinson
2F Fogarty catheter
Edwards Lifesciences
Teflon tubing
PTA catheter
custom order
Gauze pads
Kendall Healthcare
Cotton applicators
Solon Manufacturing
10 ml syringe (Luer-Lok)
Beckton-Dickinson
1 ml syringe (Luer-Lok)
Beckton-Dickinson
Clippers with #40 blade
Transpore surgical tape
Puralube vet ointment
Pharmaderm
not available
Boeckle, S., Wagner, E.
AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T.
Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
Campos, S. K., Barry, M. A.
Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
Bangari, D. S., Mittal, S. K.
Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
Barry, M. A., et al.
Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
De Laporte, L., Shea, L. D.
Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H.
Mol Pharm. 7,
Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D.
J Control Release. 157, 80-85 (2012).
Lei, Y., et al.
Biomaterials. 31,
Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T.
J Control Release. 153, 255-261 (2011).
Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D.
Mol Ther. 19,
Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D.
Gene Ther. 17,
Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q.
Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S.
Biomaterials. 26,
Tang, L., Eaton, J. W.
Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
Zimmerli, W., Sendi, P.
Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
Fishbein, I., et al.
Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
Levy, R. J., et al.
Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
Ma, G., et al.
Int J Nanomedicine. 8,
Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H.
J Gene Med. 10,
Jang, J. H., et al.
Gene Ther. 17,
Bengali, Z., Shea, L. D.
MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
Holmes, C. A., Tabrizian, M.
ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D.
Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
Wang, C. H., Pun, S. H.
Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
Fishbein, I., et al.
Circulation. 117,
Fishbein, I., et al.
Biomaterials. 34,
Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C.
J. Virol. 70,
Forbes, S. P., et al.
Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J.
Acta Biomater. 8,
Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M.
Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
Egashira, K., et al.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27,
Ohtani, K., et al.
Circulation. 114,
You must be signed in to post a comment. Please
Related Videos
Table of Contents - Journal Issues
Publish in JoVE
Subscribe to JoVE
Sharing JoVE
Copyright &#xa9; JoVE . All Rights Reserved. |
| ISSN XMyJoVE Corp. | One Alewife Center, Suite 200 | Cambridge, MA | 02140 | tel.}