作者：赵贵英
来源：科学时报
发布时间： 23:23:31
抗体药物迎来崭新时代
单克隆抗体问世：免疫学的革命
人和动物都有免疫系统，当外来的病菌、病毒(抗原)入侵，机体就会产生抗体，抗原抗体结合，就把病菌消灭掉了，保护了身体的健康。多年以来，科学家们一直想把抗体提出体外，用来制成抗体药物治疗疾病，抗体是机体里B淋巴细胞产生的。遗憾的是，B淋巴细胞没有繁殖能力，这样就不能得到很多的B淋巴细胞产生大量的抗体，可是癌细胞能无限地繁殖。1975年英国米尔斯坦把小鼠B淋巴细胞和在体外能分裂增殖的小鼠骨髓瘤细胞，用细胞融合技术融合在一起，产生了杂交瘤细胞。杂交瘤既繁殖得快又能产生大量抗体，这种抗体特异性特别强，被称为单克隆抗体。单克隆抗体的产生，使人类获得了一种对付疾病的有力武器。所以，从它问世起，就给免疫学带来了革命性的变化。
1982年，美国斯坦福医学中心的科学家用小鼠制备的单克隆抗体治疗B细胞淋巴瘤，治疗后患者的病情缓解、瘤体消失。1986年，美国食品药品管理局(FDA)批准世界上第一个单克隆抗体药物&&抗CD3单抗 OKT3进入市场，用于器官移植时的抗排斥反应。在这个时期，抗体药物的研制和应用给人们治疗疾病带来了很大的期望。
随着利用小鼠制备的鼠源单抗治疗疾病的病例数的增加，鼠源单抗用于人体的毒副作用也越来越明显。这是由于鼠源性单抗在人体内反复应用会引起人抗鼠抗体反应，从而也降低了疗效，甚至可引起过敏反应。
基因工程抗体：带抗体药物进入发展快车道
近年来，随着免疫学和分子生物学的研究与发展以及抗体基因结构的阐明，利用基因工程的方法对抗体进行改造，科学家们可以根据需要对鼠源抗体进行改造，也可利用基因工程的方法制备各种重组抗体。这样不仅可以消除人体对抗体的排斥反应，同时也可以根据需要制备新的抗体，并通过基因工程技术大量表达抗体分子。
在1984年用基因工程的方法制备了人&鼠嵌合抗体以后，新型的基因工程抗体不断出现，如人源化抗体、单价小分子抗体等等。随着不断研究，又出现了噬菌体抗体库技术，用来筛选抗体，不必用动物免疫的方法，可以筛选全人源性抗体和高亲和力抗体。这就使抗体药物研究进入了一个新的高潮。各种形式的基因工程抗体的制备成功和应用，将把抗体药物的研制带入一个快速发展的新时期。
目前，从美国来看抗体药物是处于临床试验阶段的在研药物产品最多的一类，有160种是抗体药物，有约30种抗体药物已经完成或正在进行三期临床试验。抗体药物在进入三期临床试验后，大约会有80%左右会被美国食品药品监督管理局批准进入市场。
抗体药物是目前美国食品药品监督管理局批准上市品种最多的一类生物工程药物。在美国食品药品监督管理局批准上市的80多种基因工程和抗体工程产品中，抗体类产品有21种，其中有18种为人源(化)抗体，只有3种鼠源抗体药物，如Orthoclone OKT3、Zevalin 和Bexxar,鼠源抗体销售额只有1000万美元左右甚至更低。而同样是抗CD20抗体Rituxan，经用抗体工程的方法经人源化改造的嵌合抗体，其销售额却达到了近32亿美元。这21种抗体药物主要用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病和抗移植排斥。其中美国FDA已先后批准9种用于治疗肿瘤的抗体药物。如：Rituximab(Rituxan)是1997年批准的，用于治疗B细胞性非霍杰金氏淋巴瘤已达30多万例病人，治疗总有效率为50%，其疗效与化学药物相同，但更安全，几乎无副作用，抗体联合化疗有效率高达80%以上。另外1998年批准的trastuzumab(Herceptin)和2004年批准的bevacizumab(Avastin)在治疗乳腺癌和非小细胞肺癌、结直肠癌方面疗效显著。Avastin与化疗药物联合使用，针对血管内皮生长因子(VEGF)的抗体药物可使晚期结肠癌患者的生存期平均延长5个月，FDA认为它几乎对所有的晚期结肠癌患者都有帮助，因此被批准为晚期结肠的一线用药。近年来新开发了多种治疗风湿性疾病的抗体药物。如已广泛应用于临床的肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂。已经上市的肿瘤坏死因子抑制剂有英夫利西单抗Infliximab(抗体名)、Remicade(商品名)、依那西普etanercept(抗体名)、Enbrel(商品名)和阿达木单抗Adalimumab(抗体名)、Humira(商品名)。这几种抗体药物在美国和欧洲广泛用于治疗类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎等。
抗体药物研发：可预期的巨大市场
我国一直十分重视抗体药物的研制和生产，无论是政府的科研投入还是企业的开发投入都比较多。目前我国已批准了11种抗体药物。其中有6种抗体药物是我国自行研发的产品。由第四军医大研制、成都华神开发的利卡订(商品名)、碘[131I]美妥昔单抗注射液(抗体名)，用于原发性肝癌的治疗；由上海美恩生物技术研发的[131I]-chTNT(商品名)、碘[131I]肿瘤细胞核嵌合抗体注射液(抗体名)，可用于治疗实体瘤；由北京百泰生物药业公司研发的泰欣生(商品名)、抗EGF人源化单抗(抗体名)，用于治疗鼻咽癌；由广东东莞宏远逸士生物技术药业有限公司研发的恩博克(商品名)、抗IL-8鼠源单抗乳膏(抗体名)，用于治疗银屑病。以上4种为一类生物制品新药。还有2种为二类新药，分别是由武汉生研所开发的Wu-T3(商品名)、抗CD3鼠源单抗，临床用于抑制器官移植排斥；另一种是由上海中信国健药业有限公司研发的益赛普(商品名)、重组TNF-FC融合蛋白(抗体名)，用于类风湿关节炎的治疗。
还有5种抗体物是属于外国公司在中国注册的产品。如罗氏公司的Rituxan(商品名)、Rituximab(抗CD20嵌合抗体)(抗体名)用于治疗非霍杰金氏淋巴瘤等。
自从1975年单克隆抗体技术产生以来，抗体药物的研发和上市进展非常快，目前除去有21种抗体药物被美国FDA批准上市，还有100多个抗体进入临床研究、500多个抗体药物处于临床前研究。据统计，在生物制药中，抗体药物就占31%。如治疗淋巴瘤的Rituxan抗体药物，400mg/支的价格为21000元左右，尽管价格高。但却供不应求。就这一种药，其销售额超过了30亿美元。据统计，2005年治疗性抗体药物销售额就超过了170亿美元。可预测2010年，抗体药物的销售额将达到250亿~300亿美元，总产量将超过6000kg。抗体药物所带来的巨大的经济效益， 促使着上百家生物技术公司全力投入抗体药物的研发。据悉，目前全世界所有的大制药公司和上百家中小制药公司，没有哪一家不涉足抗体药物的研发工作。
相信，随着人类基因组计划的完成、功能基因组和蛋白质组的研究进展、生物信息学和计算机技术的发展、转基因动植物研究的快速前进、抗体人源化的方法层出不穷，将使抗体药物的研发和应用日新月异，快速进入一个崭新的时代，为人类疑难病的治疗迎来一个又一个新的曙光。抗体药物的前景无限广阔。
（作者单位：中国生物工程学会）
背景资料：抗体工程(Antibody engineering)
指在基因水平上模拟抗体产生过程，改造抗体结构和强化抗体功能的一系列生物工程技术。这是蛋白质工程技术在医学上的应用。为了避免鼠源单克隆抗体在临床上应用时产生的副作用和提高抗体的结合能力和专一性，根据抗体分子的结构，通过蛋白质工程技术对其进行改造，并用基因工程技术产生多种新的抗体。例如，人鼠抗体基因拼接产生嵌合抗体和重构抗体，酶或毒素的基因与抗体基因拼接产生抗体酶或抗体毒素等。也可用定位诱变技术改造抗体可变区或恒定区以提高抗体分子的亲和力和专一性。
抗体库(Antibody library)
用PCR技术从生物体内扩增出整套的抗体重链(H链)基因和轻链(L链)基因或它们的基因片段，克隆在噬菌体载体上，使其以融合蛋白形式表达在噬菌体外壳表面，这就建成了抗体库。利用抗原&抗体特异性结合的特性，可以在抗体库内筛选某一抗原的专一性抗体克隆。
人源化抗体(Humanized antibody)
利用生物工程技术，将人的抗体分子的组分去置换非人源的抗体分子的相应部分，形成嵌合抗体，以降低其他动物的抗体分子进入人体后的免疫原性。例如，以人抗体分子的恒定区(C区)置换鼠源抗体分子的C区，鼠源抗体分子V区(可变区)中的框架区(FR)用人抗体的FR替代等。
发E-mail给：&蔡家麟1 王颖2& 潘欣1(通讯作者)
（1上海第二军医大学&& 上海交通大学基础医学院&& 200025）
【摘要】 近年来在骆驼和护士鲨等动物的体内发现了一种重链抗体。重链抗体和普通的抗体相比缺少轻链，仅有可变区，但依然保留了抗原结合能力。通过基因工程改造重链抗体形成的单域抗体不仅保留了分子量小、物理稳定性高、容易表达等特性优点，而且亲和力高、不易聚集，被广泛应用于科研和临床诊断。
【关键词】 重链抗体& 单域抗体& 骆驼科动物
【中图分类号】R392&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文献标识码】A&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文章编号】（9-02
The new research and application progress in heavy chain antibody and its genetic engineering single domain antibody
Cai Jialin1& Wang Ying2& Pan Xin1*
1. Second Military Medical University, Shanghai 200433, C 2. Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025
【Abstract】& In recent years, researchers found unusual antibodies composed only of heavy chains from camelids and sharks. These peculiar heavy chain antibodies (hcAbs) lack light chains but still remain dedicated variable domain with the antigen-binding site. Recombinant single-domain antibody is the smallest intact antigen-binding fragment derived from heavy-chain antibodies. The advantageous features of single domain antibody reagents derived from these hcAbs include their small dimension, high apparent stability, high expression. As expectations, high-affinity, improved solubility without any sign of aggregation single-domain antibodies can be widely used in basic research and improved diagnostic field.
【Key words】 heavy-chain antibody&& single-domain antibody&& camelid
&&&&&&&& 自1890年抗体被人们发现后，抗体技术已经历了一个多世纪的研究和发展，尤其是1975年诺贝尔奖获得者Kohler和Milstein杂交瘤技术的发明，使多抗和单抗越来越多地应用于临床治疗药物、临床诊断试剂和基础研究领域。单抗类药物的研发成本较高，一般在13亿左右，而传统小分子药物平均约9亿。但是单抗类药物临床试验成功率高、副作用小，平均通过率达30%左右，大大高于传统药物，同时效果也更好，因此受到各大国际药企的追捧，纷纷投入巨额研发资金。从1986年第一个单抗类药物通过FDA的审查到2012年为止已有36个单抗类药物上市，此外还有25个单抗和5个融合抗体进入了临床3期的试验。具估计2011年单抗类药物的市值达到480亿美元，领跑所有的生物类药物，到2012年估计将达到500亿以上[1]。
&&&&&&&& 传统的单抗药物虽然有着上文提到的种种优势但是也存在着各种各样的缺陷和不足。首先，鼠源单抗在临床应用中会致患者体内产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody，HA-MA)，从而造成各种风险，需要进行必要的人源化（humanlize）[2]。其次，传统抗体分子量大，对肿瘤组织和血管屏障的穿透性差，尤难进入人类高发的实体瘤。此外，由于传统抗体分子较大，在哺乳动物细胞中表达量低，在原核细胞体系中容易出现聚集和无法糖基化等问题，从而使得成本较高，限制了其进一步的应用。
&&&&&&&& 为了解决这些问题，人们利用基因工程技术对多抗和单抗进行改造。先后出现了鼠嵌合抗体、抗原结合片段（antigen binding fragment，Fab）、单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）和微抗体（minibody）等不同形式的经过基因改造的工程抗体。总体而言其发展方向是小型化，分子量越来越低。小型化不仅有利于在不同表达系统中大量稳定表达，同时也能获得更好的渗透性，到达预设的给药位置。1993年，人们发现骆驼体内存在不含轻链的抗体，这一特殊抗体后来被定名为重链抗体（heavy-chain antibodies，hcAbs），因为其结构特殊，很快被广泛应用到了基因工程抗体研发中。
&&&&&&&& 一、重链抗体和其单域抗体
&&&&&&&& 普通抗体一般由重链和轻链四条多肽链组成，重链分子量较大，轻链分子量较小，两两一组构成抗体的Y字形结构。随着人类对抗体研究的不断深入，人们发现存在单链抗体这一抗体的特殊形式。早在1987年，就在人体内发现确实存在轻链抗体，这是由于人体本身基因缺陷产生的，这些单链抗体不存在抗原结合能力。1993年在美洲驼的血液内发现了缺失轻链但保持抗原结合能力的重链抗体。随后，又相继在美洲驼所属的骆驼科其他动物如羊驼中发现此类的抗体，在银鳐、护士鲨等软骨鱼体内发现了类似的不存在轻链的抗原受体（new antigen receptor，NAR）。&
&&&&&&&& 单域抗体是指只包含抗体正常抗体重链或轻链可变区的基因工程抗体，其分子量远远小于现有的各种抗体，如Ig抗体（150kD），Fab抗体（75kD），scFv抗体（35kD）。上世纪80年代有人尝试用小鼠的VL可变区来抑制溶菌酶的活性并获得成功。随后人们进行了大量研究，由于变化过于剧烈，产生了如亲和力大幅下降，可溶性差等严重问题。重链抗体发现后，由于其天然状态下呈单链形式存在，克服了人源与鼠源抗体亲和力低、易聚集等问题，成为单域抗体研究中的热点。
&&&&&&&& 二、重链抗体和其单域抗体的基因和结构特征
&&&&&&&& 骆驼体内存在分子量各不相同的3种抗体：传统抗体IgG1和重链抗体IgG2/IgG3，其含量在血液中各占了一半，和人类的重链抗体缺失不同的是，骆驼体内的重链抗体在体液免疫中起着重要的作用。
&&&&&&&& 重链抗体中由重链可变区结合抗原的单一结构域构成的抗体称为单域重链抗体（variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody，VHH）[3]。单峰驼的胚系基因中存在CH1区的编码序列，但在mRNA中不存在，因此推测在剪切的过程中重链的第一恒定区（first constant domain，CH1）丢失。
由于CH1区和内质网的BIP结合，与抗体从内质网的分泌调节有关，重链抗体因CH1缺失不需与BIP结合，所以在体内的分泌速度也更快。由于CH1区的缺失，重链抗体的可变区和恒定区直接由铰链区连接。由于在基因上与普通抗体相同，所以重链抗体的来源一直是讨论的焦点。2002年，学者们通过比较大量单峰驼和美洲驼VHH的胚系基因，建立了相应的进化树，证明了重链抗体来源于传统抗体的改变而非休眠基因的复苏。随着研究的进一步深入，人们又发现，VH和VHH的胚系基因有部分是共用的，这部分基因的表达产物存在较强的抗原结合能力，通过建立免疫噬菌体库，得到了有较高亲和力的抗体。
&&&&&&&& 普通抗体重链可变区的框架区（framework region，FR）FR2中V42、G49、L50和W52这四个氨基酸残基和轻链相互作用起到稳定双链结构的作用，而在重链抗体的胚系基因序列中突变为亲水性的Phe/Tyr42、Gly49、Arg/Cys 50和Leu/Gly52，在Kabat numbering中这几个残基是45、47、37和44[4]。这四个氨基酸残基的改变，使得重链抗体在缺少轻链的情况下依旧可以保持稳定，并且亲水性得到了一定程度的提高。
&&&&&&&& 通过对大量不同的单峰驼与美洲驼个体的VHH胚系基因序列测序，发现VHH的胚系基因表现出丰富的多样性，从而使得重链抗体能够形成足够与不同抗原结合的大量凸环。通过比较人类重链可变区（variable domain of the heavy-chain，VH）VH3基因序列与骆驼的VHH胚系基因序列，发现二者有高度的同源性。因此有人对人源抗体VH结构域FR2的42、49、50和52位点氨基酸残基根据重链抗体中相对应的氨基酸残基进行骆驼化（camilising）改造，所得到的骆驼化人单域抗体不仅保持原有抗体的特异性和亲和力，且溶解性好，稳定性也比原来有了显著提高；同样也有人反其道而行，将重链抗体进行了人源化，获得的抗体也保留了本身的抗原结合能力。
&&&&&&&& 通过晶体衍射结构分析发现，重链抗体可变区与人和小鼠的空间结构相同，都是由&片层结构组成。但存在两点不同，首先，重链抗体的互补决定区（complementarity-determining region，CDR）CDR3的长度达到16～18个氨基酸残基，而人CDR3一般为12个氨基酸残基，虽然在美洲驼中存在6个氨基酸残基的CDR3区，但是总体长度和变化要超过人CDR3。其次，在重链抗体的CDR1区和FR2区存在CYS，可以和CDR3形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和变化程度。&
&&&&&&&& 三、重链抗体改造单域抗体的优势
&&&&&&&& 重链抗体天然缺失轻链，由重链抗体改造而来的单域抗体（single-domain antibody）在自然状态下以单链存在，和人源或鼠源的单域抗体相比其亲和力保存的较好，而人源或鼠源的轻链可变区（light-chain variable domain, VL）或VH单域抗体都存在亲和力大幅下降的可能。单域抗体分子量远远小于传统抗体，同时由于缺失FC段等恒定区，因此更容易在各种系统中进行表达。在E.coil表达系统中，其表达量可以在培养基中达到1～10mg/L，并且也可以在酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞中表达。
&&&&&&&& 分子量的减小不仅使得单域抗体表达容易，同样使得其组织渗透性好于普通抗体，可以穿过普通抗体无法通过的物理屏障，并且可以结合一些普通抗体无法结合的隐蔽表位和特殊表位。2002年Muruganandam在研究中发现单域抗体可以在动物模型的脑内发现，因此推测单域抗体具有穿透血脑屏障的能力[3]。
&&&&&&&& 由于单域抗体FR2区中特殊的亲水性氨基酸残基的改变和CDR3区二硫键的存在，其稳定性和亲水性也远远优于传统的VH抗体。有实验显示，一些VHH抗体在90℃的高温下依旧可以和目标抗原结合。单域抗体在溶液中的可溶性很高，不容易产生聚集，可以在极端环境下保持稳定[3]。
&&&&&&&& 四、单域抗体的筛选和应用
&&&&&&&& VHH来源的单域抗体结构简单，不像scFv等抗体存在正确折叠等要求。单域抗体易于通过基因工程建立免疫/非免疫/半合成抗体库，利用噬菌体/酵母/核糖体等展示技术快速进行筛选，得到目的抗体。使用不同的筛选条件和技术可以得到适应不同需求的各种单域抗体，有人使用洗发水作为固相富集环境，筛选到了可以在洗发水中稳定存在并特异性结合头皮真菌的抗体；有人使用唾液和胃酸作为固相富集环境，筛选出的单域抗体表达在乳酸菌表面，用作口服制剂。此外，有的实验室还依据单域抗体表达稳定、分子量小的特点，结合酵母双杂交技术开发出了在酵母细胞内进行胞内抗体筛选的技术[5]。
&&&&&&&& 单域抗体拥有传统抗体所不具有的稳定性，穿透性和结合能力，可以应用于许多传统抗体难以发挥效应的特殊领域。有实验室筛选到了对蝎子毒素Aahl高亲和力的单域抗体，证明单域抗体具有不同于常规抗体的结构，较易结合隐藏的表位。单域抗体除了可以有效中和动物和昆虫毒素外，还可以中和并清除多种细菌毒素，如肉毒素B和葡萄球菌肠毒素B等，肉毒素B和葡萄球菌肠毒素B都是使用非免疫抗体库获得的。
&&&&&&&& 单域抗体组织渗透性明显高于传统抗体，如针对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的特异性抗体可以有效中和EGF竞争结合位点，起到抑制实体瘤生长的作用，并在动物体内得到证实。单域抗体容易组装，易于在胞内表达，有人将抗HBV胞内抗体应用于小鼠模型中证实单域抗体具有胞内抗病毒治疗作用。
&&&&&&&& 单域抗体便于进行基因工程操作，可以根据不同需求研发各种单域抗体。如为了减少成像检测中背景过深的问题，有学者将可以识别骨髓衍生细胞的单域抗体的环区转移到了一个背景较浅的单域抗体的骨架上，在动物体内的试验中成功降低了背景亮度，同时保留了单域抗体的识别能力。Coppieters等将筛选到的抗TNF单域抗体进行了融合成为了2价体，经过改造后亲和力提高了500倍，同时延长了体内的半衰期，在动物试验中得到了成功，如今已进入临床试验。
&&&&&&&& 骆驼重链抗体来源的单域抗体虽然依然存在体内半衰期短，亲和力不如常规IgG抗体等缺点，但是瑕不掩瑜，有理由相信单域抗体具有走出实验室进入临床的可能。
[1] K&hler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. 1975[J]. J Immunol. ): .
[2] Reichert JM. Antibody-based therapeutics to watch in 2011[J]. MAbs.):76-99.
[3] 潘欣,潘伯驹,蔡家麟,李晗,王颖,蓝乐夫,廖万清. 单域抗体研究进展.生命科学 ):404-410
[4] Deschacht N, De Groeve K, Vincke C, Raes G, De Baetselier P, Muyldermans S. A novel promiscuous class of camelid single-domain antibody contributes to the antigen-binding repertoire[J]. J Immunol,):.
[5] Tanaka T, Rabbitts TH. Protocol for the selection of single-domain antibody fragments by third generation intracellular antibody capture[J]. Nat Protoc. ):67-92.
基金资助: 国家自然科学基金资助课题（）
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　　书名:抗体工程药物
　　作者:甄永苏 光
　　出版社:化学工业出版社
　　定价:55
　　出版日期:
　　版次: 1
　　开本:16开
　　包装:平装
抗体工程药物 -
　　《现代生物技术制药丛书》是化学工业出版社重点策划、隆重推出的一套精品图书。该套书由我国著名生物医药专家甄永苏院士担任编委会主任，相关专业的专家共同撰写。《抗体工程药物》由相关领域国内多年在第一线从事研究与应用的专家编写而成，编写人员中包括2位中国工程院院士和1位中科院院士。本书是将他们多年的研究经验和成果总结而成。本书首先从抗体工程人手，介绍了杂交瘤细胞技术与单克隆抗体、基因工程抗体、利用动物细胞与转基因动植物制备抗体和抗体的分离纯化技术，然后介绍了抗体免疫偶联物、基于抗体的融合蛋白、与酶相关的抗体药物、抗体的体外应用、抗体的药代动力学以及放射免疫显像与治疗，最后阐述了抗体和抗体工程药物在肿瘤、心血管疾病、病毒感染、免疫系统相关疾病等的治疗及基因治疗中的应用。是一部系统全面,理论联系实际，以实用技术为主的著作。本书可供生物医药研究技术人员，及有关专业的大专院校师生阅读和参考。
抗体工程药物 -
　　第1章抗体工程药物——生物技术制药领域的热点（甄永苏）1
　　1?1抗体工程与抗体药物1
　　1?1?1抗体作为治疗剂1
　　1?1?2单克隆抗体1
　　1?1?3基因工程抗体1
　　1?1?4免疫偶联物与融合蛋白2
　　1?1?5应用于临床的抗体药物2
　　1?2抗体药物的特异性3
　　1?2?1与相关抗原的特异性结合3
　　1?2?2对肿瘤靶细胞的选择性杀伤作用3
　　1?2?3在动物体内的靶向性分布3
　　1?2?4对相关的肿瘤显示更强的疗效3
　　1?2?5在临床使用取得确定的疗效3
　　1?3抗体药物的多样性3
　　1?3?1抗原的多样性3
　　1?3?2抗体结构的多样性4
　　1?3?3抗体活性的多样性4
　　1?3?4免疫偶联物与融合蛋白的多样性4
　　1?4制备抗体药物的定向性4
　　1?4?1针对特定的靶分子定向制备抗体药物4
　　1?4?2根据需要选择抗体药物的“效应分子”4
　　1?5抗体药物研究的主要趋向5
　　1?5?1研究新的分子靶点5
　　1?5?2抗体的人源化5
　　1?5?3抗体药物的高效化5
　　1?5?4抗体药物分子的小型化6
　　1?5?5具有抗体功能的融合蛋白6
　　1?6抗体药物——研制新药的丰富资源6
　　参考文献7
　　第2章杂交瘤技术与单克隆抗体（尹红章）8
　　2?1概述8
　　2?1?1抗体的种类8
　　2?1?2杂交瘤及杂交瘤技术8
　　2?1?3单克隆抗体9
　　2?1?4国内外研究现状9
　　2?2的建立9
　　2?2?1免疫B淋巴细胞的制备9
　　2?2?2骨髓瘤细胞的选择10
　　2?2?3细胞融合10
　　2?2?4特异杂交瘤细胞的筛选11
　　2?2?5杂交瘤细胞的克隆及建株11
　　2?3杂交瘤细胞的检定12
　　2?3?1杂交瘤细胞染色体分析12
　　2?3?2稳定性分析12
　　2?3?3外源因子检查13
　　2?4单克隆抗体的制备14
　　2?4?1动物体内诱生法14
　　2?4?2体外培养法14
　　2?5单克隆抗体的鉴定15
　　2?5?1Ig类别及亚类15
　　2?5?2纯度含量测定15
　　2?5?3活性测定15
　　2?5?4识别抗原位点测定15
　　2?5?5亲和力测定15
　　2?5?6特异性、交叉反应性测定16
　　参考文献16
　　第3章基因工程抗体（张众黄华籚)17
　　3?1人?鼠嵌合抗体17
　　3?1?1可变区基因的克隆18
　　3?1?2表达载体的构建20
　　3?1?3嵌合抗体的表达20
　　3?1?4嵌合抗体的应用与优缺点22
　　3?2鼠单抗可变区人源化抗体22
　　3?2?1改形抗体22
　　3?2?2表面氨基酸残基的“人源化”——镶面抗体24
　　3?2?3表位印迹选择25
　　3?3小分子抗体26
　　3?3?1小分子抗体的种类26
　　3?3?2构建方法27
　　3?3?3表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达29
　　3?3?4小分子抗体的分离与纯化31
　　3?3?5小分子抗体的优缺点与应用34
　　3?4双特异性及多特异性抗体35
　　3?4?1构建方法36
　　3?4?2双特异性抗体的应用38
　　参考文献40
　　第4章抗体库技术（王祥斌黄华籚)42
　　4?1概述42
　　4?2噬菌体抗体库技术43
　　4?2?1噬菌体表面展示技术的原理43
　　4?2?2噬菌体抗体库的种类45
　　4?2?3构建噬菌体抗体库的一般途径47
　　4?2?4噬菌体抗体库筛选示例50
　　4?3选择性感染抗体库技术56
　　4?3?1SIP技术的原理57
　　4?3?2SIP抗体库技术58
　　4?3?3SIP技术的缺陷及应用前景58
　　4?4核糖体展示抗体库技术60
　　4?4?1核糖体展示技术的基本原理61
　　4?4?2核糖体展示抗体库技术61
　　4?4?3展望66
　　4?5抗体库技术的应用67
　　4?5?1分子定向进化68
　　4?5?2DNA改组技术69
　　4?5?3定向进化与抗体人源化70
　　4?5?4抗体72
　　4?5?5提高抗体分子稳定性72
　　参考文献74
　　第5章哺乳动物细胞培养生产抗体（蒋先敏李强）77
　　5?1影响动物细胞体外培养的主要因素77
　　5?1?1营养条件77
　　5?1?2培养温度77
　　5?1?3培养液的酸碱度78
　　5?1?4溶解氧78
　　5?1?5渗透压78
　　5?1?6葡萄糖代谢79
　　5?1?7谷氨酰胺代谢80
　　5?2动物细胞培养操作方法80
　　5?2?181
　　5?2?2流加式操作81
　　5?2?3半连续式操作82
　　5?2?4连续操作82
　　5?2?582
　　5?3动物细胞培养生物反应器82
　　5?3?1气升式生物反应器83
　　5?3?2鼓泡式生物反应器83
　　5?3?3中空纤维生物反应器83
　　5?3?4通气搅拌生物反应器84
　　5?3?5无泡搅拌生物反应器85
　　5?4动物细胞的微囊化培养85
　　5?4?1微囊化培养的细胞种类85
　　5?4?2培养条件85
　　5?5杂交瘤细胞培养生产抗体86
　　5?5?1培养86
　　5?5?2通气搅拌生物反应器生产87
　　5?5?3微囊化细胞培养87
　　参考文献87
　　第6章用转基因植物和转基因动物生产抗体（朱立平）89
　　6?1在植物中生产89
　　6?1?1转基因植物可以作为生产重组蛋白的生物反应器89
　　6?1?2在转基因植物中生产抗体89
　　6?1?3系统90
　　6?1?4持久表达系统91
　　6?2在转基因奶中生产重组抗体91
　　6?2?1乳腺表达系统91
　　6?2?2奶特异转基因91
　　6?2?3种系选择92
　　6?2?4把目的基因导入胚系细胞93
　　参考文献94
　　第7章抗体的纯化及其理化性质检定（孔健）95
　　7?1血清中抗体的纯化95
　　7?1?1硫酸铵沉淀法95
　　7?1?2低温96
　　7?1?3?硫酸铵沉淀法98
　　7?2鼠腹水中单克隆抗体的初步纯化99
　　7?2?1腹水的预处理99
　　7?2?2正辛酸?硫酸铵沉淀99
　　7?3细胞培养液中单克隆抗体的浓缩99
　　7?3?1培养液中杂交瘤细胞的去除99
　　7?3?2单克隆抗体的浓缩99
　　7?4亲和色谱100
　　7?4?1蛋白质A或蛋白质G亲和色谱100
　　7?4?2特异性色谱纯化抗体102
　　7?5离子交换色谱103
　　7?5?1离子交换的原理103
　　7?5?2试验条件的选择104
　　7?5?3抗体的纯化方法107
　　7?6色谱109
　　7?6?1凝胶过滤的原理109
　　7?6?2选择凝胶过滤基质109
　　7?6?3操作流程109
　　7?7高纯度单克隆抗体纯化方案设计111
　　7?7?1腹水111
　　7?7?2细胞培养液111
　　7?8单克隆抗体理化性质检定112
　　7?8?1蛋白质浓度112
　　7?8?2纯度114
　　7?8?3分子质量测定122
　　参考文献122
　　第8章抗体免疫偶联物（）123
　　8?1概述123
　　8?2小分子药物与单联物124
　　8?2?1直接偶联物124
　　8?2?2间接偶联物126
　　8?2?3小分子药物与单抗偶联物的研究趋势128
　　8?3毒素及大分子多肽类药物与单抗偶联物129
　　8?3?1同型双功能偶联剂129
　　8?3?2异型双功能偶联剂130
　　8?3?3其他连接剂133
　　8?3?4免疫偶联物的纯化134
　　8?3?5免疫毒素的研究趋势135
　　8?4免疫偶联物的临床试验136
　　8?4?1单抗?药物偶联物的临床试验136
　　8?4?2化学免疫毒素的临床试验136
　　参考文献138
　　第9章基于抗体的融合蛋白(唐勇)142
　　9?1重组免疫毒素142
　　9?1?1重组免疫毒素的构建143
　　9?1?2临床试验145
　　9?1?3存在问题146
　　9?2基因工程抗体?酶融合蛋白147
　　9?2?1抗体介导的酶?前药疗法147
　　9?2?2基于核酸酶的融合蛋白149
　　9?2?3靶向溶栓剂150
　　9?3基因工程抗体?细胞因子融合蛋白150
　　9?3?1抗体?(IL?2)融合蛋白150
　　9?3?2抗体?(GM?CSF)融合蛋白151
　　9?3?3抗体?（IL?12）融合蛋白152
　　9?3?4抗体?B7融合蛋白153
　　9?4抗体?超抗原融合蛋白153
　　9?4?1致热超抗原及其结构特点153
　　9?4?2抗体?SEA融合蛋白的抗肿瘤作用154
　　参考文献156
　　第10章与酶相关的抗体药物(王风强)158
　　10?1抗体靶向的酶前药治疗158
　　10?1?1ADEPT体系的作用原理及主要特点158
　　10?1?2ADEPT体系的构成要素159
　　10?1?3ADEPT体系的研究展望170
　　10?2抗体酶171
　　10?2?1抗体酶作用的基本原理172
　　10?2?2抗体酶研究中的重要参数172
　　10?2?3抗体酶的设计173
　　10?2?4抗体酶的筛选和选择179
　　10?2?5抗体酶催化化学反应的类型和新型183
　　10?2?6抗体酶的应用186
　　10?2?7抗体酶研究的现状及前景展望188
　　10?2?8抗体酶的研究展望188
　　10?3抗酶抗体189
　　10?3?1抗酶抗体用于酶的免疫分析和检测190
　　10?3?2抗酶抗体用于酶的固定化技术190
　　10?3?3抗酶抗体用于疾病的诊断190
　　10?3?4用抗酶抗体诱导产生疾病模型190
　　10?3?5抗酶抗体用于酶活性的抑制和疾病治疗191
　　参考文献191
　　第11章抗体的体外应用（）194
　　11?1放射免疫分析195
　　11?1?1理论前提195
　　11?1?2基本原理195
　　11?1?3主要步骤195
　　11?1?4判断结果196
　　11?2免疫放射分析196
　　11?3酶免疫技术197
　　11?3?1均相EIA198
　　11?3?2非均相EIA200
　　11?3?3酶免疫分析中的放大系统202
　　11?4荧光免疫技术204
　　11?4?1荧光免疫分析205
　　11?4?2206
　　11?5化学发光免疫分析207
　　11?6定位酶免疫技术207
　　11?7免疫?PCR和PCR?免疫208
　　11?7?1免疫?PCR208
　　11?7?2PCR?免疫210
　　11?8技术211
　　11?9抗体、标记化合物和标准品211
　　11?9?1抗体211
　　11?9?2标记化合物211
　　11?9?3标准品214
　　11?9?4固相抗体（抗原）的制备214
　　11?10方法学判断及注意事项215
　　11?10?1方法学判断215
　　11?10?2注意事项217
　　参考文献219
　　第12章抗体的药代动力学()221
　　12?1概述221
　　12?2抗体药物药代动力学的研究和方法221
　　12?2?1研究抗体药物药代动力学规律221
　　12?2?2选择进行动物药代动力学试验221
　　12?2?3给药途径、剂量和给药次数的设置222
　　12?2?4测定抗体药物的方法222
　　12?2?5测定抗体药物方法可靠性的确证222
　　12?3治疗或预防性嵌合体或人源性抗体药物的药代动力学223
　　12?3?1dicliximab非临床和临床药代动力学研究223
　　12?3?2trastuzumab临床药代动力学研究228
　　12?3?3rhTNFR?Fc的临床药代动力学230
　　12?3?4alrmtuzumab的药代动力学研究231
　　12?3?5rituximab的药代动力学研究231
　　12?3?6palivizumab的药代动力学研究232
　　12?3?7basitiximab的药代动力学研究232
　　12?3?8Infliximab的药代动力学研究233
　　12?3?9abciximab的药代动力学研究233
　　12?4免疫毒素或抗肿瘤药物偶联物的抗体药物的药代动力学234
　　12?4?1BMS?191352的药代动力学研究234
　　12?4?2抗?Tac(Fv)?PE38免疫毒素抗体的药代动力学研究235
　　12?4?3单抗与抗癌药物偶联改善抗癌药物的药代动力学236
　　12?5放射诊断用的放射性标记抗体236
　　12?6治疗放射性标记抗体238
　　12?6?1治疗淋巴瘤的新战略238
　　12?6?290Y?Ibritumomab Tiuxetan的药代动力学239
　　12?7抗体药物药代动力学的特点和展望240
　　12?7?1抗体药物药代动力学的特点240
　　12?7?2药代动力学研究在开发新型抗体药物研究中的作用241
　　参考文献242
　　第13章放射免疫显像与治疗（蔡炯王世真）243
　　13?1放射性核素概论243
　　13?1?1放射性核素的性质243
　　13?1?2放射性核素的生产245
　　13?1?3放射性核素体内显像设备246
　　13?2抗体的放射性核素标记方法249
　　13?2?199mTc标记方法249
　　13?2?2123I、125I、131I标记方法251
　　13?2?3111In标记方法252
　　13?2?4正电子核素标记方法253
　　13?2?567Cu标记方法254
　　13?2?6放射性药物的检定254
　　13?3单克隆抗体放射免疫显像256
　　13?3?1肿瘤显像中的应用256
　　13?3?2心血管系统疾病诊断中的应用258
　　13?3?3炎症显像中的应用258
　　13?3?4骨显像和中的应用260
　　13?3?5血栓的显像260
　　13?3?6急性呼吸应激综合征260
　　13?3?7系统性红斑狼疮（SLE）肾损害显像260
　　13?3?8放射免疫引导手术的放射免疫显像260
　　13?3?9放射免疫治疗的放射免疫显像261
　　13?3?10提高抗体显像质量的方法261
　　13?3?11标记抗体的药代动力学262
　　13?4重组抗体片段的体内显像262
　　13?4?1单链可变区片段的靶向和显像263
　　13?4?2二价抗体的靶向和显像265
　　13?4?3中等大小抗体片段的靶向和显像266
　　13?4?4几种重组抗体片段的靶向和显像特性比较267
　　13?4?5重组抗体片段体内显像的发展方向268
　　13?5放射免疫治疗268
　　13?5?1肿瘤对抗体的摄取269
　　13?5?2T/NT比值269
　　13?5?3免疫原性和过敏反应270
　　13?5?4抗体的产量270
　　13?5?5放射性核素271
　　参考文献271
　　第14章治疗肿瘤的抗体药物(杨治华冉宇靓)274
　　14?1治疗肿瘤的抗体药物的历史274
　　14?1?1抗体药物的诞生与发展274
　　14?1?2治疗肿瘤的抗体药物的兴起275
　　14?2恶性肿瘤的发生发展与治疗275
　　14?2?1恶性肿瘤的特点与种类275
　　14?2?2恶性肿瘤的发生276
　　14?2?3恶性肿瘤的发展、转移277
　　14?2?4恶性肿瘤细胞277
　　14?2?5肿瘤血管279
　　14?2?6肿瘤免疫280
　　14?2?7恶性肿瘤的治疗280
　　14?3抗体药物治疗肿瘤的策略280
　　14?3?1概述280
　　14?3?2靶向治疗类抗体药物281
　　14?3?3封闭类抗体药物286
　　14?3?4作用于信号转导类抗体药物287
　　14?3?5杀伤类抗体药物289
　　14?3?6抗独特型疫苗类抗体药物290
　　14?3?7抗血管类抗体药物291
　　14?3?8其他种类的抗体药物292
　　14?4治疗肿瘤的抗体药物的现状293
　　14?4?1已经上市的治疗肿瘤的抗体药物293
　　14?4?2临床及临床前研究现状299
　　14?5发展趋势与存在的问题302
　　14?5?1全人化与大规模生产302
　　14?5?2新型抗体药物303
　　14?5?3抗体药物治疗肿瘤存在的问题305
　　参考文献306
　　第15章心血管疾病相关的抗体药物(阮长耿)308
　　15?1血栓形成及其相关的单克隆抗体308
　　15?2与心血管疾病诊断相关的单克隆抗体310
　　15?2?1导向单克隆抗体与血栓显像310
　　15?2?2其他与心血管疾病诊断相关的单克隆抗体312
　　15?3与心血管疾病治疗相关的单克隆抗体312
　　15?3?1导向单克隆抗体与溶栓治疗312
　　15?3?2治疗心血管疾病的抗体药物313
　　参考文献315
　　第16章抗抗体药物()317
　　16?1抗体在抗病毒感染中的预防和治疗效应318
　　16?2美国FDA批准的已用于临床的抗病毒抗体产品319
　　16?3目前获得成功的抗病毒基因工程抗体药物321
　　16?4临床试验或接近临床试验的抗病毒工程抗体药物322
　　16?4?1抗人类免疫缺陷病毒HIV重组抗体322
　　16?4?2抗乙型肝炎病毒重组抗体323
　　16?5实验室阶段的抗病毒基因工程抗体324
　　16?5?1抗汉基因工程抗体324
　　16?5?2抗单纯疱疹病毒基因工程抗体325
　　16?5?3抗狂犬病毒重组基因工程抗体326
　　16?5?4抗丙型肝炎病毒重组抗体326
　　16?5?5抗甲型肝炎病毒基因工程抗体327
　　16?5?6其他抗病毒基因工程抗体327
　　参考文献328
　　第17章免疫系统相关疾病的抗体药物(陈晓红)331
　　17?1自身免疫病与抗体药物331
　　17?1?1自身免疫病的基本概念331
　　17?1?2自身免疫病的分类及基本特征331
　　17?1?3自身免疫病的发病机制332
　　17?1?4自身免疫病的治疗原则334
　　17?1?5针对自身免疫病的抗体药物335
　　17?2哮喘与抗体药物341
　　17?2?1哮喘的发病机制341
　　17?2?2针对哮喘的抗体药物342
　　17?3同种器官移植排斥和抗体药物343
　　17?3?1同种器官移植排斥的机制343
　　17?3?2移植排斥反应的类型345
　　17?3?3移植排斥反应的防治345
　　17?3?4针对移植排斥反应的抗体药物347
　　参考文献349
　　第18章以抗体为基础的基因治疗(沈)351
　　18?1单克隆抗体用于为基础的靶向基因转移351
　　18?2单抗用于以病毒载体为基础的靶向基因治疗352
　　18?3新型基因免疫毒素353
　　18?4胞内抗体应用于基因治疗354
　　18?4?1胞内抗体在分泌途径上阻断靶蛋白355
　　18?4?2胞内抗体在细胞质和细胞核阻断靶蛋白356
　　18?4?3胞内抗体与人艾滋病基因治疗357
　　参考文献358
　　中文索引362
　　英文索引368
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