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美国红栌组培快繁技术研究
【摘要】：美国红栌Cotinus coggyria(Royal purple)是美国黄栌的一个变种,主产美国,由北京市林科院引入北京,在园林绿化中用途广泛,开发前景广阔。本试验旨在通过美国红栌的组培快繁技术的研究,使得这一优良品种得以产业化开发应用。主要结果如下:
1.在美国红栌的无菌培养繁殖体建立的过程中,不同的灭菌剂以升汞的灭菌效果最好,外植体的不同部位对试材影响较大,以带腋芽茎段成活率较高,效果较好。灭菌时间对美国红栌外植体的成活率也有一定的影响,以6、7、8、9min灭菌效果较好,其中8min效果最好。
2.在试管苗诱导丛生芽试验中,其激素浓度及种类组合对结果影响较大。以6-BA/NAA(0.1/0.02)组合诱导的丛生芽量较大,且无愈伤组织产生,效果最理想。另外,培养温度对试管苗的分化有一定的影响,在26～28℃的温度下,诱导效果最好,平均增殖系数为6.40。
3.对外植体褐变问题进行了一定的探索。认为:褐变程度与外植体的年龄、大小、取材时间等有关。冬季外植体褐变率明显低,较老的组织褐变较轻,活性炭有较好的抑制褐变的作用。
4.在试管苗生根中①1/2 ML+IBA(0.2)与1/2 ML+NAA(0.2)均为较理想的培养基组合,其诱导生根率分别达到88.9%及98.5%,每茎段平均生根条数为2.71及2.64。②琼脂6g/L时的生根数显著高于5.5和6.5g/L时的生根数,而所有处理中以7g/L最有利于根的数量的增多。③低浓度的活性碳有利于生根,用0.2、0.4g/L处理后,苗的生根率差异不显著,但两者都显著高于对照与其它处理,尤其以0.4g/L最佳,生根率达100%。④试管苗的生根率和生根数均随不定芽的高度增加而升高,进行生根培养的苗高以21～25mm为佳,虽然生根率和平均生根数较低,但是根的长度和驯化成活率最高。⑤生根培养的最佳温度为22℃。⑥对发根比较适合的蔗糖浓度为15～30g/L,其中以20或25最佳,发根率分别为96.7%和92.2%,根长度分别为8.47和7.86cm,两者的发根率和根长都无显著差异,但都显著高于对照和其他处理。⑦培养时间越长越有利
【关键词】：
【学位授予单位】：山东农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2005【分类号】：S792.99【目录】：
1 引言11-26
1.1 研究的目的和意义11-12
1.2 国内外研究的现状12-26
1.2.1 植物离体快繁技术的基本原理12-13
1.2.2 观赏植物离体快繁的现状13-19
1.2.3 植物离体快繁技术在观赏植物上的应用19-26
2 试验材料与方法26-32
2.1 试验材料26
2.2 试验方法26-31
2.2.1 无菌培养繁殖体的建立26-27
2.2.2 试管苗增殖27-28
2.2.3 试管苗褐变及调控28
2.2.4 试管苗生根试验28-29
2.2.5 试管苗驯化及移栽29-31
2.3 试验结果观察与数据统计方法31-32
2.3.1 无菌培养外植体建立31
2.3.2 分化增殖31
2.3.3 褐变控制31
2.3.4 生根培养31
2.3.5 炼苗移栽31-32
3 结果与分析32-48
3.1 无菌培养繁殖体的建立32-33
3.1.1 不同表面灭菌方法对外植体灭菌效果的比较32
3.1.2 不同部位外植体对表面灭菌成活率的影响试验32-33
3.1.3 HgCl_2不同灭菌时间对外植体成活率的影响试验33
3.2 试管苗的增殖33-35
3.2.1 丛生芽的诱导33-34
3.2.2 6-BA、IBA对丛生芽的诱导34
3.2.3 6-BA、NAA对丛生芽的诱导34-35
3.2.4 不同培养温度对试管苗生长与分化的影响35
3.3 试管苗褐变与调控35-37
3.3.1 不同的生长季节的外植体对褐变的影响35-36
3.3.2 外植体的老化程度对褐变的影响36
3.3.3 抗氧化剂和其他抑制剂对褐变的影响36-37
3.4 试管苗生根37-44
3.4.1 大量元素与IBA对生根的影响37-38
3.4.2 大量元素与NAA对生根的影响38-40
3.4.3 琼脂浓度对生根的影响40-41
3.4.4 活性炭对生根的影响41
3.4.5 试管苗高度对生根的影响41-42
3.4.6 糖源及蔗糖浓度对生根的影响42-43
3.4.7 继代时间对生根的影响43-44
3.5 试管苗驯化及移栽44-48
3.5.1 不同湿度对驯化成活率的影响44
3.5.2 不同栽植方式对驯化成活率的影响44-45
3.5.3 不同规格的试管苗对驯化成活率的影响45
3.5.4 不同光照强度对驯化成活率的影响45
3.5.5 不同基质处理对试管苗成活率的影响45-46
3.5.6 不同移植条件处理对驯化苗移植成活率的影响46
3.5.7 不同基质条件处理对驯化苗盆栽移植成活率的影响46-48
4 讨论48-51
4.1 美国红护试管苗褐变与调控48-49
4.2 美国红护试管苗生根问题49-50
4.3 对本试验工作下一步的建议50-51
5 结论51-53
参考文献53-58
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　　摘 要： 本文综述了大樱桃矮化砧木组织培养及脱毒技术研究进展，重点对樱桃矮化砧木GD-1、GD-2外植体的初代培养、增殖培养、生根培养等环节进行了研究，也对樱桃茎尖脱毒技术进行了研究。以大樱桃嫩梢芽为外植体进行茎尖组培脱毒研究，结果表明：(1)筛选出的增殖培养基为MS +6&B A1.0 mg/L +NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，丛生芽增殖数达到6个以上。确定良好的生根培养基为1/2MS+IBA0.7mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂3.5g/L，生根率可达75.1%。(2)外植体进行暗培养能提高生根率，生根率达到了73%，而对照仅有57%，单株根数也从1.2条增加到了1.7条。(3)采用特异引物的RT-PCR扩增方法，对3个大樱桃品种进行了李坏死环斑病毒(PNRSV)的检测。结果表明，0.5～0.8mm 茎尖培养对李坏死环斑病毒(PNRSV)的脱毒率达78.5％；0.5mm 以下茎尖培养对PNRSV 的脱毒率达 93.3％，证明大樱桃试管苗0.5mm 以下的小茎尖培养能有效脱除 PNRSV病毒。
　　关键词： & 大樱桃； & 矮化砧木； & 组培快繁； & &脱毒技术
　　Rearch On Tissue Culture Rapid Propation Technology And Virus-free Of Sweet Cherry Dwarfing Rootstocks
　　Abstract: The paper summarized research progress on tissue culture rapid propagation and virus-free of sweet cherry dwarfing rootstocks, mainly studied crucial technology of propagating, rooting, acclimatizating and transplanting on tissue culture of the sweet cherry dwarfing rootstocks GD-1.GD-2, elementarily discussed on virus-free of cherry. The results indicated：(1)The culture medium of MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2 mg/L +sucrose 30g/L+agar 6.5g/L was screened out used to differentiate and multiply and differentiating quantities of buds up to more 6. Meanwhile, the inducing rate on culture medium of 1/2 MS +IBA 0.7mg /L +NAA0.2 mg/L+sucrose20g/L+agar3.5g/L being responsible for root growth up to 75.1% was accounted for the optim- umone.(2) The root percentage of shoots of GD-1,GD-2 was improbed by a dark treatment of explants. (3) Total RNA, isolated from three sweet cherry cultivars, was used as template to amplify PNRSV by polymerase chain reaction (PCR). The results showed the virus-free rate of PNRSV is 78.5% on 0.5～0.8 The virus-free rate of PNRSV is 93.3% less than 0.5mm shoot tip, it was proved that PNRSV could be elimin -ated effectively from sweet cherry plantlets in vitro by culture of shoot tip less than 0.5mm.
　　Key word: & S &D &Tissue cultu &Virus-free
　　樱桃（Prunus）为蔷薇科樱属（Cerasus Mill.）的落叶乔木。樱桃属植物有100余种，主要的栽培种有中国樱桃（Prunus pseudoerasus Lindl.）、欧洲甜樱桃（Prunus avium L.）、欧洲酸樱桃（Prunus cerasus L.）和毛樱桃（Prunus tomentosaThub.）四个种[1,2]。甜樱桃（Prunus avium L.）即欧洲甜樱桃，又称西洋樱桃、大樱桃，原产欧洲及小亚细亚一带，德、意、法、美、英等国栽培面积较大。我国于19世纪70年代通过传教士、船员等引入烟台[3]，20世纪以来，栽培面积陆续扩大，全国各地竞相扩大栽培，发展潜力很大。大樱桃是世界上广泛栽培的果树之一，在我国落叶果树中是继中国樱桃之后成熟最早的果品，是调节淡季市场的佳品。由于大樱桃外观鲜艳、济效益较高，品质好、成熟早、营养丰富、耐贮运，因此，栽培的经济效益较高，近几年得到了较快的发展。
　　1.1 国内外大樱桃矮化砧研究利用现状
　　大樱桃繁殖主要依靠嫁接繁殖，由于受到砧木问题的制约，限制了大樱桃的生产和发展。由于用中国樱桃、酸樱桃作砧木嫁接大樱桃品种存在许多弊端，例如：
　　①、树体高大（最高可达15m）难管理，&樱桃好吃熟难采&，不利于保护地栽培。
　　②、栽植前期易旺长，成花难，结果晚，进入盛果期需7-8年。
　　③、不抗根癌病、流胶病、西方X病和树干溃疡病，抗逆性差。
　　④、后期生长衰落快，产量低，品质差。因此，由于矮化栽培因具有结果早、品质好、管理方便、品种更新快等优点，已成为果树业发展的趋势。
　　上世纪60年代英、德等国把选育大樱桃的矮化砧木列入了研究计划并付之实施，70年代以后各国陆续推出矮化砧木品种（或品种系列），美国专门成立了一个NC-140基金来研究大樱桃砧木的矮化作用及生产繁育最早是英国的东茂林试验站推出的大樱桃半矮化砧木考特（Colt）；随后许多国续推出矮化或半矮化砧木系列：如意大利的CAB系列 、法国的Edabriz系列、捷克和波兰的P-HL系列、丹麦的DNA系列、比利时的GM系列、美国的M&M系列、俄罗斯的VC-13和VSL-2、罗马尼亚的IP-CI系列、德国的Pi-Ku系列、Weiroot系列、Gisela系列[5]等等。20世纪90年代初，西方园艺发达的国家新建的大樱桃园已普遍采用矮化或半矮化砧木。
　　由于矮化或半矮化砧木的应用，大樱桃的树高从过去的10m以上控制在4m左右,种植密度从每公顷300余株增加到825～1245株，进入结果期由过去的4-5年缩短为3年；进入丰产期由过去定植后7-8年缩短为5-6年，大大减少了管理用工和农药的用量，缩短了资金的回收年限，提高了经济效益 [6]。利用矮化砧木实行密植栽培是实现果树早实、丰产、优质、高效重要措施，这在我国苹果生产上已经取得了巨大的成功，但在大樱桃上尚处于起阶段。
　　1.2 樱桃及砧木植物组织培养研究
　　植物组织培养萌芽于20世纪初，1943年White提出了植物细胞全能性学说，使植物组织培养开始形成为一门新兴学科。20世纪50年代以来，植物组织培养得到了迅速的发展，广泛应用于生物学和农业科学，在农业生产上发挥了巨大的作用。我国植物组织培养研究工作始于30年代初，1931年李继侗培养银杏的胚。年罗宗洛进行了玉米根尖离体培养。其后，罗士韦进行了植物幼胚、根尖、茎尖和愈伤组织的培养。70年代以来，我国开展了植物花药培养单倍体育种，并在植物组织培养方面进行了大量的研究，取得了一系列的举世瞩目的成就，不少研究成果已走在世界的前列，我国的植物组织培养水平居世界领先地位 [7]。
　　樱桃组织培养技术始于 20 世纪 70 年代末，以茎尖、茎段、子叶、根尖、和花器官等器官作为外植体进行离体培养，是樱桃组织培养中一个主要的方面。同时，对胚培养、细胞悬浮培养和胚状体的诱导也进行了初步的研究；近些年，在组织细胞培养物的超低温保存以及基因工程方面也取得了一些进展。目前植物组织培养方面应用最多、最广泛和最有效的是脱毒和离体快繁，利用组织培养快速繁育砧木苗的方法大致分为培养材料的选择与灭菌、培养基的选择、芽分化与增殖继代、诱导生根和移栽等阶段。
　　樱桃茎尖组织培养是建立组织培养程序中一种简单易行的方法。采用茎尖培养进行快繁，繁殖系数高，成苗快，苗木整齐、一致、质量好。有关研究者先后对樱桃4个种的众多品种及变种进行了茎尖离体培养。首先是意大利的Ancora、Benvenuto、Roselli等(1982)将樱桃砧木F12/1无性系的茎尖分生组织接种于MS培养基上，然后扩繁、生根并移栽，成功地获得植株。Isac(1983) [8]、Swir(1983)先后利用酸樱桃的茎尖进行大量离体繁殖。Wilkins、Dodds(1982)研究分析了9种生长调节剂对樱桃茎尖的生长和扩繁的作用，试验表明BA和IBA能促进茎尖的增殖倍数，而 KT、ABA、GA3和乙烯抑制生长，IAA、NAA、2,4-D也能提高扩繁系数。Dradi、Vito、Standardi(1996)对马哈利樱桃(Prunus　mahaleb)的11个不同生态型樱桃的茎尖进行离体培养，平均增殖系数是3.4，然而不同生态型植株的生根率和增殖系数变异都很大[9]。Buzkan、Cetiner、Yalcin-mendi等(1997)对酸樱桃和大樱桃砧木茎尖离体培养的季节进行了研究，结果显示，春季茎尖分生组织成活率最高，夏季细菌污染率比较高，秋季的成活率最低。
　　韩东生、吴绛云、郭淑元等（1993）对樱桃砧木Colt的茎尖培养和快速繁殖进行了研究，并对茎尖培养过程中的愈伤组织进行分离培养，获得绿色苗端，再将苗端分离培养诱导分化，实验同时获得了由茎尖腋芽原基发育增殖的幼苗和由愈伤组织再分化出的幼苗，继代增殖中使用激动素KT(0.5～1.0毫克/升)代替细胞分裂素BA(2.0毫克/升)可消除丛状苗的黄化现象，并促进芽的伸长。随后，韩文璞（1994）[10]对大樱桃茎尖离体培养和快速繁殖进行了研究并建立了高效的扩繁体系。王然、戴洪义、周爱芹（1994）对矮樱桃（中国樱桃）茎尖组培进行了研究，实验发现活性炭对试管苗的根长和侧根量有明显的促进作用。姜淑荣、王际轩、刘志等(1996)对简化Colt砧木茎尖组培快繁技术作了研究。伍克俊、苟永平、贾福明(1997) 研究了不同浓度IBA和IAA组合对大樱桃茎尖脱毒无根苗诱导生根的影响。
　　孙清荣、孙洪雁、赵红军(2000)中国樱桃抗病毒选系试管苗为试材,研究了基本培养基、IBA、蔗糖、光暗培养4个因素,结果表明基本培养基、IBA和光暗培养是影响试管苗产生不定根的主要因素。生根的基本培养基为1/4MS，认为减到1/3～1/4,能把生根率提高10%以上。陈君帜、李青、孙钊(2003)以中国樱桃半野生种对樱茎尖为外植体研究发现，外植体种类、茎尖大小及抗氧化剂维生C均影响茎尖初代培养成活率，0.5mm及1.0mm茎尖培养成活率均极显着高于0.3mm茎尖，0.5mm与1.0mm茎尖之间差异不显着。初代培养取0.5mm茎尖接种为宜[11]。因为马哈利樱桃极耐寒，不传播Buckskin病，受根癌病、萎蔫病和细菌性溃疡病危害较轻，与大樱桃等嫁接的亲和力强，接口愈合良好，生长健壮，抗旱、抗寒、耐瘠薄，且抗根头癌肿病，作为优良砧木，市场潜力巨大，张志勤、肖娅萍和王喆之(2004)以马哈利樱桃（Cerasus　mahaleb），进行了茎尖培养快繁。
　　1.3 樱桃脱毒技术及检测研究进展
　　由于病毒对樱桃危害的严重性，世界各国对病毒病害的研究和防治都极为重视，目前主要采用脱毒技术以获得脱毒苗。欧美各国已在明确病毒种类的基础上，制定出了较为完善的病毒病防治措施，并已证明栽培无病毒苗木既可有效地防治果树病毒的危害，也可显着地提高果品的产量和质量，是一项行之有效的先进技术[13]。覃兰英等经观察发现，樱桃脱毒苗生产上表现出以下特点：苗木生长健壮整齐，结果早，果实成熟期比对提前5～10天，果实个头增大近1倍以上，果品总产量提高20～60%，果实品质所改善，可溶性固形物含量稍高，果实着色度大于对照，经济效益增加1倍以上。获得脱毒苗的基本方法有4种：茎尖培养、茎尖微嫁接、热处理、化学处理。
　　White(1934)和Limasset等(1949)研究表明，病毒浓度呈梯度变化，病毒粒子随植物组织的成熟而增加，旺盛生长的根尖、茎尖很少有病毒分布。Morel等(1952)首次通过茎尖培养成功获得脱毒的大丽花[14]。以后茎尖培养相继用于桃、樱桃、樱花、豆樱、山樱花等植物脱毒。茎尖的成活率和脱毒率是茎尖脱毒培养的两个关键环节。褐化是降低茎尖培养成活率的首要原因。茎尖大小、取材季节、培养方式、激素浓度、基本培养基、培养基添加物都对茎尖褐化有影响。茎尖越小，褐化越严重。同等大小茎尖休眠季节取材、液体培养、添加低浓度激素成活率高于休眠前期或生长期取材、固体培养、添加高浓度激素。桃、樱桃、杏的茎尖在F14，MS,LG培养基上培养，结果3个树种在F14培养基上成活率均高于MS,LG。应用抗氧化剂AC和Vc对茎尖培养的褐化现象可有效抑制[15]。茎尖大小、细胞分裂素浓度、继代次数影响脱毒率。不同植物种类和病毒无毒茎尖长度不相同。高浓度细胞分裂素结合多次继代可提高脱毒率。在草莓上应用二次茎尖脱毒可有效提高脱毒率，该方法可尝试用于李属植物脱毒。
　　采用各种办法获得的脱毒苗，必须经过严格的病毒检测确定脱毒才能推广应用。危害李属的几种主要病毒在侵染寄主后，经过各种脱毒处理，表现症状极轻微，或不表现任何症状，必须借助于其他手段来鉴定。目前常用的检测技术包括指示植物法、酶联免疫法、分子生物学技术。电镜技术应用较少。
　　1.4 本试验研究目标与方向
　　虽然目前国内外有关樱桃组培快繁的报道很多，但是由于试管苗的驯化移栽程序要求过于严格，基质的各种处理措施以及环境条件的控制费时费工，以至于试管苗的生产成本高，实用性不强，在生产上很难进行广泛推广。本试验对大樱桃矮化砧木组培快繁的几个关键技术进行深入的探讨。重点包括:通过应用不同的生长调节物质处理，创造适宜的试管微环境，来摸索脱毒樱桃矮化砧木外植体快速与高效生根技术；矮化砧木与品种试管苗茎尖脱毒技术及检测。
　　2 材料与方法
　　2.1 试验材料
　　材料选用从美国引进的樱桃矮化砧木GD-1和GD-2(吉塞拉系列)和从意大利引进的脱毒半矮化砧木ZY-1为对照。
　　2.2 试验方法
　　2.2.1 外植体的消毒
　　取GD-1、GD-2、ZY-1品种一年到两年生的休眠枝条，放入培养箱，经后取其萌发的嫩芽。先将外植体用洗涤剂水浸3min后，流水冲洗60～90min，然后用70％酒精浸泡30秒，无菌水冲洗8次后，用0.1％升汞(HgCl2)灭菌，一般灭菌5～8min。
　　2.2.2 茎尖脱毒
　　灭菌后剥取生长点，利用解剖针在解剖镜下剥除顶芽及侧芽外部鳞片、幼叶和叶原基，使生长点露出，然后切下顶端1.5mm以下生长点分生组织部分（设3个处理，每处理30株，见表5），作为培养材料，用无菌滤纸吸干，接种于初代培养基上。初代培养基为MS +6- BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，调节pH值至5.8，培养温度25℃，光照强度2000lx～3000lx，每天光照14h。
　　2.2.3 试管苗的增殖培养
　　将丛生芽或带1～2个芽的茎端转入增殖培养基上增殖，增殖培养基为MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.3mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，设10个处理，3次重复，培养40d后，统计芽苗分化率。
　　2.2.4 试管苗的生根培养
　　丛生芽在增殖培养基上生长到2～3周后，取苗高2.0cm以上的新梢转移到生根培养基上进行诱导生根。生根培养基为1/2MS+IBA0.2～1.4mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，设6个处理，3次重复；1/2MS+IBA0.3～1.0mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，设7个处理，3次重复，培养20d后，统计芽苗生根率。
　　另外将2cm左右高的GD-2外植体接种于生根培养基中，在人工气候箱内黑暗的条件下培养一周，再置于正常的光照条件进行生根培养。设4个处理每处理30株（见表4），40天后调查生根率和单株根数。
　　2.2.5 脱毒苗的RT-PCR检测
　　取大樱桃坏死环斑病毒(PNRSV)的带毒叶片、非带毒对照的叶片和试管苗（每处理取30株）的叶片冰冻于-70℃冰箱中，备用。以指示植物法摩擦接种后具有典型坏死环斑症状的带毒叶片的总RNA为阳性对照，以指示植物法摩擦接种后无典型坏死环斑症状的非带毒叶片的总RNA为阴性对照。对大樱桃试管苗茎尖分生组织培养进行RT-PCR检测。
　　3 结果与分析
　　3.1 不同培养基对大樱桃试管苗生长的影响
　　3.1.1 试管苗增殖中的激素配比对生长的影响(加0.5mg/L的GA)
　　表1 试管苗茎段增殖中的激素配比对生长的影响(加0.5mg/L的GA)
　　从试验结果(表1)看，樱桃试管苗茎段增殖以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4 mg/L为培养基的茎段增殖效果最好。实验中发现，基部有少许愈伤的茎段生长一般较好。以MS+6-BA1.0 mg/L+IBA0.5 mg/L为培养基的茎段带愈伤茎段转入培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L后生长停止，再转入以MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L为培养基的茎段生长变化不大，成活但生长停滞。培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L 直接转入培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA 0.2 mg/L有少量腋芽长出。培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L 所接茎段成活但长得慢可能是由于IAA的作用没有NAA强烈。以MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.2mg/L+GA为培养基的茎段茎段叶柄拿掉后的伤口处长出愈伤组织，培养基MS+6-BA0.8mg/L+IBA0.2mg/L+GA去除赤霉素后，接带芽茎段生长良好，也健壮，叶柄处无愈伤,但茎段切口处有愈伤组织包被形成。可能是赤霉素有促进愈伤组织的形成，但叶柄处过多的愈伤组织影响了腋芽的萌发生长。培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L细胞分裂素和生长素二者浓度都较高，比值也较高，因此腋芽萌动生长快。
　　3.1.2 IBA和NAA对试管苗生根的影响
　　表 2 不同浓度的 IBA 对大樱桃生根的影响
　　实验中发现，继代增殖的试管苗转入生根培养基的试管苗26天后已有七条1.5cm长的根。表2结果表明，用IBA诱导生根时，其最佳处理浓度为1.0mg/L。IBA在0.2～1.0mg/L 的范围内，随浓度增加、生根率及平均株高均增加，且在IBA浓度为1.0mg/L时达最大值，生根率及平均根长分别为51.6％及3.4cm，当IBA浓度超过1.0mg/L时，生根率及平均根长有所下降，IBA浓度为1.4mg/L时，生根率仅为20.3％，仅比IBA0.2 mg/L的生根率增加3.2％。
　　表 3 不同浓度 NAA 和 IBA 组合对大樱桃幼苗生根的影响
　　从表3可以看出，生根培养基中激素的种类和用量，对生根的影响较大，以MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.2mg/L为生根培养基时，生根率最高，可达75.1％。试验中发现，转入生根培养基10d左右，幼苗基部出现多个瘤状小突起，进而长出幼根，20d后根可长到3cm左右，根系生长健壮且柔软不易折断，根系洁白正常。
　　3.2 暗培养对试管苗生根培养的影响
　　表4暗培养对樱桃矮砧外植体GD-2生根的影响
　　本试验将生根难的GD-2外植体接种于几个效果较好培养基上，进行一周的暗培养，结果(表4)发现，不同培养基中的外植体进行暗培养后，都能明显地提高生根率，增加单株根数。其中处理为l/2MS+NAA0.3mg/L+IAA1.0mg/L的外植体经过暗处理后，生根率达到了73%，而对照仅有57%，单株根数也从1.2条增加到了1.7条。
　　3.3 试管苗的脱毒检测
　　表 5 外植体大小对大樱桃病毒脱除效果的影响
　　检测大樱桃茎尖分生组织培养脱去PNRSV的结果（表5）发现，0.5mm以下小茎尖的脱毒率为93.3%，0.5～0.8mm则脱毒率为78.5%，0.8～1.5mm脱毒率仅为54.3%。茎尖愈小脱毒率愈高的原因是：小茎尖分生组织尚未形成微管束，病毒无法感染。0.5mm以下的小茎尖分生组织培养脱除病毒较彻底。
　　4 结论与讨论
　　4.1讨论
　　4.1.1 不同培养基对试管苗增殖培养的影响
　　一般樱桃组织培养多以MS为基本培养基，且不同外植体、不同激素和配比对樱桃芽分化有不同的效果。由于茎尖对激素反应更敏感，且其本身又有较高的内源激素水平，因此，在不同研究者的结果中，适合其分化生长的外源激素浓度差异较大。通过试验筛选出增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L，丛生芽增殖数达到6个以上。
　　4.1.2 不同培养基对试管苗生根培养的影响
　　樱桃茎尖脱毒培养在生产上的应用和推广前景广阔，但樱桃试管苗生根较难，生根率最高者仅达75.1%，试验中发现不同品种之间差异较大，分析原因主要与培养条件和取样时间制约，也可能与樱桃成熟植株本身的发育阶段有关，基因型可能是主要差异原因。确定良好的生根培养基为1/2MS+IBA0.7mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，生根率可达75.1%。
　　4.1.3 暗培养对试管苗生根培养的影响
　　外植体进行暗培养能提高生根率，究其原因是暗培养一方面能增加天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸等游离氨基酸的含量，促进细胞的脱分化;另一方面可以抑制生长素的光氧化作用，提高生长素的含量和活性。
　　4.1.4 试管苗的茎尖脱毒技术研究
　　病毒浓度呈梯度变化，病毒粒子随植物组织的成熟而增加，旺盛生长的根尖、茎尖很少有病毒分布。茎尖愈小脱毒率愈高的原因是：小茎尖分生组织尚未形成微管束，病毒无法感染。0.5mm以下的小茎尖分生组织培养脱除病毒较彻底。
　　4.2 结论
　　本试验结论如下:
　　1. 筛选出的增殖培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA30.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂 7g/L，丛生芽增殖数达到6个以上。确定良好的生根培养基为1/2MS+IBA0.7mg/L+NAA0.2 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，生根率可达75.1%。
　　2. 外植体进行暗培养能提高生根率，生根率达到了73%，而对照仅有57%，单株根数也从1.2条增加到了1.7条。
　　3. 采用特异引物的RT-PCR扩增方法，对3个大樱桃品种进行了李坏死环斑病毒(PNRSV)的检测。结果表明，0.5～0.8mm 茎尖培养对李坏死环斑病毒(PNRSV)的脱毒率达78.5％；0.5mm以下茎尖培养对PNRSV的脱毒率达93.3％，证明大樱桃试管苗0.5mm以下的小茎尖培养能有效脱除PNRSV病毒。
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