鱼饲料表观消化率测定方法的综述
黄小燕 吴天星摘 要 消化率是评价饲料营养价值的重要指标，也是确定日粮配方的依据。由于鱼所生长环境的特殊性，使得测定鱼的消化率比较困难。体外测定法主要采用酶解法，而体内测定法主要采用间接指示剂的方法进行测定，以酸不溶灰分（AIA）、 Cr2O3、Y2O3、La2O3 、Yb2O3为指示剂测定表观消化率，不同的指示剂在不同的鱼、不同的饲料中其测定值的精确性有较大的差异。文中简要的介绍了3种体外测定方法并重点叙述了指示剂的使用，为鱼消化率测定方法提供参考。关键词 表观消化率；鱼；指示剂；测定方法中图分类号 S816.17消化率是动物所摄取的饲料成分中，可消化养分占食入饲料养分的百分率。水体环境的特殊性决定了鱼消化率测定的特异性和复杂性，因此选择准确、简便的消化率测定方法对评价鱼饲料的营养价值有重要意义。1 体外消化法体外消化法主要是以商品酶或试验鱼的粗酶提取液作为消化酶，模拟鱼体消化环境进行体外消化。虽然体外消化法不能反应体内的真实消化情况，但其测定值与体内测定值有一定的相关性，而且操作简便、 快速、成本低，对确定日粮配方提供极其有用的参考。1.1 常规酶解法常规的体外酶消化方法为二步酶解：先将试验饲料在pH=2的胃蛋白酶缓冲液中酶解2h后转移到pH=8的蛋白复合酶的缓冲液中继续振摇酶解24h，再加入10%的三氯醋酸沉淀未被酶解的蛋白及多肽，离心或过滤得到的残渣即为不被消化物[1，2]。1.2 透析法由于在传统的封闭体系内进行体外消化过程中，随消化时间的延长，消化产物不断积累，对酶解产生抑制作用，而透析法则克服了产物的抑制作用，透析膜的透析作用模拟了小肠的吸收作用。黄瑞林等（1999）[3]试验证实随着透析液的增加粗蛋白的消化率升高，且用此法测得的体外表观消化率与体内消化率的相关系数为0.999，席鹏彬等（2003）也证实，用体外透析法测得菜粕蛋白体外消化率与体内表观消化率显著相关[4]。1.3 pH值测定法由于蛋白在水解过程中肽键断裂释放质子，因此可利用pH变化测定蛋白水解程度。pH值测定技术分为两种，pH下降法(pH drop)及pH恒定法（pH stat）。pH下降法是将底物与酶混合物在pH=8的环境下酶解10min后测定pH的下降[5]。恒pH法克服了由于pH下降而导致的酶活性降低的缺点，它利用全能电位滴定仪随酶反应体系pH的变化不断向反应体系中滴加0.1M的NaOH，保持体系pH不变，根据滴定所用的NaOH的体积计算样品蛋白水解率[6]。蛋白水解率（%）=[（B×Nb×1.5/M×（S%/100））/8]&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& ×100%式中：B ――NaOH滴定体积（ml）；&Nb ――NaOH浓度；&M ――样品质量（g）；& S ――样品蛋白含量。体外消化法操作简便，适用于对商品原料及饲料营养价值的评定，尤其是pH测定法，不仅简便快速，与体内消化的相关性也在0.7～0.9之间[5，7]。但是，体外消化法也存在一些不足，首先体外的消化环境与鱼体的环境有较大的差异，其次所用的体外消化酶特异性与鱼肠道酶存在差异，这导致体外测定值可靠性差。2 体内消化法体内消化法就是饲给鱼试验日粮，由消化不了而从粪中排泄出的粪量测定饲料在鱼体内的消化率。粪中所出现的成分不仅是饲料的不消化成分，还混有在消化过程中从体内所分泌的消化液以及由消化道脱落的上皮细胞、肠内细菌等成分，通常我们所测的饲料的消化率都不考虑内源的代谢物，即表观消化率（Apparent digestibility,AD）。AD（%）=[（摄取饲料中的成分-粪中的排出成分）&&&&&&&&&&&&&&&&&& /摄取饲料中的成分]×100%2.1 直接法又称总粪收集法，就是测量动物总的饲料食入量以及排出的动物粪量求得消化率。直接法必须正确测定饲料的摄取量和粪的排出量，这在水体进行非常困难，首先总粪收集法的工作量大，其次在水体中准确回收未被采食的饲料比较困难。为了使测定值更加准确，需要进行养分流失校正，即通过计算未被采食饲料溶于水的部分以校正实际采食量。Smith（2004）[8]研究表明，用全粪收集法测定虾的消化率值，其变异系数明显小于以Cr2O3为指示剂的测量值，说明全粪收集法能比较稳定、精确的反映消化率值。但全粪收集法工作量大，已逐渐被间接法所取代。2.2 间接法目前所用的间接法有指示剂法、同位素标记示踪等方法。同位素示踪法需要在饲料中添加放射性同位素标记，出于安全的考虑很少采用此方法。指示剂法就是用饲料中存在的或人工均匀掺入的指示剂 ，饲喂鱼后从单位饲料和粪中所含单位指示剂的量求算消化率，消化率的计算式表示如下：AD（%）={1-[（粪中养分的含量/饲料中某成分的含量）×（饲料中指示剂的含量/粪便中指示剂的含量）]}×100%指示剂法不需精确计算鱼的采食量，也不需收集全部的粪，而是以饲料和粪中的指示剂浓度为基础来算消化率，所以必须在粪中的指示剂浓度达到稳定之后再测定，一般的试验饲喂鱼6～9d后开始收集粪。2.2.1 外源指示剂法人工加入的指示剂称外源指示剂。作为外源指示剂需满足如下要求：①能以较低的浓度与饲料均一混合，能简便、准确的进行分析；②不可被试验动物消化，不影响动物的正常代谢；③在肠胃中移动的速率与饲料中营养物一致；④对人和环境没有影响。目前广泛使用的是Cr2O3、Y2O3和Yb2O3，此外还使用La2 O3，TiO2，Dy2O3，Er2O3，Eu2O3，Gd2O3，Ho2O3，Lu2O3等。使用外源指示剂的关键是指示剂在饲料中必须分布均匀，外源指示剂与饲料混合的均一性直接影响测定的消化率的准确性，外源指示剂混合前要通过100目以上的筛，充分混合后抽查检查，其混合均匀度的变异系数要小于5％。Smith（2004）等人采用再次粉碎的方法：将混合好的料加脂和水， 通过模孔制成粒风干后再次粉碎后过0.500mm的筛， 加水形成面团状过模孔制粒。 这样制得的饲料营养物的均一性显著提高，如铬的分布差异值由原来的12.3％降为2.5％[7]。提高指示剂在饲料中的均匀度对提高实测消化率值的精确性有重要的意义。Cr2O3是使用较多的外源指示剂，一般的添加量在5 000mg/kg左右，具体的添加量根据分析仪器进行调整。如Neto HB，（2003）[9]的研究表明，在饲料中添加浓度分别为(0.01%， 0.02%， 0.03%， 0.05%， 0.1%， 0.2%)的Cr2O3为指示剂，以硫代二苯基卡巴肼分光光度法检测饲料和粪中的含量，结果各组饲料的消化率测定值无显著差异，说明采用精确的分析方法则Cr2O3添加量可相对减少。饲料和粪中铬含量的测定方法有：①原子吸收光谱法[19]：将采集的粪混匀，称取1g左右的干样品置于硅酸盐试管中 100℃干燥24h，然后在马福炉中使之灰化，375℃下48h。冷却后加0.20ml去离子水，0.20ml 1N HCl并加热到90℃，若样品还有黑色颗粒则，每隔10～15min滴加50%H2O2直到黑色的颗粒完全消化，干燥。再用1N HCl稀释，用原子吸收光谱进行铬含量测定；②Austreng （2000）[11]采用ICAP光谱进行铬含量的测定，用这种方法的原理与AAS的原理一致，取150～200mg的样品，放入液闪瓶中高温灰化，冷却后加入5ml浓HCl、HNO3混合液（2：1）进行煮沸消化，溶液变为无色后停止消化，冷却加入少量水，再加入1.25ml浓HNO3，定容至25ml用于分析；③二苯胺基脲比色法，根据张爱华（1999）[12]测定方法，称取样品1g ，置蒸发皿中， 加入20 %碳酸钠溶液5ml ,使充分浸润,先低温炭化,待浓烟挥尽，移入580℃高温炉中灰化成白色灰烬,冷却,用25ml 水分次洗入150ml 三角瓶中,加2%高锰酸钾溶液5滴,使成紫红色,煮沸5～10min ,煮沸过程中应保持溶液呈紫红色,否则应补充2%高锰酸钾溶液。然后沿瓶壁加入乙醇2ml，继续加热至溶液变为黄棕色,冷却,用5mol/l 硫酸调节溶液呈酸性(pH=1～3) ,摇匀并过滤于50ml 容量瓶中,用水洗涤三角瓶和滤纸,合并滤液。溶液经Cr3+定性检查已不显色,证明Cr3+完全转化为Cr6+。加入2.5ml 二苯胺基脲溶液摇匀,加水至刻度,10 min后于（540±1）nm 波长处测定其吸收度。用此法还需测定标准溶液的吸光值，绘制标准曲线。2.2.2 内源指示剂法内源指示剂是指饲料本身所固有的不被动物消化的物质，不会对鱼体消化吸收过程产生任何不良影响，安全可靠，如AIA、粗纤维等。AIA的主要成分是硅酸盐，当饲料中的AIA含量过低时，可通过添加硅藻土来增加其酸不溶灰分的含量以测定消化率值的准确性。Goddard （2001)[13]在含有0.72%的酸不溶灰分的罗非鱼基础日粮中分别添加0.5％硅藻土、0.5％Cr2O3，以不添加外源指示剂的为对照组进行饲养试验，分别以0.5％硅藻土+0.72%AIA、0.5％Cr2O3、0.72%AIA测得的消化率值之间没有显著的差异，并且添加硅藻土可以显著减小测定值的变异系数，对照组只用0.72%AIA为指示剂，消化率的CV为5.6％，而试验组以（0.5％硅藻土+0.72%AIA）为指示剂测得的消化率值的CV减少到2.1％。但是，也有报道指出AIA测得的消化率值很不稳定，Morales（1999）[14]以AIA为指示剂测定虹鳟的消化率值高于Cr2O3的测定值，而Perera（1995）[15]测定虹鳟的消化率值低于Cr2O3的测定值。而且内源指示剂方法测定消化率所需要采集分析的粪量较大（5～10g），对于网养的鱼常用肠道挤压法采粪，这样用AIA法分析就不合适。3 影响消化率测定值的因素3.1 指示剂的选择Vandenberg （2001）[16]、Jones （1998）[17]指出不同的指示剂、 不同的粪收集方法测得的消化率值有较大的差异。 Brown（1986）[18]、Forster（1971）[19]报道，Cr2O3在龙虾肠内移动路径与营养物不一致，而且由于小龙虾对Cr2O3的有选择排斥行为，小龙虾实际摄入的Cr2O3的量低于相应饲料中总的Cr2O3的量，即计算的消化率值要低于实际值。此外，Hanley（1987）[20]和 Bowen（1978）[21]在莫桑比克罗非鱼中发现，在肠道中消化移动过程中可能使Cr2O3与食物分离，测得的鱼消化率存在误差。Shipton （2001）[22]研究表明Cr2O3在鲍鱼肠道中移动速率与蛋白的移动速率一致， Ishikawa（1996）[23]的研究也得出一致的结论。Austreng （2000）[11]研究发现Y2O3、 La2O3 、Yb2O3 可代替Cr2O3作为内源指示剂。不同的饲料原料适用不同的指示剂， Morales（1999）[14]在虹鳟的饲养试验中发现以玉米筋、棉籽、鱼粉为蛋白源的饲料，粗纤维和Cr2O3为指示剂测定值接近。但对于以豆粕、葵花籽为蛋白源的饲料，粗纤维为指示剂的测定值显著的低于Cr2O3的测定值。因此对于不同的饲料不同的试验对象应根据实际成分选用合适的指示剂。 3.2 粪的收集Shipton （2001）[22]将鲍鱼的粪分为三类，第一类，深绿色的有包膜的完整颗粒；第二类，颜色较浅，包膜不完整的颗粒间形成块状；第三类，淡绿色，无规则形状，包膜于粪混杂在一起。测定结果表明，第一类粪能比较准确的代表饲料总的消化率，若采用第二类和第三类粪进行消化率分析则测定的消化率值偏低，具体的机理尚未清楚。因此，采集粪时尽量取包膜完整的粪颗粒。不同的粪收集方法所测得的消化率值也不一致，主要的收集方法有：①虹吸法，发现有粪粒就马上虹吸出来以防养分和指示剂的流失、微生物的污染；②挤压法，将试验鱼麻醉后，轻轻挤压其腹部，尽可能地排除其尿和生殖产物，然后在肝门前3cm处压其两侧，收集粪。挤压法对鱼造成较大的应激，因此此法一般隔5d取粪，网养的条件适用；③解剖法，是试验完成后将试验鱼击晕后取出末端肠道中的粪，周志刚（2004）[24]研究表明，鲤鱼后肠的粪样测得的消化率比前肠及中肠具有代表性。3.3 喂食频率喂食频率也是影响消化率因素之一，因为鱼只有在比较饥饿时才会马上采食，若喂食频率高，则鱼在下次采食时并未饥饿，这不但降低了采食速度，增加了养分滤出量，而且还浪费了饲料。Smith （2004）[8]分别给虾以12h/次、6h/次的频率喂食，以全粪收集和外源指示剂两种方法测定消化率值，结果表明，以外源指示剂（铬、镱）测得的12h/次的试验组的消化率显著的低于6h间隔的试验组，但以全粪收集法测定的消化率值两种饲喂方式间无显著差异。3.4 指示剂用量不同水平的外源指示剂也影响鱼的消化率， Ng WK(1997)[25]认为高浓度的Cr2O3添加量影响饲料的利用率。Shiau (1995)[26]报道，不同水平的Cr2O3能影响罗非鱼营养物的消化率，0.5％Cr2O3添加量的试验鱼的体增重高于2％的添加组，而且随着Cr2O3量的上升，测得的消化率下降。而Shiau（1998）[27]用8种不同含量的(0，2，10，50，100，300，1 000，5 000mg/kg)的Cr2O3，研究其对杂交罗非鱼消化率的影响，其中投喂300mg/kg Cr2O3试验组的鱼体增重、饲料转换率和蛋白质利用率最高，而各组鱼的干物质、脂肪、蛋白质消化率没有什么差异。此外添加Cr2O3量超过100mg/kg的试验组所测得鱼体的灰分高于Cr2O3量小于100mg/Kg的添加组，且随着Cr2O3浓度升高灰分含量升高。3.5 粪收集时间鱼采食后在不同的时间段所排粪是不均一的，周志刚（2004）[28]试验表明鱼体排粪高峰期时间段的粪样能比较准确的代表总体的表观消化率。此外采粪时间的长短也对消化率的测定有影响，一般至少连续收集6d的粪样才具代表性。综上所述，在测定消化率时我们要谨慎的选择指示剂，对于不同的鱼，不同成分的饲料有区别的选择。参考文献1 王卫国，卢萍.7种饲料原料粉碎粒度与蛋白质体外消化率及能耗的研究[J].中国畜牧杂志,）2 罗莉，叶元土.异育银鲫肠道对膨化和非膨化饲料蛋白质的酶解动力学研究. 任泽林，周志刚主编.第三届中国水产动物营养与饲料技术大会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，20043 黄瑞林等.消化法测定饲料蛋白质消失率的适宜酶促反应条件研究.动物营养学报,1999，（11）：51～584 席鹏彬，李德发.体外透析两步酶解法测定菜粕粗蛋白消化适宜酶促反应条件的建立[J].中国农业大学学报，）：88～925 Chong,R. 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②一些常量元素在人体中的作用及每天适宜摄入量
微量元素：在人体中含量在0.01%以下的元素。①一些人体必需的微量元素
②一些必需微量元素对人体的作用及14—18岁人群每天的适宜摄入量
知识拓展：如果人体所需的元素仅从食物中摄取还不足时，可通过食品添加剂和保健药剂来予以补充。如在食品巾添加含钙、锌、硒、锗的化合物，或制成补钙、补锌等的保健药剂或制成加碘食盐，来增加对这些元素的摄人量。但要注意即使是人体必需的元素，也要注意适宜的摄入量，摄人量过高和过低对人体健康都有不良的影响。食品安全（food safety）指食品无毒、无害，符合应当有的营养要求，对人体健康不造成任何急性、亚急性或者慢性危害。根据世界卫生组织的定义，食品安全是“食物中有毒、有害物质对人体健康影响的公共卫生问题”。食品安全也是一门专门探讨在食品加工、存储、销售等过程中确保食品卫生及食用安全，降低疾病隐患，防范食物中毒的一个跨学科领域。&食品污染的类型食品安全问题越来越得到人们的重视，常见的食品污染有如下几类：(1)微量元素中有一些有害元素，在人体内积累会影响身体健康，如铝、铅、汞；(2)过量食用食品添加剂或使用非食品添加剂，如过量使用防腐剂、面粉增白剂、色素、香精，用工业用盐亚硝酸钠加工食品，添加苏丹红等；(3)食品制作过程受到污染，如使用工业双氧水(漂白)、甲醛泡发水产品、用硫黄熏蒸食品等；(4)食用变质原料或食用已被污染的原料制作的食品，如用霉变大米等加工食品。安全购买食品的注意事项：(1)注意看经营者是否有营、业执照，其主体资格是否合法。(2)注意看食品包装标识是否齐全．注意食品外包装是否标明商品品称、配料表、净含量、厂名、厂址、电话、生产日期、保质期、产品标准号等内容。(3)注意看食品的生产日期或失效日期，注意食品是否超过保质期。(4)看产品标签，注意区分认证标志。(5)看食品的色泽，不要被外观过于鲜艳、好看的食品迷惑。(6)看散装食品经营者的卫生状况，注意有无健康证、卫生合格证等相关证照，有无防蝇、防尘设施．(7)看食品价格，注意同类同种食品的市场比价，理性购买“打折”“低价”“促销”食品。(8)购买肉制品、腌制品最好到规范的市场、“放心店”购买，慎购游商销售的食品。(9)妥善保管好购物凭据及相关依据，以便发生消费争议时能够提供维权依据食品添加剂的正确使用原则：为了确保将食品添加剂正确地使用到食品中，一般来说，其使用应遵循以下原则：(1)经食品毒理学霞全性评价证明，在其使用限量内长期使用对人安全无害。 (2)不影响食品自身的感官性状和理化指标，对营养成分无破坏作用。 (3)食品添加剂应有中华人民共和国卫生部颁布并批准执行的使用卫生标准和质量标准。 (4)食品添加剂在应用中应有明确的检验方法。 (5)使用食品添加剂不得以掩盖食品腐败变质或以掺杂、掺假、伪造为目的。 (6)不得经营和使用无卫生许可证、无产品检验合格及污染变质的食品添加剂。 (7)食品添加剂在达到一定使用目的后，能够经过加工、烹调或储存而被破坏或排除，不摄入人体则更为安全。 对人体有害的几种添加剂： (1)吊白块吊白块是甲醛合次硫酸氢钠的俗称，化学式为 NaHSO2·CH2O·2H2O。为白色半透明小块，易溶于水，有漂白作用，是常用的工业漂白剂。但不能作食品漂白添加剂，不法分子用于食品增白，造成了很大的危害。吊白块水溶液在60℃以上就开始分解出有害物质，120℃下分解产生甲醛、二氧化硫和硫化氢等有毒气体。食用了用吊白块漂白过的白糖、粉丝、米线、面粉、腐竹后，可能对人体的某些酶有损害，从而造成中毒者肺、肝、肾器官的损害。 (2)苏丹红苏丹红是一种人工合成的红色染料，被广泛用于溶剂、油、蜡、汽油的增色，以及鞋、地板的增光。苏丹红的化学成分巾含有一种叫萘的化合物，该化合物具有偶氮结构，它具有致癌性，对人体的肝、肾器官具有明显的毒性。我国禁止将其使用于食品中。但不法食品生产企业违规在食品中加入苏丹红，如“苏丹红鸭蛋”。 (3)三聚氰胺 2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉事件，其原因是奶粉中含有三聚氰胺。三聚氰胺的化学式为C3H6N6，俗称蛋白精，是一种有机化合物，被用作化工原料。三聚氰胺对身体有害，不可用于食品加工和作食品添加剂。牛奶和奶粉中添加三聚氰胺，主要是因为它能冒充蛋白质，能提高奶粉中的含氮量。 (4)瘦肉精 “瘦肉精”学名盐酸克伦特罗，是一种平喘药，又称克喘素，本来是用来治疗人的哮喘病，有松弛支气管平滑肌的作用。该药可以增加蛋白质的合成，添加在猪饲料中可以使猪的肥肉明显减少，瘦肉增加，所以有人干脆就称它为“瘦肉精”。 “瘦肉精”进入猪体内后具有分散快、消除慢的特点，其化学性质稳定，加热到172℃时才能分解，一般的加热方法不能将其破坏。“瘦肉精”毒性较强，医学研究表明“瘦肉精”吸收快，人或动物服后15—20分钟即起作用，2—3小时血浆浓度达到峰值，作用维持时间长，一般用20微克就可以出现症状。人食用过量后会出现两手发抖、心慌、头晕、头痛、呕吐、腹泻等不良反应，严重的会危及生命，尤其对高血压、心脏病、甲亢、前列腺肥大等患者，其危害性更为严重。长期食用，有可能导致染色体畸变，会诱发恶性肿瘤。它是一种严重危害畜牧业健康发展和畜产品安全的“毒品”。猪在吃了“瘦肉精”后，其毒性主要积蓄在猪肝、猪肺等处。人在吃了烧熟的猪肝、猪肺后，会出现中毒症状。有毒物质——甲醛：甲醛的化学式为HCHO(或CH2O)，是一种无色、有强烈刺激性气味的气体。易溶于水、乙醇。35％～ 40％的甲醛水溶液叫做福尔马林，具有防腐乐菌性能。可用来浸制标本，但不能用来作食品的防腐剂。甲醛是一种重要的化工原料，主要用于塑料工业、合成纤维及皮革工业、医药、染料等。甲醛具有毒性，能与蛋门质结合，使蛋白质发生变性。体表接触或吸人岛浓度甲醛，都会严重危害人体健康一在家庭生活中，装修房屋使用的黏合剂中含有甲醛。常见的碱的用途：1. 氢氧化钠：是重要的化工原料，广泛用于肥皂、石油、造纸、纺织和印染等工业。实验室中可作干燥剂。2. 氢氧化钙：用于建筑业，制漂白粉，改良土壤。常用于实验室二氧化碳的检验。 &常见盐的用途：1. 氯化钠(NaCl)：作调味品和防腐剂，医疗上配置生理盐水。重要的化工原料碳酸钠(Na2CO3)：制烧碱，广泛用于玻璃、纺织、造纸等2. 碳酸氧钠(NaHCO3)：工业焙制糕点的发酵粉的主要成分，医疗上治疗胃酸过多3. 碳酸钙(CaCO3)：实验室制取CO2，重要的建筑材料，制补钙剂4. 硫酸铜(CuSO4)： 农业上配制波尔多液，实验室中用作水的检验试剂，精炼铜5. 高锰酸钾(KMnO4)：常作消毒剂&
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