第十章 分子生物学技术6_百度文库
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第十章 分子生物学技术6
分​子​生​物​学​技​术​6
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你可能喜欢(1)氢&&&& 变性(2)3′&&&& 四种脱氧核苷酸&&&& 碱基互补配对原则(3)温度&&&& 酸碱度&&&& 缓冲液
请选择年级高一高二高三请输入相应的习题集名称(选填)：
科目：高中生物
来源：2010年黑龙江省哈师大附中高二下学期4月月考生物卷
题型：综合题
（6分）资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的＿＿＿＿键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过&&&&&&&&&&&酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是DNA分子中独特的双螺旋结构和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为＿＿＿＿＿＿。（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（&&&）A．白细胞DNA　B．病毒蛋白质 　C．血浆抗体　D．病毒核酸
科目：高中生物
来源：2013届江苏省高二5月质量检测生物试卷（解析版）
题型：综合题
（7分）资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：
（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的&&&&&&
键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过& &&&&&&&&&&酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
和
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（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为&&&&&&&&&&
。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（&&& ）
A．白细胞DNA&& 　&& B．病毒蛋白质
　&&&& C．血浆抗体&
　&&&& D．病毒核酸
科目：高中生物
来源：2011年江苏省高二年级质量检测生物试卷
题型：综合题
资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：
（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的&&&&&&&
&&&键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过&&&&&&&&&
酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
和&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为&&&&&&&&&&
。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（&&& ）
A．白细胞DNA&& 　&& B．病毒蛋白质 　&&&&
C．血浆抗体& 　&&&&
D．病毒核酸
科目：高中生物
来源：2010年黑龙江省高二下学期4月月考生物卷
题型：综合题
（6分）资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：
（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的＿＿＿＿键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过&&&&&&&&&&& 酶的作用来完成的。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是DNA分子中独特的双螺旋结构和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为＿＿＿＿＿＿。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（&&& ）
A．白细胞DNA&& 　&&&
B．病毒蛋白质 　&&&& C．血浆抗体& 　&&&&
D．病毒核酸
科目：高中生物
来源：2010届广东省梅州市高二理综生物卷
题型：综合题
资料显示，近十年来，PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答：
（1）加热至94℃的目的是使DNA样品的＿＿＿键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过＿＿＿＿酶的作用来完成的。PCR技术中所用的DNA聚合酶与生物体内的DNA聚合酶有什么区别？＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（2）新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子（第一代）放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为＿＿＿＿。
（4）PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可以用PCR扩增血液中的（&&& ）
A．白细胞DNA&& 　&& B．病毒蛋白质
　&&&& C．血浆抗体&&&&
D．病毒核酸分子生物学教案_百度文库
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分子生物学教案
朱​玉​贤​.​第​三​版
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载体构建，测序结果显示目的基因全突变，克隆入T载体，菌液PCR全是假阳性
各位前辈好，本人研一，进入实验室将近一年，最近构建真核表达载体5个，从细胞内trizol法提取总RNA，反转录产物作为模板，用5队特异性引物均能扩出目的片段，胶回收，回收产物琼脂糖电泳检测，双酶切，连接20小时，转化，挑菌各12个，于1.5ml EP管内加入500ul LB，摇混，行菌液PCR，电泳结果均为引物二聚体，反复做了多次，都是这样，第四次的时候出了几个阳性的，测序又显示全突变，，目的基因大小700多bp，PCR用的是艾德莱的 MIX，最后用LA酶扩，测序仍然有突变，关键是，模板是细胞内提取的RNA反转录得到的，怎么会有突变？求指点，谢谢
700bp目的片段不算大，不知道你的全突变是什么意思，是保真性太差还是非目的片段，cDNA没问题的话，建议考虑下rna模板本身的问题 实在不行& &就买那种高保真的酶试试& &比如KOD& &还有一个P开头的 一般情况下700bp的序列很少突变的，你的突变几率这么高，可能是实验出了问题。另一种情况是基因确实因为某种原因突变了，要是这种突变还有某种表型，那就好好好分析一下，大文章就是这么发出来的！ 全突变是什么意思？是根本不是你想要的基因，还是突变率很高？
如果不是你要想要的基因，
cDNA的PCR产物后直接送去测序，如果是你想要的基因，继续往下做。如果不是你想要的基因，请分析PCR产物序列，找出错配的原因，重新设计引物，避开错配。还有就是你选对了细胞系了吗？cDNA是有组织特异性的。建议你用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）去分析下你的基因在哪些细胞系里面表达相对高，具体方法自己去看xpression Atlas官方的帮助文档，不难。
如果是突变率很高，
PCR实验过程中产生的突变率是相当低的，楼上说了，可以换高保真酶，如果换酶注意这个酶能否产生A末端，KOD酶不能产生A末端，不能直接连T载体的。
还有基因有很多variant（变异体），还有可能有不同的transcript（转录本）。它们之间去比较的话，很显然你会得出突变很多的结论。
检测是否连接正确，我有一个简单的方法，比菌落PCR、提取质粒后酶切快捷，经济：
1、挑菌后，摇4h-6h
2、80ul菌液+20ul苯酚（可以自己配置细菌裂解液，我比较懒，直接用苯酚了）+20ul 6x loading buffer
3、震荡后离心，取20ul上清电泳，同时点空质粒做对照。
如果有插入片段的话，会有比空质粒慢一点点的条带。插入片段在500以上，基本上能分清。 : Originally posted by 鬼羽帝魂 at
实在不行& &就买那种高保真的酶试试& &比如KOD& &还有一个P开头的 Pfu？ 第一点，不明白你说的全突变是什么意思，是突变了一个碱基？还是说插入的片段根本就不是你想要的；
第二点，其实你用到的2个酶应该都是Taq类型的，LA别以为是个好东西，你在扩增长片段时有时候确实是能够PCR出来，但是保真就一般般了，所以我从来不用这些玩意，除了他们的BUFF；
第三点，突变不一定就是PCR产生的，因为有可能你的模板就已经是突变了，你说的突变肯定是跟你想要的标准序列有出入，没准会是SNP : Originally posted by DoRbIr at
Pfu？... 好像是的 首先确定是出现两个问题，一个是P不出来，全是二聚体；在一个就是测序发现不是目的片段
问题回答1：出现引物二聚体的原因有很多，有可能是引物浓度太高，一般用0.5um的浓度就够了（50ul体系里加1ul 10um浓度的引物），还有可能是是退火温度太高，试试降低退火温度的效果，再一个就是没有模板。
2、出现测序结果不是目的片段的可能原因，要么就是测序是反向测的，你比对的时候没有把序列反义过来比对，所以比对的结果全是反的，也就是完全对不上号。再或者测序的结果是载体本身的片段，并不是你的目的片段，所以，选择测序引物的时候也要注意用合适的，如果测序引物对于载体的来讲本身就可以P出来几百的片段，那可能你的目的片段根本就没有练上去,P出来的几百的片段实际是载体上的片段 : Originally posted by zep at
700bp目的片段不算大，不知道你的全突变是什么意思，是保真性太差还是非目的片段，cDNA没问题的话，建议考虑下rna模板本身的问题 全突变就是，送去测序的样本都有碱基缺失，并且有点突变 : Originally posted by BioChen at
全突变是什么意思？是根本不是你想要的基因，还是突变率很高？
如果不是你要想要的基因，
cDNA的PCR产物后直接送去测序，如果是你想要的基因，继续往下做。如果不是你想要的基因，请分析PCR产物序列，找出错配的原 ... 多谢，试了你的方法，效果明显，重新用LA高保真酶扩了一次，这次全扩出来了，测序结果也正确，十分感谢提供宝贵的建议！:hand: : Originally posted by lim1896 at
首先确定是出现两个问题，一个是P不出来，全是二聚体；在一个就是测序发现不是目的片段
问题回答1：出现引物二聚体的原因有很多，有可能是引物浓度太高，一般用0.5um的浓度就够了（50ul体系里加1ul 10um浓度的引物 ... 不好意思是我表述的不清楚，是送去测序的时候，目的基因序列有碱基缺失，还有点突变，换了LA酶，重提RNA后，问题解决了，谢谢指点，不胜感激
var cpro_id = 'u1216994';
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