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细胞NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂盒说明书
YIJI细胞NADH氧化酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）&主要用途YIJI细胞NADH氧化酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细胞样品（动物或人体）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特异活性检测。用于免疫、血液研究、蛋白组学、病理生理学等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景&；EC1.6.3.1由6个亚体构成：Rho&GTP酶（Rho&guanosine&triphosphatase）和5个phox（吞噬细胞氧化酶；phagocytic&oxidase）。其中Rac1、其产物具有杀死微生物的功能。异常将导（；）。基于底物（），在特异性抑制（；）的存在下，NADPH的催化作用，转化为氧化型（NADP），产生吸光峰值的变化，通过分光光度仪（340nm波长）检测，来测定的特异活性。&&&产品内容YIJI清理液（Reagent&A）& 毫升YIJI裂解液（Reagent&B）& 毫升YIJI缓冲液（Reagent&C）& 毫升YIJI反应液（Reagent&D）& 毫升YIJI阴性液（Reagent&E） & 毫升YIJI底物液（Reagent&F） 微升YIJI专性液（Reagent&G） & 微升产品说明书 && 1份保存方式YIJIYIJI℃℃YIJIYIJI15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离YIJIYIJIxxYIJIxxYIJIxxYIJIYIJIYJ&3465&YIJI缓冲液（C）室温预热xxYIJIxxYIJIxxYIJIxxYIJI340345&xxYIJIxxYIJIxxYIJI5112340345准备1个1.5毫升离心管xxYIJIG5125放进冰槽里备用xxYIJIxxYIJIxxYIJI上述冰槽里的xx微升含有YIJIG和待测样品的溶液&&340345和非特异活性YIJIYIJI&高低高低，YIJI&YJ（；）氧化分析联系我们关于订购详情，欢迎来电、来函、传真或电邮DD上海一基实业有限公司上海市浦东新区张杨北路5972号200137021-021-主页：www.yijisy.com
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&JoVE Immunology and Infection
生物发光成像的NADPH氧化酶活性在不同的动物模型
1, 1, 2,3, 1
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NADPH氧化酶在巨噬细胞的活性氧（ROS）的主要来源。由于ROS的短暂性的，它是难以衡量和监测中生活的动物的细胞内ROS水平。 ROS在活小鼠的串行量化的一种微创的方法。
Date Published: 10/22/2012, ; doi:
Keywords: , , , , ,
Han, W., Li, H., Segal, B. H., Blackwell, T. S. Bioluminescence Imaging of NADPH Oxidase Activity in Different Animal Models. J. Vis. Exp. (68), e3925, doi:10. (2012).
NADPH氧化酶是一种关键的酶介导的抗菌和抗真菌的宿主防御。 NADPH氧化酶除了其抗菌宿主防御中的作用，具有关键的信令功能，调节炎症反应1。因此，发展的方法来衡量“实时”的动力学NADPH氧化酶衍生的活性氧的产生是一个有价值的研究工具，了解相关的宿主防御，炎症和损伤的机制。 慢性肉芽肿病（CGD）是一种遗传性疾病的特点是严重感染和过度炎症反应的NADPH氧化酶。吞噬细胞的NADPH氧化酶的激活需要易位其胞浆亚基（PHOX，P67 PHOX的p47和p40的PHOX）和Rac的膜- ，绑定flavocytochrome（由一个gp91 phox和22页PHOX异二聚体）。损失在任何这些NADPH氧化酶成分结果在CGD的功能的突变。相似患者CGD，gp91 PHOX-缺陷小鼠和的p47 PHOX-缺陷小鼠有缺陷的吞噬细胞的NADPH氧化酶的活性和受损的宿主防御13，14。除了的吞噬细胞，其中含有上述成分的NADPH氧化酶，各种其他类型的细胞表达的NADPH氧化酶的不同的亚型。 在这里，我们描述了一种方法来量化ROS生产的活老鼠，并划定的贡献，NADPH氧化酶的活性氧的产生的炎症和损伤模型中的。这种方法是基于对ROS与L-012（鲁米诺类似物）反应，以发射由一个电荷耦合器件（CCD），被记录的发光。在原始描述的L-012探针，L-012-依赖化学发光完全废除了超氧化物歧化酶，表明在该反应中检测到的主要活性氧是超级超氧阴离子15。随后的研究表明，L-012，可以检测到的其他自由基，包括活性氮物种16，17。 kielland等17表明，局部应用佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯，一种强力的NADPH氧化酶的活化剂，导致NADPH氧化酶-依赖性ROS生成使用发光探头L-012的小鼠中可检测到的。在这个模型中，他们表明：，P47 PHOX缺失的小鼠L-012-依赖的发光被取消。 我们比较了野生型小鼠和NADPH氧化酶缺乏P47 PHOX-/ -小鼠在以下三种模式：1）气管内给药的酵母，真菌细胞的促炎症墙衍生产品，可以激活NADPH氧化酶的活性氧的产生; 2）盲肠结扎穿刺（CLP），继发性急性肺部炎症和损伤腹内脓毒症模型; 3）口服四氯化碳（CCL），ROS依赖的肝损伤模型。这些模型是专门选定在非感染性炎症，多菌性败血症，毒素诱导的脏器损伤的情况下，分别评估NADPH氧化酶 - 依赖性ROS生成。在野生型小鼠比较，生物发光P47 PHOX-/ -小鼠，使我们能够描出P47 PHOX含NADPH氧化酶的生物发光信号在这些模型中所产生的ROS的具体贡献。 生物发光成像的结果表明增加细胞内ROS水平在野生型小鼠相比，P47 PHOX-/ -小鼠NADPH氧化酶产生的ROS的主要来源是炎症刺激。这种方法提供了一种微创的方法为“实时”监控产生的ROS在体内的炎症。
1。动物模型鼠标：使用P47 PHOX-/ -小鼠与年龄和性别匹配的C57BL6/DBA小鼠。获得的实验，从实验动物护理和使用委员会的批准。 麻醉：使用连续的异氟醚麻醉诱导系统。汽化器的系统（VetEquip）填充用异氟醚（2-3％）。确认，老鼠是完全麻醉，观察呼吸，运动及角膜反射，在对外部刺激的反应。 外科手术：磨砂手术区（台式），用70％的乙醇。戴无菌手套和干净的手术衣和面具。准备小鼠经削波的头发和应用聚乙烯吡咯酮碘，用70％乙醇，将切口的地方交替。无菌的表面上，并使用无菌器械进行手术。监视器小鼠手术后，直到清醒和自由移动。 气管酵母管理管理麻醉如在1.2中描述。 聚维酮碘和70％乙醇消毒手术区（颈部），暴露气管的手术剥离。 皮尔斯气管用27号针头注射酵母多糖（圣路易斯，MO）的剂量为1微克/克，采用0.5微克/微升的溶液（总体积为50微升的25克鼠标）溶解于无菌PBS中。 在无菌条件下，用5-0无菌丝线缝合关闭小鼠颈部伤口。
4小时和24小时后的图像。 盲肠结扎穿刺管理麻醉，如在1.2中描述。 剪辑的头发在手术区（腹部），并与聚乙烯吡咯酮碘和70％乙醇消毒。 执行中线剖腹探查术，并确定盲肠。 用4-0丝线缝合穿刺盲肠末端的21号针，结扎一次暴露盲肠结扎远端的50％。 用4-0无菌丝线缝合关闭切口。 图片4小时后，24小时。 口腔四氯化碳（CCL 4）管理管理麻醉，如在1.2中描述。 管理CCl 4中 （2微克/克，圣路易斯，MO）溶解在玉米油中，通过口腔管饲法。 IBC / EHS政策，四氯化碳管理的程序应在指定的区域内进行。
4小时和24小时后的图像。
2。获取生物发光图像初始化IVIS 200（精诺真公司，加利福尼亚州Alameda）成像系统，设置发光模式，电荷耦合器件（CCD）的温度来锁定和等待。 选择曝光时间，分箱（中）和F / STOP（8）设置。 将小鼠仰卧位成像室在加热阶段，以维持正常的体温。管理麻醉在经鼻锥1.2，而老鼠是在IVIS成像室。 管理L-012 （20微克/克）溶解于无菌PBS（10微克/微升）静脉内通过在每个时间点选择为成像眶注射。
L-012注射开始后2分钟拍摄图像。我们通常使用40秒曝光。
3。数据分析使用的感兴趣区域利用活体成像软件4.2版（精诺真公司，加利福尼亚州Alameda）进行数据分析。 打开图像，选择测量的地区利益的工具。 选择地区利益的形状和大小的胸部和/或腹部的鼠标在一个摄影图像重叠后的伪彩色数字图像（即光子探测）。 量化信号强度（光子通量）从本地区的利益。
4。统计使用统计分析软件包进行双向方差分析与Bonferroni测试后在各个时间点。 TLE“& 5代表性的成果。 酵母多糖是一种促炎症酵母细胞壁产品和强有力的激活NADPH氧化酶3。我们以前发现，气管酵母多糖诱导肺部炎症和更强大的嗜中性粒细胞的促炎性细胞因子产生的P47 PHOX / -比野生型小鼠1。在这里，我们的目标是比较ROS生成的野生型P47 PHOX-/ -小鼠的肺部后，酵母多糖的挑战。 4小时后气管内的酵母管理，我们观察到了显着的增加光子发射的胸部在野生型小鼠相比，基线以及增加光子发射在野生型相比，P47 PHOX-/ -小鼠在4小时和24小时。相比之下，生物发光信号的p47 PHOX-/ -小鼠在4小时后，酵母多糖处理（ 图1 AB）保持在基准水平。因此会出现，NADPH氧化酶为b?产生的ROS在肺部酵母管理的主要来源。 接下来，我们评估ROS生产的CLP诱导的脓毒症模型。败血症是一种危及生命的症状与终末器官损伤，包括急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）4，5。 ROS介导的损伤一直被认为是一个重要的驱动因素败血症引起的多器官功能障碍。我们发现，ROS显着增加了胸部（4小时），并在腹部（24小时）后，中电在野生型小鼠相比，基线。然而，活性氧（ROS）的p47 PHOX-/ -小鼠的水平基线水平相似，在两个时间点（ 图2交流 ）。这些结果表明，对CLP-诱导的败血症小鼠模型中的ROS的产生NADPH氧化酶依赖性。 最后，我们利用生物发光成像检测ROS的产生，在四氯化碳诱导的肝损伤模式升。 CCl 4中引起肝细胞坏死，并已被用于建模急性肝损伤和肝纤维化6。在先前描述的模型的炎症和损伤相反，我们发现，在腹部的ROS产生温和（约35％）增加基线相比的p47 PHOX-/ -小鼠在CCl 4中给药后4小时。然而，比在野生型小鼠中的p47 PHOX-/ -小鼠（ 图A，B）的CCl 4诱导的ROS的产生显着的幅度更大。这些数据表明，P47 PHOX含NADPH氧化酶依赖和独立的ROS生成，发生在4诱导的急性四氯化碳肝损伤。
图1。ROS生产在肺部后酵母的治疗。 A）代表bioluminescenCE成像ROS的产生。需要注意的是，除了胸部，荧光检测在野生型和P47 PHOX-/ -小鼠腹部发光是不变的酵母多糖治 疗腹部。 B）光子计数从胸部的野生型P47 PHOX / -小鼠气管内一次性注射酵母多糖（IT）。生物发光成像在基线，4小时，24小时。胸部以上从感兴趣的区域中的光发射被确定使用所指示的伪彩色规模。结果以平均值±SE，n = 6-9每个组，* P &0.05。
图2。ROS检测CLP。 A）ROS的产生，B代表生物发光成像）光子计数的胸部，C）光子计数野生型和P47 PHOX-/ -小鼠的腹部在基线，4小时，24小时后电。结果以平均值±SE N = 4％至5组，* P &0.05。
图3。ROS生产在CCL腹部后4诱导的肝损伤。 A）代表的生物发光成像ROS的产生与B）光子计数野生型和P47 PHOX-/ -小鼠的腹部在基线，4小时和24小时后口服CCl4处理。结果以平均值±SE，n = 4％至5组，P &0.05。
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“实时”测量的活性氧（ROS）可以通过使用荧光和化学发光探针在生活的动物。虽然荧光探针患有具有弱的信号-噪声比12，成像技术描述的是更敏感的检测发光基于鲁米诺-底物L-012的化学反应的活性氧。像所有的生物发光的成像技术，这种方法是有限的器官和组织的依赖于波长的光的吸收和散射。这些实验都集中在建立适当的测量ROS在野生型P47 PHOX-/ -小鼠的实验条件。这些转基因小鼠的使用，使我们能区分所产生的活性氧的p47的PHOX含NADPH氧化酶的活性氧生成的其他途径。 虽然功能NADPH氧化酶P47 PHOX的活性氧的主要来源，以及其他的NADPH氧化酶的异构体存在，和额外的ROS产生系统，包括黄嘌呤氧化酶和线粒体呼吸，可以产生活性氧。 NADPH氧化酶和活性氧产生的途径有重要的影响和互动抗菌宿主防御和下游信号通路的调节炎症和损伤7-10。利用生物发光成像，我们能够测量的动力学体内 ROS的产生，并划定NADPH氧化酶的活性氧水平不同炎症模型的贡献。 这种方法的一个限制涉及到生物发光的空间分辨率。虽然我们可以测量发光在特定的解剖车厢（ 例如 ，胸部，腹部），它是很难定位的解剖部位的发光器官水平。在我们的实验模型中，我们选择了生物发光测量的3个时间点：基线，4小时和24小时。我们不知道，如果生物发光成像在ROS的产生可以识别的微小差异，在较短的时间间隔的分析，还是在体内活性氧的产生和生物发光之间的关系是线性的。这些问题需要进一步研究。在这些研究中使用的模型中，我们认为，吞噬细胞，主要负责招募中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬细胞NADPH氧化酶系统的活性氧的产生通过。未来的研究中，被耗尽，或者骨嵌合体生成特定的细胞类型可以提供更多的知识，从不同的细胞群相对水平的ROS的产生。使用L-012的研究是另一个潜在的限制，其他的自由基（除了ROS）的反应可能与此荧光探针，减少在某些情况下，ROS检测的特异性。 继酵母多糖注射，缺乏中ROS产生的p47 PHOX-/ -小鼠表明，NADPH氧化酶是在这个模型肺部炎症的ROS的主要来源。 CLP是败血症11和生物发光成像的最常见的动物模型之一显露在肺部和腹部，NADPH氧化酶依赖增加ROS信号。对比度的酵母多糖和CLP模型，活性氧（ROS），增加了两个野生型和P47 PHOX-/ -小鼠，与基线相比，在腹部，但是在野生型小鼠在更大程度上，表明CCl 4中诱导ROS产生的p47 PHOX -含有NADPH氧化酶和其他机制。 总之，我们的数据表明，鲁米诺为基础的生物发光成像法检测ROS 在体内的活性氧生产的监管和后果的研究是很有价值的工具。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
没有利益冲突的声明。
这项工作是由NIH RO1 AI079253和退伍军人事务部。
Catalog Number
Wako Chemicals USA, Inc.
Sigma, St. Louis, MO
carbon tetrachloride
Sigma, St. Louis, MO
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| ISSN XMyJoVE Corp. | One Alewife Center, Suite 200 | Cambridge, MA | 02140 | tel.肿瘤细胞中NADPH氧化酶NOX家族的辐射敏感性--《兰州大学》2010年硕士论文
肿瘤细胞中NADPH氧化酶NOX家族的辐射敏感性
【摘要】：放射治疗是肿瘤治疗的一种常规方法,放射治疗通过光子和粒子断裂DNA的直接作用和(或)电离水分子产生自由基,利用自由基杀伤肿瘤细胞的间接作用而发挥疗效。实验使用不同射线敏感性的细胞(包括贴壁细胞：MCF-7;HepG2;HGlc-82;B16;SW-480,非贴壁细胞EL-4),通过western杂交以及免疫共沉淀的方法观察了不同剂量X射线和(或)12C重离子对上述细胞中产生ROS主要的酶系NADPH氧化酶的胞膜亚基NOX家族的蛋白表达影响以及NOX蛋白的Sumo化,同时观察了未处理状态下不同细胞间的NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达量的比较。
1.不同剂量的X射线辐射细胞后,细胞内的NADPH氧化酶的NOX家族表现不同的射线敏感性,除淋巴瘤细胞(EL-4)外,其它细胞的NADPH氧化酶的NOX1和NOX4的蛋白表达量基本保持不变,所有细胞的NADPH氧化酶的NOX2,NOX3和NOX5的蛋白表达量发生不同程度的改变。
2.X射线辐射后的小鼠黑色素瘤细胞(B16)的NADPH氧化酶的NOX家族的射线敏感性与试验中其它贴壁细胞的射线敏感性存在差异。
3.X射线辐射后的淋巴瘤细胞(EL-4)的NADPH氧化酶的NOX家族的射线敏感性与实验所用贴壁细胞的NADPH氧化酶的NOX家族的射线敏感性存在差异。
4.肿瘤细胞(HepG2, Hela, Glc-82)在未处理状态下,细胞间的NADPH氧化酶NOX家族的表达量存在差异。
5.不同剂量12C重离子辐射肿瘤细胞(HepG2, Hela, Glc-82),细胞的NADPH氧化酶的NOX家族表现不同的射线敏感性。
6. HepG2细胞中NADPH氧化酶的NOX2亚基发生Sumo化。
放射治疗与药物结合治疗,尤其重离子辐射与药物结合治疗越来越受到重视,实验为NADPH氧化酶的NOX蛋白家族与肿瘤细胞放射敏感性之间的关系提供依据,为肿瘤细胞增敏或者正常细胞的保护提供新的思路。
【关键词】：
【学位授予单位】：兰州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：R730.5【目录】：
摘要6-7Abstract7-9前言9-20 1 肿瘤发生的原因9 2 肿瘤的常规治疗9-12 3 不同常规治疗方法的优缺点12 4 生物治疗和放射治疗的结合12-13 5 生物体内活性氧产生的机理及其作用13-15
5.1 活性氧的产生13-14
5.2 生物体内活性氧的作用机理14
5.3 ROS对生物体的作用14-15 6 NADPH氧化酶15-18
6.1 NADPH氧化酶的组成15-16
6.2 NADPH氧化酶的NOX家族16-17
6.3 NADPH氧化酶的NOX家族的激活17
6.4 NADPH氧化酶的NOX家族的生理病理学功能17-18 7 NADPH氧化酶的NOX家族生物学修饰18 8 Sumo修饰的机理18 9 Sumo修饰的作用18-19 10 研究目的及意义19-20材料与方法20-24 1 材料20-21
1.1 主要材料20
1.2 主要试剂20
1.3 主要仪器20-21 2 方法21-24
2.1 细胞培养21
2.2 细胞辐照21
2.3 Western杂交21-23
2.3.1 细胞总蛋白的提取21
2.3.2 细胞总蛋白浓度测定21-22
2.3.3 电泳22
2.3.4 蛋白印迹22-23
2.3.5 抗体杂交23
2.3.6 自显影23
2.4 免疫共沉淀23-24结果24-35 1 X射线以及~(12)C重离子激活NADPH氧化酶24 2 X射线对NADPH氧化酶的NOX家族表达水平的影响24-30
2.1 x射线对贴壁细胞中NADPH氧化酶的NOX家族表达水平的影响24-29
2.1.1 x射线对MCF-7(乳腺癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图1)24-25
2.1.2 x射线对Hela(宫颈癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图2)25-26
2.1.3 x射线对GLC-82(肺癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图3)26-27
2.1.4 x射线对HepG2(肝癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图4)27-28
2.1.5 x射线对B16(小鼠色素瘤)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图5)28-29
2.1.6 x射线对SW-480(人结肠癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图6)29
2.2 x射线对非贴壁细胞EL-4(人淋巴瘤)中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图7)29-30 3 ~(12)C重离子对NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响30-33
3.1 ~(12)C重离子对Hela(宫颈癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族表达水平的影响(图8)30-31
3.2 ~(12)C重离子对HepG2(肝癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图9)31-32
3.3 ~(12)C重离子对GLC-82(肺癌)细胞中NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达水平的影响(图10)32-33 4 HepG2,Hela,GLC-82细胞正常状态下NADPH氧化酶的NOX家族蛋白表达量的比较(图11)33-34 5 x射线辐射HepG2(肝癌)细胞后NADPH氧化酶的NOX2的SUMO化(图12)34-35讨论35-40 1 X射线辐射后的细胞NOX家族的敏感性35-37 2 NOX家族对于ROS的调节37 3 小鼠肿瘤细胞(B16)的NOX家族敏感性37 4 X射线辐射后的血液细胞NOX家族的敏感性37-38 5 肿瘤细胞(HepG2,Hela,GLC-82)正常状态下NOX家族的敏感性差异38 6 ~(12)C重离子辐射后的NOX家族的敏感性38-39 7 NOX家族的sumo化影响39 8 意义展望39-40结论40-41参考文献41-48致谢48-49缩略词表49
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