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维生素D是维持人体健康必不可少的营养素,具有调节钙磷代谢的经典作用和影响细胞增殖分化等非经典作用。流行病学研究表明维生素D缺乏除与骨代谢疾病、肿瘤、心衰等常见多发慢性疾病相关外,也是传染病和自发免疫性疾病...
产品详细介绍
新品推荐：25-羟基维生素D检测试剂盒
背景介绍：
维生素D为脂溶性维生素，是固醇类衍生物。维生素D主要由人体皮肤经紫外线照射后合成，少部分从食物或补充品中摄入。维生素D在肝脏中通过羟基化作用产生25-OH-VD。25-OH-VD是维生素D的主要循环形式。维生素D的活性形式为1, 25-(OH)2-VD。
检测维生素D的重要性：
小肠：促进小肠对钙的吸收，维持人体内钙的代谢平衡以及骨骼形成；
骨：维生素D对骨呈双相作用，既促进骨形成，又刺激骨吸收；
肾：促进肾小管对钙和磷的重吸收；
骨骼肌：调节肌细胞的分化、影响肌肉的钙代谢；
其他：对免疫系统的调节作用。
与维生素D缺乏相关的疾病：
癌症：结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌；
肝肾疾病：肾性骨营养不良、慢性肾疾病、血液透析、慢性肝炎、肝硬化；
骨疾病：骨软化症、佝偻病、骨质疏松；
其它疾病：心血管、高血压、呼吸道、皮肤病、神经系统疾病、糖尿病和免疫系统疾病等。
25-OH-VD临床应用：
维生素D与儿童健康
血清25-OH-VD是维生素营养状况的最佳指标，应逐步开展。
血清25-OH-VD是维生素D不足、轻度维生素D缺乏和佝偻病早期的主要诊断依据。
维生素D与心血管
心血管疾病患者体内25羟基维生素D水平明显低于正常人,心衰患者降低程度更为明显,可通过补充维生素D降低心血管疾病的发病率。&
维生素D与孕妇健康
孕中晚期维生素D水平不足或缺乏是普遍现象，孕期应注意补充维生素D治疗，存在明显VitD缺乏，应补充VitD，维持25-OH-VD达正常范围。
母亲血清25-OH-VD水平小于37.5nmol/L,剖腹产率增加4倍。
参考文献：
骨质疏松症的预防应该重视孕妇和儿童的骨骼健康．中国骨质疏松杂志．）：299-303
维生素D缺乏的评估、治疗和预防（2011美国内分泌学会临床实践指南）
推荐采用可靠的血清25(OH)D水平检测用于评估维生素D缺乏风险。建议同时检测维生素D2和D3来治疗和预防维生素D缺乏。维生素D治疗时应监测25(OH)D水平。
孟迅吾．钙和骨质疏松症. 中华内科杂志．2005 44（3）．
孕妇及其新生儿维生素D、钙营养关系的研究．中华现代妇产科学杂志．2004 1（2）．
维生素D缺乏和维生素D缺乏性佝偻病防治进展．中华儿科杂志2008 46（3）．
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& 孕妇25羟基维生素D偏低。
孕妇25羟基维生素D偏低。
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???棬????????????论文发表、论文指导
周一至周五
9：00&22：00
LC-MS/MS法分析人体内25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3浓度的系统综述
&&&&&&本期共收录文章19篇
　　摘要人体系统循环中的25-羟基维生素D2（25(OH)D2）和25-羟基维生素D3（25(OH)D3）浓度反映着人体内的维生素D状态。本综述旨在对使用LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D浓度的方法进行全面的综述和评价。通过搜索数据库共筛选到20篇相关文献，发现同位素内标的选择、质谱离子源、衍生化、母离子的选择、基质效应和干扰物分离等因素会影响分析的准确度和灵敏度。为了建立一个灵敏和准确的分析方法，需要对上述影响因素进行优化。 中国论文网 /6/view-2464264.htm　　关键词25-羟基维生素D2 25-羟基维生素D3 LC-MS/MS法 同位素内标 基质效应 　　中图分类号：O657；Q565 文献标识码：A 文章编号：11)10-0477-04 　　 　　1维生素D的生理效应及体内特点 　　维生素D是一个脂溶性维生素，在维持人体内钙的动态平衡方面起着非常重要的作用，能和钙一起促进儿童骨骼的形成和维持成人骨骼的强度。在儿童中，维生素D的缺乏会导致骨骼畸形，如出现佝偻病等；而在成人中，维生素D的缺乏会导致骨质疏松症[1]。最近有研究证实，血清中维生素D浓度高与较低的乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的发生率有显著的相关性[2]。维生素D缺乏也可能是一个潜在的心血管疾病危险因素[3]。 　　维生素D主要存在两种形式，分别为维生素D2和维生素D3。对绝大部分人来讲，人体在阳光照射下皮肤中形成维生素D是维生素D3的主要来源，而维生素D2主要存在于各种食物和植物中。这两种维生素D都会在肝脏中被代谢形成25-羟基维生素D（25(OH)D），然后在肾脏中进一步被代谢形成1,25-二羟基维生素D（1,25(OH)2D）[1]。维生素D及其代谢产物主要和血中的维生素D结合蛋白结合，只有0.03%的25(OH)D是以游离形式存在的[1]。由于维生素D和1,25(OH)2D的半衰期相对较短（＜2 d），故系统循环中的25(OH)D被认为是反映人体内维生素D水平的重要指标[1, 4]。人血清中正常的25(OH)D浓度约为10～50 ng/ml，而高浓度的25(OH)D（＞200 ng/ml）可能与毒性和不良的健康状况有关[5]。 　　 　　2分析25(OH)D的方法 　　目前有很多不同的分析技术和方法可用于分析人体内的25(OH)D浓度，其中酶免疫分析法曾经是检测血清中25(OH)D浓度的最主要方法，且至今仍在被广泛应用[6]。酶免疫分析法的主要缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法特异性不足，而色谱分析法可对这些分析物进行有效分离，从而获得足够的特异性。在这一方面，液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法有很大的优势。由于LC-MS/MS法的高选择性、特异性和灵敏度，目前该分析技术已越来越广泛地用于临床检验实验室中对25(OH)D的分析。 　　 　　3LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D的研究现状 　　鉴于LC-MS/MS法在分析25(OH)D2和25(OH)D3时的独特优势，对近10年内发表的相关英文文献进行搜索，发现采用LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D的研究在最近两年内有显著增长。笔者共获得20篇相关英文文献[7~26]，下面就LC-MS/MS法分析人体内25(OH)D的研究作一全面的系统综述和评价，并对影响检测灵敏度和准确度的关键影响因素进行分析。 　　3.1针对不同人体生物样品的LC-MS/MS法分析策略 　　大部分研究分析的生物样品均是人血清或血浆，但是有一项研究的分析样品是人的唾液[9]。人唾液中25(OH)D2或25(OH)D3的浓度显著低于血清中的浓度，故对分析的灵敏度提出了更高的要求。这项研究实际上是目前已经报道的最灵敏的分析方法，柱上绝对灵敏度达到了0.7 pg。为了获得高灵敏度，这项研究使用了Cookson试剂（4位取代的1,2,3-三唑啉-3,5-二酮）对25(OH)D进行衍生化反应。25(OH)D2或25(OH)D3本身在电喷雾电离（ESI）下很难被电离，而通过衍生化反应加上一个含丰富N原子的基团后，这一含N基团会使衍生化产物在正离子ESI下很容易形成加氢峰[M+H]+，从而大大提高分析的灵敏度（提高达100倍）。在此基础上，该研究又通过在流动相中加入少量甲胺，使得衍生化产物形成甲胺加合离子[M+CH3NH3]+，后者的形成降低了加氢峰和脱水产物的离子强度，进一步提高了分析的灵敏度。但该研究的样品处理过于复杂。另有两项研究分析的样品是人的干血点[10, 15]。干血点法（DBS）的主要优点是用血量少（如只需3.28 μl全血）、样品容易保存和运输，但对分析的要求也很高。为了保证分析的灵敏度，这两项研究同样采用了衍生化的样品处理方法。 　　3.2对于提高LC-MS/MS法分析准确度的研究现状及存在问题 　　从不同研究的内标选择来看，大部分研究使用了同位素内标，但是有5项研究没有使用同位素内标[7~11]。这些研究所选择的内标均为25(OH)D的结构类似物，同时这些研究还均没有考察基质效应。因此，这些研究的分析准确性可能受基质效应的影响。虽然大部分研究使用了同位素内标，但是其中有6项研究[12~15, 17, 24]仅使用了单个同位素内标。仅使用一个同位素内标不能满足两个或两个以上待测物的分析需求。其它研究均使用了多个同位素内标，每个待测物对应一个同位素内标。 　　在ESI源中，基质效应是一个必须要考虑的问题，而在大气压化学电离（APCI）或大气压光致电离（APPI）源中一般不存在显著的基质效应。在13项使用ESI源的研究中只有4项研究对基质效应进行了考察[18, 19, 23, 25]，在未考察基质效应的9项研究中有4项研究没有使用同位素内标[8~11]，另有4项研究只使用了单个同位素内标分析两个待分析物[13, 15, 17, 24]。这说明在分析人的生物样品中25(OH)D2和25(OH)D3的浓度时，绝大部分研究都忽视了对ESI源的基质效应的考察，很可能会对分析方法的准确性产生一定程度的影响。 　　在所有20项研究中，只有6项研究考察了内源性的同分异构体对25(OH)D3的分析干扰[10, 11, 13, 14, 23, 26]，且这6项研究中只有两项研究的考察比较系统和全面[11, 23]。这两项研究均采用了较为复杂的二维液相色谱进行分离，从而大大提高了分析物和干扰物之间的分离效果。目前已知能够干扰25(OH)D3分析的内源性成分主要是1α-羟基维生素D3、3-表-25(OH)D3和7α-羟基-4-胆甾烯-3-酮。总体来看，对内源性干扰物的研究现状不能令人满意，大部分研究均忽视了对干扰物的色谱分离，很可能会影响分析结果的准确性。 　　质谱仪的选择对分析准确度也有一定的影响，除了一项研究使用离子阱质谱仪外[7]，其它研究均选择了串联四级杆质谱仪或串联四级杆线性离子阱质谱仪。选择普通离子阱质谱仪对25(OH)D2或25(OH)D3进行定量分析是不合适的，会影响分析的准确度和可靠性。 　　3.3对于提高LC-MS/MS分析灵敏度的研究现状及存在问题 　　为了获得较好的分离度和灵敏度，共有6项研究使用了超高效液相色谱仪[11, 16~18, 23, 24]，有一项研究为了进一步提高灵敏度甚至使用了毛细管微流液相色谱仪。毛细管微流液相色谱仪的流速单位通常是μl/min，低流速可以大大降低对样品的稀释程度，从而提高质谱检测的灵敏度。毛细管微流液相色谱法的主要局限性是样品载荷能力有限，故对样品的前处理要求很高，在样品前处理时需要最大程度地去除样品干扰基质。其它研究均采用了普通的高效液相色谱仪。
　　对离子源，在不同的分析条件下需要进行不同的选择。比如，有的研究为了提高分析灵敏度进行了衍生化反应，而衍生化产物在正离子ESI下具有很好的质谱响应，故凡涉及到衍生化处理的分析方法均采用了正离子ESI进行质谱检测。在没有采用衍生化的分析方法（12项研究）中，有的采用ESI模式（6项研究），有的选择了APCI模式（4项研究）或APPI模式（2项研究）。总的来说，ESI和APCI（或APPI）两种模式下的分析灵敏度似乎差别不大。但需注意的是，APPI下的分析灵敏度要显著高于APCI下的灵敏度[21, 22]。因此，如要建立一个不需衍生化的简单的分析方法，建议选择APPI源进行检测。 　　在不同类型的检测模式下（ESI或APCI），所选择的流动相中的电解质种类也不同。在ESI模式下，为了让分析物形成[M+H]+或[M+CH3NH3]+，一般在流动相中加入0.1%的甲酸或5 mM的甲胺；而在APCI或APPI模式下，一般不在流动相中添加任何电解质，但有两项研究分别在流动相中添加了甲酸（10 mM）和甲苯（1%）[22, 23]。需指出的是，使用甲苯作为流动相添加剂的研究使用了APPI电离模式，该研究发现在流动相中添加甲苯能显著提高分析的灵敏度。 　　为了提高分析的灵敏度，总共20项研究中有8项研究使用了柱前衍生化的方法[7, 9, 10, 15, 16, 18, 19, 25]。对所有20项研究的灵敏度从高到低进行排序后发现，灵敏度最高的6项研究均采用了衍生化的方法，说明衍生化方法能显著提高分析的灵敏度[9, 10, 15, 16, 18, 19]。衍生化试剂均采用Cookson试剂，而25(OH)D2和25(OH)D3的衍生化产物均存在6S和6R两种构型。为了满足分析的准确性的要求，必须对这两种同分异构体进行色谱分离。有的研究对这两种同分异构体进行了色谱分离[16]，但也有研究对这两种物质的分离效果不是很理想、至少没有达到基线分离[15]。8项使用衍生化反应的研究中有6项使用了4-苯基-1,2,3-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）。需指出的是，有一项研究的衍生化反应是分两步进行的：第一步使用PTAD进行Diels?Alder反应，第二步对3位上的羟基进行乙酰化反应[10]。进行乙酰化反应的目的是为了对25(OH)D3和3-表-25(OH)D3进行更好的色谱分离。3-表-25(OH)D3是25(OH)D3的同分异构体，会干扰25(OH)D3的准确定量。 　　检测母离子的选择同样会影响分析灵敏度。在非衍生化的分析方法中，除了一项研究选择加氢脱水峰[M-H2O+H]+作为母离子进行检测外[21]，其它研究均选择[M+H]+作为母离子进行检测。这说明在非衍生化条件下，25(OH)D2或25(OH)D3在ESI源中主要形成的是[M+H]+。而在衍生化的8项研究中，有4项研究选择了[M-H2O+H]+作为母离子进行检测[15, 16, 19, 25]，其它3项研究为了提高分析灵敏度，在流动相中添加了一定量的甲胺[9, 10, 18]，使得分析物形成响应较高的[M+CH3NH3]+。 　　3.4生物样品的前处理方法 　　对于生物样品的前处理，绝大部分研究的前处理方法均比较复杂，一般程序是：1）用甲醇、乙腈或其它有机试剂对血样进行蛋白沉淀，将与蛋白结合的25(OH)D释放出来。有一项研究在蛋白沉淀前专门使用了氢氧化钠来释放与蛋白结合的25(OH)D[24]，但此似无必要。2）采用液-液萃取或固相萃取法提取25(OH)D。有的研究在这一步采用了在线自动固相萃取法。3）有的研究会进行衍生化处理。4）浓缩和复溶。有3项研究采用了非常简便的样品处理方法，这些研究均在采用乙腈或丙酮沉淀蛋白后直接进行分析或浓缩后分析[20~22]，且分析方法的灵敏度能够满足分析人血清中25(OH)D的要求。必须指出的是，这三项研究均采用了APCI或APPI模式，同时选择的质谱仪也是较新一代的质谱仪，如API 4000、API 5000或Agilent 6460。 　　 　　4结论 　　为了建立一个高灵敏度的人血清中25(OH)D2和25(OH)D3的LC-MS/MS分析方法，最好选择衍生化的样品处理方法，并选择正离子ESI源检测[M+CH3NH3]+（流动相添加甲胺）或[M-H2O+H]+（流动相添加甲酸）作为母离子。为了提高分析的准确性，必须对所有可能的内源性干扰物和分析物25(OH)D进行色谱分离，每个待分析物都要有相应的同位素内标，对基质效应也必须进行系统的考察。如果发现有基质效应，应采取措施予于克服。如要建立一个简便的分析方法（沉淀蛋白后直接进样分析而不进行衍生化反应），应选择较新一代的串联四级杆质谱仪，再结合使用APPI源检测[M+H]+（流动相不添加电解质）作为母离子，可以满足对人血清中25(OH)D的分析需求。 　　参考文献 　　[1] Burtis CA，Ashwood ER. Tietz textbook of clinical chemistry ［M］．3rd ed. Philadelphia：Saunders，-1457. 　　[2] Garland CF，Gorham ED，Mohr SB，et al. Vitamin D for cancer prevention：Global perspective［J］．Ann Epidemiol，)：468-483. 　　[3] Michos ED，Melamed Ml. Vitamin D and cardiovascular disease risk［J］．Curr Opin Clin Nutr Metab Care，)：7-12. 　　[4] Zerwekh JE. Blood biomarkers of vitamin D status［J］．Am J Clin Nutr，)：. 　　[5] Hart GR，Furniss JL，Laurie D，et al. Measurement of vitamin D status：Background，clinical use，and methodologies［J］．Clin Lab，-8)：335-343. 　　[6] Carter GD，Carter R，Jones J，et al. How accurate are assays for 25-hydroxyvitamin D? Data from the international vitamin D external quality assessment scheme［J］．Clin Chem，)：. 　　[7] Higashi T，Awada D，Shimada K. Simultaneous determination of 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry employing derivatization with a Cookson-type reagent ［J］．Biol Pharm Bull，)：738?743.
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