茶尺蠖小RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶功能研究及全长cDNA克隆构建--《武汉大学》2009年博士论文
茶尺蠖小RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶功能研究及全长cDNA克隆构建
【摘要】：正链RNA病毒基因组为单股正链RNA,有感染性,可以直接作为mRNA起始病毒蛋白质的翻译,除逆转录病毒外,几乎所有的正链RNA病毒都编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。RdRp在RNA病毒的增殖复制期起到了非常重要的作用,它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因,另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA,所以它担负了复制酶和转录酶双重功能。正链RNA病毒的复制首先以基因组正链RNA为模板合成互补的负链RNA,然后再以合成的负链为模板起始子代病毒基因组正链RNA的合成,因此基因组正链和负链RNA模板的3'末端可能含有起始RNA复制所必须的顺式作用调控元件,如启动子、增强子等。正链RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶起始基因组RNA合成的分子机制主要有两种：引物依赖的RNA合成(Primer-dependent RNA synthesis)和引物非依赖的RNA合成即从头合成(De-novo RNA synthesis)。
我室于2000年从茶尺蠖罹病幼虫中分离得到的一种新的非包涵体病毒,经分离纯化鉴定为微小RNA病毒,命名为茶尺蠖小RNA病毒(Evtropis oblique picorna-like virus, EoPV)。这是我国首次分离得到的昆虫小RNA病毒。EoPV基因组为正链RNA,5'UTR为390nt；3'UTR为43nt,有一poly(A)尾；含有一个大的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),编码一个聚蛋白前体,N端为结构蛋白,C端为非结构蛋白。根据最新报告,EoPV为传染性软化病病毒科(Iflaviridae),传染性软化病病毒属(Iflavirus)的成员之一。
对EoPV基因组末端的氨基酸进行同源性比较分析,发现其具备典型的RNA依赖的RNA聚合酶结构域共有特征,含有最保守的基序GDD以及其它的保守基序,根据已有的晶体结构预测得到它的三级结构,与鼻病毒RdRp结构极其接近,呈右手型,具有3个亚结构域：掌型亚结构域(Palm subdomain)、拇指型亚结构域(Thumb subdomain)和手指型亚结构域(Finger subdomain)。
为了探讨茶尺蠖小RNA病毒起始基因组RNA合成的分子机制,我们利用RT-PCR的方法扩增预测的RNA聚合酶编码区,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白,通过Ni亲和柱纯化到足量的可溶性蛋白。同时,建立稳定的体外RdRp复制系统,以病毒正链3'末端为模板,以人工合成的oligo(U)20为引物,通过Northern-blot法和RT-PCR对EoPV RNA聚合酶起始病毒RNA合成的分子机制进行研究。结果表明,EoPVRNA聚合酶具有RNA依赖的RNA聚合酶活性,而保守基序GDD的突变导致功能完全丧失。实验也证实基因组末端的poly(A)尾对于RNA聚合酶功能的行使是必须的。
对合适的反应条件进行摸索,发现EoPV RNA聚合酶的活性依赖于镁离子(Mg2+)和锰离子(Mn2+)的存在。反应体系中缺乏Mg2+或Mn2+均不能起始合成负链RNA。Mg2+对聚合酶的活性影响相对较小,在不同浓度下均可有效维持RdRp的活性,而Mn2+浓度的改变对RdRp的活性影响较大,最适浓度为1-2mM,在Mn2+浓度高于2mM时,活性显著降低。K+浓度在150mM时,活性最高,但当浓度继续加大,反而对酶活起抑制效果。实验表明EoPV RdRp反应的最适温度为30-35℃。
本课题组卢杰等已在体内和体外证实了EoPV 5'UTR含有一功能性的IRES元件。我们将含有EoPV IRES的双顺反子表达载体,与构建的包含RNA聚合酶的载体共转染不同的细胞系(Sf9,S2,Cos-7),通过western检测表达的蛋白,并检测双荧光素酶表达量。结果表明,RNA聚合酶的表达抑制了IRES的活性,在Sf9中使IRES活性降低约50%,S2中降低20%,而在Cos-7细胞中抑制效果并不明显。实验表明该蛋白对IRES活性的下调作用随RNA聚合酶表达量的提高而增强,呈剂量依赖性特点。进一步将RNA聚合酶缺失N端和C端,发现N端的缺失导致蛋白对IRES的抑制效应丧失,而C端缺失对功能没有影响。显示N端是发挥功能的核心区域。综上所述,本研究揭示EoPV RNA聚合酶抑制了EoPV IRES依赖的翻译活性并呈现剂量依赖性,而对帽子依赖的蛋白翻译没有影响。我们的研究首次探讨了EoPV编码的非结构蛋白对IRES活性的负调控作用,对进一步研究IRES的功能和病毒的翻译机制提供了有力佐证。
另外,根据已公布的EoPV核苷酸序列,巧妙利用基因组上单一的酶切位点,设计特异性引物,应用RT-PCR技术逆转录出5个覆盖全长的片段。随后采用融合PCR将5个片段拼接,最终将全长定向克隆到低拷贝质粒载体上,成功构建cDNA全长克隆p-EoPV。双酶切及测序鉴定证明全长克隆构建成功。与原序列比较发现,该克隆在氨基酸水平上有10个改变和3个缺失。为了筛选敏感细胞系,将全长克隆转染Sf9,Sf21,LD652等细胞,进行感染性克隆的积极尝试。
【关键词】：
【学位授予单位】：武汉大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2009【分类号】：S476.1【目录】：
中文摘要7-10Abstract10-16第一章 前言16-50 1.1 昆虫病毒16-20
1.1.1 昆虫病毒的形态结构16-17
1.1.2 昆虫病毒的分类17
1.1.3 昆虫病毒的分子生物学17-19
1.1.4 昆虫病毒研究的意义19-20 1.2 昆虫小RNA病毒20-32
1.2.1 昆虫小RNA病毒的分类地位20-24
1.2.2 昆虫小RNA病毒的基因组结构特性24-25
1.2.3 昆虫小RNA病毒的蛋白翻译机制25-29
1.2.4 昆虫小RNA病毒与其它小RNA病毒的进化关系29-32 1.3 正链RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶研究进展32-39
1.3.1 正链RNA病毒的基因组的结构32
1.3.2 正链RNA病毒的复制32-33
1.3.3 RNA依赖的RNA聚合酶的结构33-36
1.3.4 正链RNA病毒起始RNA合成的分子机制36-39 1.4 RNA病毒IRES元件研究进展39-45
1.4.1 依赖帽子结构的翻译起始39-41
1.4.2 依赖IRES元件的翻译起始41
1.4.3 IRES的结构与功能41-44
1.4.4 病毒IRES的应用44-45 1.5 茶尺蠖小RNA病毒研究现状45-50
1.5.1 茶尺蠖和茶尺蠖小RNA病毒45-49
1.5.2 开展本研究的背景和意义49-50第二章 茶尺蠖小RNA病毒RNA依赖的RNA聚合酶的表达,纯化与分析50-72 2.1 前言50-51 2.2 材料与方法51-65
2.2.1 材料51-53
2.2.2 方法53-65 2.3 结果65-70
2.3.1 RNA依赖的RNA聚合酶基因的扩增及其序列分析65-68
2.3.2 原核表达载体的构建及鉴定68
2.3.3 RNA依赖的RNA聚合酶在大肠杆菌中表达,亲和纯化与鉴定68-69
2.3.4 EoPV RNA依赖的RNA聚合酶三级结构预测69-70 2.4 讨论70-72第三章 EOPV RNA依赖的RNA聚合酶起始RNA合成的分子机制72-88 3.1 引言72-73 3.2 材料与方法73-79
3.2.1 材料73-75
3.2.2 方法75-79 3.3 结果79-85
3.3.1 EoPV RdRp起始正链RNA合成活性分析79-80
3.3.2 RNA合成产物的特性分析80-82
3.3.3 引物浓度对起始RNA合成的影响82
3.3.4 温度对起始RNA合成的影响82-83
3.3.5 金属离子浓度对起始RNA合成的影响83-85 3.4. 讨论85-88第四章 EOPV RNA聚合酶对IRES元件活性的调节功能研究88-104 4.1 前言88-91 4.2 材料与方法91-98
4.2.1 材料91-92
4.2.2 方法92-98 4.3 结果98-102
4.3.1 载体构建98-99
4.3.2 RNA聚合酶对IRES活性的影响99-100
4.3.3 RNA聚合酶对IRES活性影响的剂量效应100
4.3.4 RNA聚合酶下调IRES活性的功能区初步定位100-102 4.4 讨论102-104第五章 茶尺蠖小RNA病毒全长CDNA克隆的构建104-120 5.1 引言104-105 5.2 材料与方法105-112
5.2.1 材料105-106
5.2.2 方法106-112 5.3 结果112-116
5.3.1 RT-PCR结果112-113
5.3.2 重组质粒的构建113-114
5.3.3 T-AB,T-CDE克隆的鉴定114
5.3.4 全长cDNA克隆的鉴定114-115
5.3.5 全长cDNA克隆的序列分析115-116
5.3.6 全长cDNA克隆感染性的初步研究116 5.4 讨论116-120研究总结120-122参考文献122-141博士在读期间发表和待发表的文章141-142致谢142
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出门在外也不愁SARS冠状病毒亚基因组RNA的分析和鉴定--《武汉大学》2005年博士论文
SARS冠状病毒亚基因组RNA的分析和鉴定
【摘要】：SARS冠状病毒亚基因组RNA的分析和鉴定
冠状病毒的一个重要特点是其独特的转录策略(strategy)——即通过不连续的转录合成一组嵌套(nested)的亚基因组RNA(sgRNA)使基因组3’端基因得到表达。转录过程中,每个亚基因组的合成都涉及到一个不连续的步骤,即一段由基因组5’端编码的前导RNA(leader RNA)与主体序列(body sequence)在不同的转录调节序列(transcription regulatory sequence TRS)相连。前导序列在转录时可以自由交换,因此前导序列和mRNA序列可以来源于两个不同的RNA分子,这一过程发生于亚基因组RNA负链RNA模板合成时。TRS在不连续转录时主体序列与前导序列的融合及不连续转录过程中起关键作用,含有一段高度保守的同一序列(consensus sequence CS)。在严重呼吸综合症(SARS)病毒(Sars-Cov)的感染细胞中,我们使用RT-PCR或Northern blot的方法检测到有12种亚基因组RNA,其可能参与表达3’端12个ORF,其中通过进一步的RT-PCR分析鉴定出2个未报道的亚基因组RNA,命名为2-1,3-1,这些亚基因组RNA集中在Sars-Cov基因组后1/3部分。亚基因组RNA存在于S基因内部,在S基因本身CS(ACGAAC)下游384个碱基处,它的前导序列与主体序列结合位点ACGAGC存在着与CS(ACGAAC)一个位点的错配,。
翻译亚基因组RNA 2-1可以得到一个截短的S蛋白(s’),其N端缺少了143个氨基酸。亚基因组RNA 3—1在3b区,预计可能从mRNA3开始表达,它的存在可能预示着ORF3b是从另外一个mRNA而不是从mRNA3开始表达的。亚基因组RNA 3—1的前导序列与主体序列的结合区AaGAAC在ORF3b起始序列AUG上游10个碱基处,与Sars-Cov冠状病毒CS序列同样存在一个碱基的错配。亚基因组RNA 2-1和3-1都与前导序列TRS有一个碱基的错配,但是与主体序列的TRS都是一致的。对不同亚基因组RNA主体序列和前导序列的结合区测序可以看到连接序列和相关的TRS序列都各有不同,而且在病毒的传代中保持相对的稳定性。亚基因组RNA正链和负链模板的共存和亚基因组RNA保守序列与主体序列保守区一致都可以支持不连续转录发生在从全长基因组RNA模板合成负链RNA时的假说模型。根据这一模型,RNA多聚酶在TRS暂停,然后跳跃
【关键词】：【学位授予单位】：武汉大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2005【分类号】：R373【目录】：
Table of Contents6-9
List of Figures9-10
List of Tables10-11
Abstract13-16
INTRODUCTION16-69
CHARACTERISTICS AND CLASSIFICATION OF CORONAVIRUSES16-27
Mechanism of Coronavirus Infection18-19
Receptor Proteins as Determinants of Coronavirus Infection19-21
Virus Entry21-22
Pathogenesis22-23
Cytopathogenesis and Spreading of Progeny23-25
Species Specificity, Tissue Tropism, and Age-Dependent Resistance25-27
SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME27-36
The Outbreak27-29
Clinical Information29
Symptoms29
Investigations29-30
Diagnostic Tests30
Diagnosis30-31
Mortality Rate31
Treatment31-34
Current state of Etiologic Knowledge34-36
GENOME ORGANIZATION OF SARS-COV36-49
The 5' - Untranslated Region41-42
The Replicase Gene42-44
SARS-CoV RNA-Dependent RNA Polymerase44-45
SARS-CoV Proteinases45-46
1. Main Proteinase 3CLpro45-46
2. Accessory Proteinase PLpro46
Single Stranded RNA Binding Protein46-47
Endoribonuclease47-48
RNA Helicase48-49
SARS-COV STRUCTURAL PROTEINS49-58
Spike protein49-51
Envelop Protein (E)51-53
Membrane Protein (M)53-54
Nucleocapsid Protein (N)54-55
SARS Coronavirus Accessory Proteins55-56
The 3' -Stem-Loop II-like Motif (s2m motif) in SARS-CoV56-58
CORONAVIRUS REPLICATION AND TRANSCRIPTION58-69
Leader-Primed Transcription61-63
The Replicon Model63
Discontinuous Transcription during Negative-Strand RNA Synthesis63-66
Sequence Elements Regulating Transcription66-69
OBJECTIVES69-70
MATERIALS AND METHODS70-80
Cells, Viruses, Antibodies and Bacteria70-71
In Silico Analysis71
Construction of Plasmids71-74
Northern Blot74-75
Transfection and Western Blotting75-76
General Molecular-Biology Techniques76
Extraction of RNA from Virus Infected Cells76-77
Synthesis of Viral cDNAs77
Polymerase Chain Reactions (PCR)77-78
Agarose Gel Electrophoresis for Nucleic Acids78
Ligation, Transformation and Screening for Positive Clones78-80
RESULTS80-104
Features of the Genomic Structure of SARS-CoV Isolate WHU80-84
Co-existence of both Positive and Negative-Strand Subgenomic RNA in SARS-CoV Infected Cells84-89
Identification of Novel Subgenomic RNAs89-94
Subgenomic RNAs 2-1 and 3-1 could be Functional Messages94-96
Expression Profile of SARS-CoV Subgenomic RNAs96-99
Role of 5'-UTR in Viral Translation99-102
Uniqueness and Stability of the Junction Sequences of each Subgenomic RNAs102-104
DISCUSSION104-117
REFERENCES117-149
ACKNOWLEDGMENT149-151
Papers Published to be Published During the PhD Study(博士研究生期间发表和待发表的论文:)151
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