一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法技术领域1.本发明属于猪瘟病毒检测技术领域，具体是指一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法。背景技术：2.非洲猪瘟(asf)是一种传染性很强的病毒性疾病，一旦感染，可引起家猪极高的死亡率。对养猪产业和人民生活造成重大影响，带来巨大经济损失。3.当下，世界上仍未有针对非洲猪瘟病毒有效的相应疫苗，也使得其成为“不治之症”。在这种情况下，采取及时、有效的早期诊断检测，做到早发现、早处理，是保护养猪产业的重要手段。而目前针对非洲猪瘟病毒，常用的检测方法是采用荧光定量pcr检测，该方法可通过对荧光信号的检测，确定样本中是否含有病毒模板，可通过参考基因实现病毒模板的半定量。但是该手段依赖于参考基因的标准曲线，经常受抑制剂或模板浓度过低的限制，无法检测病毒感染初期的低浓度病毒模板。技术实现要素：4.针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法，该方法采用数字pcr手段，测试了适用于低浓度非洲猪瘟病毒模板检测的检测系统，该系统不依赖于标准品或其他参考基因，可实现病毒模板绝对定量，此外通过对多个稀释梯度的样板进行检测，该系统可实现低浓度阳性样本的检测，最低可检测到5拷贝/μl的非洲猪瘟病毒，具有更高的灵敏度和精确度。5.本发明采取的技术方案如下：本发明一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法，包括如下步骤：6.步骤一 材料准备7.包括如下材料：(1)数字pcr板(qiagen凯杰)8.(2)qiacuity probe master mix 4x缓冲液(qiagen凯杰)9.(3)引物1:cacgtaatccgtgtcccaac(湖州河马生物)10μl/ml10.(4)引物2:gcgattaaaacccccgatga(湖州河马生物)10μl/ml11.(5)探针:ccacgggaggaataccaacccagtg、5’:6-carboxy-fluorescein(fam)、3’:3`bhq1(湖州河马生物)；12.步骤二 样本标记13.对非洲猪瘟病毒的vp72质粒样本进行了采用taq-man探针荧光信号检测，采用了4个非洲猪瘟阳性样本进行测试，分别标记为：样本一、样本二、样本三和样本四；14.步骤三 样本稀释15.采用了不同稀释倍数的阳性样本，以测试本试剂盒检测非洲猪瘟病毒的灵敏度，稀释倍数为1x、4x、16x、64x、128x；16.步骤四 反应体系配置17.采用了40μl的反应体系，每个反应中加入2μl不同浓度的阳性样本，反应体系配置如表一所示；18.步骤五 数字pcr反应19.将配置好的反应体系充分混匀，小心将样品加入数字pcr板(qiagen凯杰)的加样孔中，过程中应避免有气泡产生，加样后，用配套封板膜封住pcr板，将数字pcr板按标识放入qiacuity数字pcr仪中，以95℃预变性2min，95℃变性15s，57℃退火30s，共采用30个循环；20.步骤六 数据分析21.采用qiacuity数字pcr仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数，按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数；22.步骤七 数据分析23.阳性膜拜检测结果显示，荧光信号显示，所测之阳性样本均显示出阳性信号，而阴性对照则无荧光信号。24.进一步地，所述步骤四中反应体系配置时全程在冰上操作，探针需避光保存，阴性对照组中不含非洲猪瘟阳性样本，加入同体积的dd ddh2o补齐反应体系体积。25.表一 反应体系配置表[0026][0027]采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本方案一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法，本技术采用数字pcr系统作为非洲猪瘟病毒检测的主要手段，数字pcr系统可以用来解决传统分子检测技术在定量时出现的检测灵敏度不足与扩增抑制剂敏感的问题。在实际检测过程中，多数样品的病毒丰度极低，并且可能存在的pcr抑制剂，故导致了定量pcr检测结果处于灰区和假阴性的问题。数字pcr系统无需构建标准曲线，基于其结果判读原理，一举解决了传统分子检测技术在应对低载量病毒核酸或者低丰度拷贝变异检测时，检测灵敏度不足与扩增抑制剂敏感的问题，有效避免检测假阴性。可在1.5小时内获得96个样本的全封闭全自动化检测，减少人员操作误差以及人员接触污染的几率，提供了一个更安全、可靠、精准、自动化、高通量的检测平台。采用本技术可实现病毒样本的绝对定量，避免了常规荧光定量pcr中，由于内参基因引起的检测误差，此外，该技术可对丰度极低的病毒样本进行量化监测，从而做到尽早发现，尽早干预，避免病毒引起更大损失。附图说明[0028]图1为本方案的样本一检测结果图；[0029]图2为本方案的样本二检测结果图；[0030]图3为本方案的样本三检测结果图；[0031]图4为本方案的样本四检测结果图。[0032]其中，图1-4中黑色标记为该体系中阳性样本的稀释倍数。[0033]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。具体实施方式[0034]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0035]本发明一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法，包括如下步骤：[0036]步骤一 材料准备[0037]包括如下材料：(1)数字pcr板[0038](2)qiacuity probe master mix 4x缓冲液[0039](3)引物1:cacgtaatccgtgtcccaac10μl/ml[0040](4)引物2:gcgattaaaacccccgatga10μl/ml[0041](5)探针:ccacgggaggaataccaacccagtg、5’:6-carboxy-fluorescein(fam)、3’:3`bhq1；[0042]步骤二 样本标记[0043]对非洲猪瘟病毒的vp72质粒样本进行了采用taq-man探针荧光信号检测，采用了4个非洲猪瘟阳性样本进行测试，分别标记为：样本一、样本二、样本三和样本四；[0044]步骤三 样本稀释[0045]采用了不同稀释倍数的阳性样本，以测试本试剂盒检测非洲猪瘟病毒的灵敏度，稀释倍数为1x、4x、16x、64x、128x；[0046]步骤四 反应体系配置[0047]采用了40μl的反应体系，每个反应中加入2μl不同浓度的阳性样本，反应体系配置如表一所示，反应体系配置时全程在冰上操作，探针需避光保存。阴性对照组中不含非洲猪瘟阳性样本，加入同体积的dd ddh2o补齐反应体系体积；[0048]步骤五 数字pcr反应[0049]将配置好的反应体系充分混匀，小心将样品加入数字pcr板的加样孔中，过程中应避免有气泡产生，加样后，用配套封板膜封住pcr板，将数字pcr板按标识放入qiacuity数字pcr仪中，以95℃预变性2min，95℃变性15s，57℃退火30s，共采用30个循环；[0050]步骤六 数据分析[0051]采用qiacuity数字pcr仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数，按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数，如本检测中，采用40μl体系，其中共有阳性样本2μl，稀释倍数为20倍。因此结果中的模板拷贝数应x20即为阳性模板中非洲猪瘟病毒的实际拷贝数；[0052]步骤七 数据分析[0053]阳性膜拜检测结果显示，荧光信号显示，所测之阳性样本均显示出阳性信号，而阴性对照则无荧光信号，如图1-4。[0054]实施例[0055]绝对定量结果表示，样本一中非洲猪瘟病毒浓度为27134copies/μl，样本二中非洲猪瘟病毒浓度为87790copies/μl，样本三中非洲猪瘟病毒浓度为874copies/μl，样本四中非洲猪瘟病毒浓度为134copies/μl。且随着样本浓度稀释倍数增大，样本中病毒拷贝数相应减少，具体数据见表二。[0056]表二 数字pcr检测非洲猪瘟病毒阳性样本绝对定量结果[0057][0058][0059]本研究利用数字pcr技术，开发了针对非洲猪瘟病毒的检测体系，该体系以目前非洲猪瘟病毒检测的标准片段为检测位点，采用优化的反应系统，可实现低浓度非洲猪瘟病毒的绝对定量检测，为畜牧养殖业中养殖环境监测、病毒早期发现等提供支持。[0060]需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。[0061]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。[0062]以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。}

任何一种疾病的确诊最终还是要借助实验室检测，特别是非瘟之后，借助实验室诊断更被猪场老板认可。那么实验室给出的实验结果如何解读？
目前实验室常见检测的项目：抗原（又分为常规PCR和 定量PCR）、抗体、细菌分离、药敏实验等。今天跟大家分享一下，猪场应该如何采样品，拿到结果如何解读。首先采样送检无非是疾病诊断和猪场疾病监测，疾病诊断一般是根据疾病症状采集样品。例如：腹泻就采集发病猪粪便、发烧采集发病猪血液或者口腔液，咳喘采集发病猪鼻咽拭子或者是全肺，采集的样品直接冷藏及时的将样品送至实验室做抗原检测或者是细菌分离。如果分离到可疑细菌可以进一步要求实验室做药敏实验方便指导生产精准用药。另外需要强调的是抗原检测结果的解读需要注意，有的疾病并不是一次采样就可以检测到的，这取决于采样的时机和病毒的含量等，如有需要可以多次采样送检。如果某一疾病抗原是阳性,也不一定说明是猪场发病的主因，还是需要借助临床做一个综合的判断，还有就是一次样品可以检测出多种抗原的阳性，也是需要兽医根据临床去判断此次发病的主要病原，然后再去制定一个科学的防控方案。例如，一次产房仔猪腹泻，采集粪便检测，检测结果是：PED（流行性腹泻）抗原阳性，大肠杆菌阳性，沙门氏阴性，这个时候肯定是要以PED的为主采取防控方案。
如果说抗原是代表当下疾病流行情况，那么抗体的检测结果就代表的是过去的疾病情况。抗体，常见的理解是看疫苗免疫后的效果，例如猪瘟苗免疫之后，采血检测猪瘟抗体。如果抗体水平整体比较高，而且整齐说明猪瘟苗免疫效果较高。另一种情况是查看猪群中某一特定疾病的流行情况。例如，通过采集不同日龄段的猪检测蓝耳，了解不同日龄段的蓝耳流行情况。还有一种是通过检测猪的抗体消逝情况来制定免疫方案。发布于 2021-02-04 14:16}