本发明公开了一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法，鹅星状病毒二价灭活疫苗通过将鹅星状病毒1型、2型毒株分别接种于驯化好的LMH细胞进行悬浮培养得到病毒含量高，无需浓缩的病毒液，将病毒液灭活后和疫苗佐剂混合乳化获得，鹅星状病毒二价卵黄抗体通过使用灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫获得的高免疫鸡蛋，分离卵黄提取抗体获得。本发明中制备的鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体对雏鹅能够提供有效的免疫保护，能够有效的预防鹅痛风的发生，具有很好的商品化开发前景。

本发明属于疫苗抗体制备领域，具体地说涉及一种鹅星状病毒二价灭活疫苗和卵黄抗体及其制备方法。

自2016年以来，河南、江苏、山东等十余省份鹅场爆发了以内脏和关节痛风为主要特征的传染性疾病，给鹅场造成了严重的经济损失。该病主要侵害3周龄以下雏鹅，最早可见1日龄雏鹅发病，死亡率20％～70％，患病鹅通常表现为精神沉郁、饮食减少、卧地不起、不愿走动，有白色稀粪排出，剖检表现为肾脏、心脏、肝脏、肺脏、输尿管、关节等有大量尿酸盐沉积。该病在使用不同饲料、不同药物的不同品种鹅群中均有发生，降低饲料中的蛋白含量、减少饲喂量均无效。

文献报道及实验室病原检测表明，雏鹅痛风病主要有2种不同基因型的鹅星状病毒导致，分别为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒。序列比对分析发现，1型和2型鹅星状病毒毒株之间的序列同源性较低(70％)；血清中和试验表明，1型和2型毒株相互之间缺乏有效的交叉保护。目前对鹅星状病毒的培养多采用鹅胚或鹅胚肾细胞进行培养，但鹅胚具有成本高、来源有限、病毒含量低，无SPF鹅胚、易有外源因子污染的缺点；鹅胚肾细胞制备繁琐、量少、易受污染，因此，鹅胚或鹅胚肾细胞均不利于大规模生产。鹅星状病毒的培养存在诸多困难，严重制约了疫苗及相关产品的开发，且目前国内外尚无有效预防和治疗该病的商品化的二价灭活疫苗和抗体，因此，研制包含鹅1型、2型星状病毒的二价灭活疫苗和抗体是预防和控制鹅星状病毒的必然要求。

针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种鹅星状病毒二价灭活疫苗及卵黄抗体的制备方法。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)选取两株不同的鹅星状病毒，两株不同的鹅星状病毒均采用LMH细胞培养的方式进行增殖，LMH细胞培养的方法为，将鹅星状病毒在LMH细胞中进行培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传代，直至收获的病毒液中鹅星状病毒的病毒含量大于等于10^6.0TCID₅₀/0.1ml，取该代次的病毒液接种于驯化好的LMH细胞中进行悬浮培养增殖，收获病毒液；

(2)将两株不同的鹅星状病毒分别采用LMH细胞培养增殖最终获得的病毒液分别灭活，然后将两种分别灭活的病毒液和疫苗佐剂混合乳化即获得鹅星状病毒二价灭活疫苗。

优选的,两株不同的鹅星状病毒分别为鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒，两株不同的鹅星状病毒之间没有血清学关系。

优选的,两株不同的鹅星状病毒为保藏编号为CCTCC No.V202047的新型鹅星状病毒WF株和保藏编号为CCTCC No.V201820的新型鹅星状病毒GD0122株，新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株之间没有血清学关系。

优选的,步骤(1)中用于接种于LMH细胞中的鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒由以下方法获得：

(A)将鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式连续传代3代；

(B)对连续传代3代后收获的病毒液进行病毒鉴定，对符合要求的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式在12～13日龄鹅胚中继续传3代。

优选的，在步骤(1)的LMH细胞培养的方法中经纯化的鹅星状病毒接种于LMH细胞中，37℃，5％CO₂条件下进行培养，培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3～6代，直至80％的LMH细胞出现病变且病变时间控制在72～96小时内，收获病毒液，定为F1代，将收获的F1代病毒液按照同样的方法在LMH细胞中继续繁毒5～10代，分别测定各代次病毒含量，取鹅星状病毒的病毒含量大于等于10^6.0TCID₅₀/0.1ml代次的病毒液接种于驯化好的LMH细胞中进行悬浮培养增殖，收获病毒液。

一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，由上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法制备得到。

优选的,所述鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的病毒含量均不低于10^7.0TCID₅₀/0.1ml。

一种鹅星状病毒二价卵黄抗体，由上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗免疫产蛋鸡获得。

一种鹅星状病毒二价卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：

(a)用上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫；

(b)利用步骤(a)获得的高免疫鸡蛋，分离卵黄，提取抗体。

优选的,步骤(a)的具体方法为：

基础免疫：向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗0.5ml；

二次免疫：在基础免疫后第14日进行第2次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

三次免疫：在二次免疫后第14日进行第3次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

维持免疫：当卵黄中鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的琼扩抗体效价均达到1:96时，维持接种1次，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫10日后，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅1型星状病毒和鹅2型星状病毒的琼扩抗体效价大于等于1:64为合格，收集高免疫鸡蛋；

步骤(b)的具体方法为：

将步骤(a)获得的高免疫鸡蛋的蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下；

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCl溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时；

将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用；

在上清液加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时，用K型多层板框过滤澄清，按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟，后用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；

加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8，将调配合格的抗体用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌后即获得雏鹅痛风精制卵黄抗体。

(1)本发明将鹅星状病毒1型、2型毒株均接种于驯化好的LMH细胞进行悬浮培养，得到的病毒含量高，无需浓缩可直接用于疫苗制备，具有无外源因子污染、易于规模化生产、生产线占用空间小、生产效率高、成本低、能较好的维持病毒抗原稳定等优点，克服了用鹅胚、鹅胚肾细胞、细胞瓶培养的缺点。

(2)本发明所筛选的病毒，经悬浮培养制备的鹅星状病毒1型和2型二价灭活疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；利用血清学方法和免疫攻毒法评估疫苗的免疫效果，结果显示，本发明中制备的鹅星状病毒1型和2型二价灭活疫苗对雏鹅能够提供有效的免疫保护，能够有效的预防雏鹅痛风的发生，具有很好的商品化开发前景。

(3)本发明所提供的二价卵黄抗体可用于制备预防和治疗雏鹅痛风病，安全性良好，接种雏鹅后，未出现因注射抗体引起的任何局部和全身不良反应。采用抗体效价测定和攻毒保护试验对制备的抗体进行评价，结果显示，本发明中制备的抗体琼扩抗体效价均不低于1：16，注射抗体后雏鹅能够抵御病毒的攻击，说明本发明制备的抗体对鹅群能够提供有效的免疫保护，对鹅星状病毒1型、2型均有较好的保护作用，具有很好的商品化开发前景。

图1为新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株的病毒鉴定电泳图。

为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。

本具体实施例中提供的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：

0122)的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株之间没有血清学关系，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式连续传代3代；

(2)对连续传代3代后收获的病毒液进行病毒鉴定，对符合要求的病毒液接种于12～13日龄的鹅胚中，收获24～168小时死亡的鹅胚尿囊液和168小时存活的鹅胚尿囊液，以此方式在12～13日龄鹅胚中继续传3代；

(3)将步骤(2)连续传3代后经纯化的新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株分别采用LMH细胞培养的方式进行增殖，LMH细胞培养的方法为，将鹅星状病毒接种于LMH细胞中，37℃，5％CO₂条件下进行培养，培养增殖后收获病毒液，收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3～6代，直至80％的LMH细胞出现病变且病变时间控制在72～96小时内，收获病毒液且命名为F1，收获的病毒液F1按照同样的方法在LMH细胞中继续繁毒5～10代，分别测定各代次病毒含量，取鹅星状病毒的病毒含量大于等于10^6.0TCID₅₀/0.1ml代次的病毒液接种于驯化好的LMH细胞中进行悬浮培养增殖，收获病毒液；

(4)将步骤(3)中新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株分别采用LMH细胞培养增殖最终获得的病毒液分别灭活，然后将两种分别灭活的病毒液和疫苗佐剂混合乳化即获得鹅星状病毒二价灭活疫苗。；

本具体实施例还提供了一种鹅星状病毒二价灭活疫苗，该二价疫苗由上述的鹅星状病毒二价灭活疫苗的制备方法制备得到，其新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株的病毒含量均不低于10^7.0TCID₅₀/0.1ml。

新型鹅星状病毒WF株分离自山东某鹅场6日龄发病鹅群，新型鹅星状病毒GD0122株分离自广东某鹅场10日龄发病鹅群。

选取发病症状典型的病死鹅肝脏、脾脏、肾脏，胰腺等组织50～100g，用研钵研磨组织，按1:5(w/v)比例加含双抗(含1000U/ml青霉素+1000μg/ml链霉素)的无菌PBS(0.1mol/L，pH 7.2)匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22μm滤器过滤除菌，无菌检验合格后保存备用。将病毒过滤液接种12～13日龄鹅胚，0.2ml/胚，36～37℃每日照胚2次，弃去24小时内死亡的鹅胚，收获24～168小时死亡鹅胚和168小时存活鹅胚尿囊液，置2～8℃冷却12～24小时，收获鹅胚尿囊液，以此方法连续传代3代。

分别取冻融后病毒液200μl，利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，DNA提取试剂盒提取病毒DNA，RNA反转录后，PCR检测鹅副粘、H5、H7、H9亚型禽流感、呼肠孤病毒及星状病毒，DNA PCR检测圆环病毒、禽腺病毒、小鹅瘟、番鸭细小病毒。PCR结束后1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

PCR反应参数：预变性条件为98℃，3分钟，变性条件为98℃，10秒，退火温度和时间为50℃，30秒，延伸温度为72℃延伸20秒，34个循环，最后72℃延伸3分钟。

经扩增，分离毒株仅扩增出了星状病毒相应的目的片段，与预期目的片段大小相符，电泳结果如图1所示，图中，1为新型鹅星状病毒GD0122株，2为新型鹅星状病毒WF株，3为阴性对照，M为Marker。鹅副粘、H5、H7、H9亚型禽流感、呼肠孤病毒、圆环病毒、腺病毒、小鹅瘟、番鸭细小病毒等检测均为阴性。对扩增的目的片段进行测序，序列比对分析、构建进化树表明，WF株为星状病毒1型，GD0122株为星状病毒2型。从分子进化树可分析出，WF株与星状病毒1型毒株FLX(ID:KY271027)、AHDY(ID:MH410610)在同一个分支上，GD0122株与星状病毒2型CXZ株(ID:MH807626)、GD株(ID:MG934571)等2型毒株在同一个分支上。

1.2.2病毒含量检测

0122株第3代鹅胚尿囊液，适当稀释后接种12～13日龄健康鹅胚，0.2ml/胚，置60％湿度、37℃温箱内培养168小时，24小时内死亡的鹅胚弃去，24～168小时死亡的鹅胚随即取出，置4℃保存，至168小时，将未死亡胚全部取出，4℃存放12～24小时后，收取鹅胚尿囊液。依此方法将上述收获的鹅胚尿囊液继续在12～13日龄鹅胚中继代3代，分别标记为D4～D6代。对D5、D6代病毒液纯化后，分别测定其半数感染量EID₅₀，结果如表1所示，D5、D6代EID₅₀均在10^5.0EID₅₀/0.2ml以上。

1.2.3动物回归试验

将WF株、GD0122株分别以肌肉注射途径接种2日龄雏鹅10只，1.0ml/只，雏鹅在攻毒后第4日开始出现死亡，死亡高峰集中在攻毒后7～11日，WF株死亡率为7/10，GD0122株死亡率为8/10。发病雏鹅精神沉郁，排白色稀粪，消瘦，剖检病死雏鹅，可见内脏尿酸盐沉积，输尿管肿大，严重者可见关节处干酪样尿酸盐沉积。

1.2.4病毒中和试验

WF株、GD0122株经继代和纯化制成灭活疫苗，分别免疫30日龄SPF鸡，首免剂量0.5ml/只，加强免疫剂量为1.0ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，3免后10天进行采血，分离血清，经56℃灭活1小时。

采用固定病毒稀释血清法，对WF株、GD0122株阳性血清进行交叉中和效价测定。将WF株、GD0122株分别稀释至200EID₅₀，再逐一与WF株、GD0122株各稀释度阳性血清等体积混合，振荡混匀后，37℃中和1小时，每个中和组接种10日龄鹅胚5枚，0.2ml/枚，每隔24小时观察一次，弃掉24小时以内死亡的鹅胚，连续观察至7天。结果如表2所示，结果表明，鹅星状病毒WF株和GD0122株血清病毒之间无中和作用，中和效价均1:4。这表明新型鹅星状病毒WF株与GD0122株之间无交叉中和能力，它们的抗体只能对本型毒产生很好的中和作用，而对非本型毒则没有中和作用。从交叉中和试验结果来看，鹅星状病毒WF株与GD0122株之间没有血清学关系。

表2鹅星状病毒WF株、GD0122株血清交叉中和试验结果

挑选长满单层的LMH细胞，倒掉瓶内细胞培养液，用PBS洗涤三次，取1.2.2中WF株第6代经纯化后胚毒尿囊液，按培养液2％-5％的比例接种病毒，37℃，5％CO₂条件下进行培养，培养96小时左右，收获病毒液，反复冻融1～2次。收获的病毒液经LMH细胞连续接毒传3～6代，直至80％细胞出现病变且病变时间控制在72～96小时内，收获病毒液，定为F1代，将收获的F1代病毒液按照同样方法继续繁毒5～10代，分别测定各代次病毒含量，取WF株病毒含量≥10^6.0TCID₅₀/0.1ml代次病毒液，接种于驯化好的LMH细胞进行悬浮培养，增殖48-72小时左右收毒，将最终获得的同代次的检验无菌的WF株病毒液混合，置于-20℃中保存。

按同样的方法对GD0122株病毒进行培养增值，将最终获得的同代次的检验无菌的GD0122株病毒液混合，置于-20℃中保存。

在本方案中选用1.2.2中WF株、GD0122株第6代胚毒尿囊液是因为病毒一般在胚上传代3代可以检测到，此时病毒含量低，继续传代才能让病毒含量提高，第六代病毒含量较高，有利于在细胞上繁殖，所以选择了第六代，但是本方案不仅限于选择第六代，选第五代也可以，只要病毒含量满足要求即可。

分别将WF株和GD0122株病毒液导入灭活罐内，按病毒液量终浓度0.1％加入甲醛溶液，连续搅拌条件下，37℃灭活24小时灭活后取出，放2～8℃保存。2.3半成品检验

取灭活的病毒液，按2015年版《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

将灭活的病毒液接种长势良好的LMH细胞(24孔板)4孔，每孔0.2ml，补加维持液至2.0ml，37℃温箱培养，每日观察细胞2次，观察168小时。收集细胞液按同样方法盲传2代，观察并记录细胞病变情况。结果细胞无病变，灭活彻底。

2.3.3病毒含量测定

将灭活前的病毒液分别用维持液作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8 4个稀释度，分别接种已长满单层的LMH细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃、5％CO₂培养箱培养，每日观察1～2次，连续观察168小时。仔细观察细胞出现病变情况，以出现致细胞病变效应(cytopathic

取两等份的两种灭活的抗原液(即灭活的病毒液)与SEPPIC 71R油佐剂按3：7比例进行乳化，先开动电机低速搅拌71R佐剂2分钟，同时徐徐加入抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，不扩散。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不多于0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，结果符合规定。

按现行《中国兽药典》附录进行检查，结果符合规定。

按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

皮下免疫7日龄雏鹅10只，每只颈部皮下分点注射疫苗2.0ml，观察21日，生长发育均正常，精神状态良好，剖检注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。

将疫苗以1.0ml/只的剂量颈部皮下注射种鹅10只，另取10只同日龄种鹅不免疫作对照，免疫后第2周开始每周采血，分离血清，直至免疫后第8周，用琼脂免疫扩散试验法分别测定鹅星状病毒1型、2型血清抗体效价，检测结果见表3。

表3疫苗免疫后抗体水平测定结果

注：出现沉淀线即为阳性。

从表中可以看出，本具体实施例提供的鹅星状病毒二价灭活疫苗从免疫后第3周，星状病毒1型、2型琼扩抗体效价均能达到9/10及以上阳性，而未免疫对照组鹅只，琼扩抗体效价均为阴性。

将疫苗以1.0ml/只的剂量颈部皮下注射种鹅，另设非免疫对照组，免疫后4～8周，收集种蛋，孵化出雏鹅。免疫组选取1日龄雏鹅20只，作为攻毒组，选取非免疫对照组所产子代1日龄雏鹅20只作为对照组，攻毒组和对照组分别随机选取10只，肌肉注射WF株病毒液0.5ml/只(病毒含量约5×10^6.5TCID₅₀)，剩余攻毒组和对照组雏鹅分别肌肉注射GD0122株病毒液0.3ml/只(病毒含量约3×10^6.0TCID₅₀)，观察并详细记录免疫组雏鹅和对照组雏鹅子代的发病情况，结果见表4。

结果显示，种鹅免疫后对子代雏鹅进行攻毒，攻毒后雏鹅观察14日，种鹅免疫组子代雏鹅母源抗体较高，WF株和GD0122株攻毒后免疫组雏鹅全部存活，生长发育正常；对照组全部发病，其中C组死亡6只，D组死亡7只，剖检可见内脏痛风症状，部分病例出现关节痛风症状，耐过鹅生长发育不良，消瘦。

综上，本发明制备的鹅星状病毒1型、2型二价灭活疫苗免疫种鹅后，子代雏鹅星状病毒1型、2型的母源抗体较高，能够有效的预防子代雏鹅痛风的发生。

本具体实施例提供了一种鹅星状病毒二价卵黄抗体，由实施例1的鹅星状病毒二价灭活疫苗免疫产蛋鸡获得，鹅星状病毒二价卵黄抗体的制备的具体步骤为：

(a)用实施例1的鹅星状病毒二价灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫：

基础免疫：向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗0.5ml；

二次免疫：在基础免疫后第14日进行第2次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

三次免疫：在二次免疫后第14日进行第3次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

维持免疫：当卵黄中新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株的琼扩抗体效价均达到1:96时，维持接种1次，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫10日后，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株的琼扩抗体效价大于等于1:64为合格，收集高免疫鸡蛋。

将步骤(a)获得的高免疫鸡蛋的蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下；

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCl溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时；

将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用；

在上清液加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时，用K型多层板框过滤澄清，按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟，后用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；

加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8，将调配合格的抗体用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌后即获得雏鹅痛风精制卵黄抗体。

1.1产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

1.1.1无禽白血病和禽流感感染

按鸡群0.5％抽样采血，应全部为阴性。

1.1.2鸡白痢和鸡支原体

按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

1.1.3产蛋鸡的饲养管理

鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求，鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

1.1.4鸡的疫病防治

根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，按常规在饲料中添加抗菌药物防治细菌感染及添加抗球虫药预防球虫感染等。

1.2采用实施例2中制备的鹅星状病毒1型、2型二价灭活疫苗免疫

基础免疫：向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗0.5ml；

二次免疫：在基础免疫后第14日进行第2次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

三次免疫：在二次免疫后第14日进行第3次接种，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

维持免疫：当卵黄中新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株的琼扩抗体效价均达到1:96时，维持接种1次，向每只鸡胸部肌肉注射鹅星状病毒二价灭活疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫10日后，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，新型鹅星状病毒WF株和新型鹅星状病毒GD0122株的琼扩抗体效价大于等于1:64为合格，收集高免鸡蛋，4～8℃贮存，应不超过10日。

将高免蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，蛋壳污染严重的，事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。随后，鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCl溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时。

将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用。

加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时。

用K型多层板框过滤澄清。

按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟。

用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒。

加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8。

将调配合格的抗体用0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为鹅星状病毒二价卵黄抗体。

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

分别按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，结果符合规定。

7日龄健康雏鹅10只，每只皮下注射2.0ml，观察14日，全部健活。

3.4.1抗体琼扩效价检测

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行琼扩抗体效价检测，记录结果。结果显示鹅星状病毒WF株、GD0122株琼扩抗体效价均不低于1:16。

取3批上述制备的卵黄抗体，每批皮下注射3日龄易感雏鹅(1型、2型鹅星状病毒母源抗体均≤1:4)20只，1.0ml/只；另设对照组20只，分别颈部皮下注射生理盐水，1.0ml/只；所有分组均隔离饲养。

雏鹅分别在接种16小时后攻毒，每批次免疫组及对照组20只雏鹅分别随机分成2组，每组10只，分别肌肉注射WF株、GD0122株病毒液，0.5ml/只，连续观察14日，记录每组雏鹅发病死亡情况。

结果如表5所示，免疫组均9/10及以上保护，生理盐水对照组攻毒后均9/10发病，剖检病死鹅可见内脏尿酸盐沉积，肝脏有白点、脾脏肿大、肾脏肿胀等痛风典型症状

综上，用LMH细胞培养新型鹅星状病毒制备的二价卵黄抗体免疫雏鹅后，星状病毒1型和2型毒株的攻毒试验表明，该二价卵黄抗体对雏鹅星状病毒1型、2型均有较好的保护作用。

表5抗体效价及攻毒保护结果

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化均囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。