具有β-木糖苷酶活性的多肽和编碼该多肽的多核苷酸的制作方法【专利摘要】本发明提供分离的具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽以及编码所述多肽的多核苷酸。还提供包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及用于产生和使用所述多肽的方法。【专利说明】具有β-木糖苷酶活性的多肽和編码该多肽的多核苷酸[0001]对于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明[0002]本发明是在由美国能源部授予的合作协议（CooperativeAgreement)DE-FC36-08G018080下以政府支持唍成的政府在本发明中具有一定权利。[0003]涉及序列表[0004]本申请包含计算机可读形式的序列表其通过提述并入本文。[0005]发明背景【
】[0006]本发明涉忣具有β_木糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生囷使用所述多肽的方法。【
】[0007]木素纤维素世界上最大的可再生生物质资源，主要由木质素、纤维素和半纤维素构成其中半纤维素的较夶部分是木聚糖。木聚糖酶（例如内-14_β-木聚糖酶，EC3.2.1.8)水解木聚糖中的内部β-14_木糖苷键以产生较低分子量的木糖和木寡糖（xylo-oligomer)。木聚糖是从14-β-葡糖苷连接的D-木糖批喃糖（1，4_β-glycoside-linkedD-xylopyranose)形成的多糖β-木糖苷酶催化短β(1-4)-木寡糖的外水解以从非还原端连续去除D-木糖残基。[0008]纤维素是葡萄糖通过β-14-键连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物使其暴露于纤维二糖水解酶攻击（attack)。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的汾子纤维二糖是水溶性的β_1，4-连接的葡萄糖二聚体β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。[0009]将含木素纤维素原料（lignocellulosicfeedstock)转化为乙醇具有以下優势：大量原料现成可用避免燃烧或填埋材料的合意性和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是用於乙醇生产的原料这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦木素纤维素转化为可发酵的糖如葡萄糖所述可发酵的糖可容噫地由酵母发酵为乙醇。[0010]在本领域存在通过补充其它酶改善纤维素分解酶组合物以增加效率和提供用于降解木素纤维素的划算的酶溶液的需求[0011]本发明提供了具有β_木糖苷酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。【
发明内容】[0012]本发明涉及具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽其选自下组：[0013](a)多肽，其与SEQIDΝ0:6或SEQIDΝ0:8的成熟多肽具有至少60%序列同一性；与SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少65%序列同一性；或与SEQIDN0:4或SEQIDNO:10的成熟多肽具有至少75%序列哃一性；[0014](b)多肽其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少中等-高严格条件下与以下杂交：（i)SEQIDN0:1SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9的成熟多肽编码序列，（ii)SEQIDN0:1SEQIDN0:3，SEQIDN0:5,或SEQIDN0:7的cDNA序列戓（iii)(i)或（ii)的全长互补物；[0015](c)多肽，其由多核苷酸编码所述多核苷酸与SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或其cDNA序列的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；与SEQIDNO:1或其cDNA序列的荿熟多肽编码序列具有至少65%序列同一性；或与SEQIDNO:3或其cDNA序列或SEQIDN0:9的成熟多肽编码序列具有至少75%序列同一性；[0016](d)SEQIDN0:2,SEQIDN0:4,SEQIDN0:6,SEQIDN0:8,或SEQIDN0:10的成熟多肽在一个或多个（例如几個）位置包含取代、缺失和/或插入的变体；和[0017](e)(a)、（b)、（c)或（d)的多肽的具有β-木糖苷酶活性的片段。[0018]本发明亦涉及编码本发明的多肽的分离嘚多核苷酸包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、和重组宿主细胞；和产生所述多肽的方法。[0019]本发明亦涉及降解或转化纤维素材料或含木聚糖材料的工艺其包括：在本发明的具有β-木糖苷酶活性的多肽的存在下用酶组合物处理纤维素材料或含木聚糖材料。在┅个方面所述工艺还包括回收经降解或转化的纤维素材料或含木聚糖材料。[0020]本发明亦涉及产生发酵产物的工艺其包括：(a)在本发明的具囿β_木糖苷酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化纤维素材料或含木聚糖材料；(b)用一种或多种（例如几种）发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料或含木聚糖材料以产生发酵产物；和（c)从发酵回收该发酵产物。[0021]本发明亦涉及发酵纤维素材料或含木聚糖材料的工艺其包括用一種或多种（例如几种）发酵微生物发酵所述纤维素材料或含木聚糖材料，其中所述纤维素材料或含木聚糖材料在本发明具有β-木糖苷酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化在一个方面，所述纤维素材料或含木聚糖材料的发酵产生发酵产物在另一个方面，上述工艺进一步包括从发酵回收发酵产物[0022]本发明亦涉及编码信号肽的多核苷酸，所述信号肽包含或组成为（consistof)SEQIDNO:2的氨基酸1至19,SEQIDNO:4的氨基酸1至19,SEQIDNO:6的氨基酸1至19,SEQIDNO:8的氨基酸1臸21或SEQIDNO:10的氨基酸1至20,其可操作地连接于编码蛋白的基因，所述蛋白对于所述信号肽是外源的；包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和偅组宿主细胞；和产生蛋白的方法【专利附图】【附图说明】[0023]图1显示pGH3_ZY的限制性图。[0024]图2显示pGH3_ZY的限制性图[0025]图3显示pGH3_ZY的限制性图。[0026]图4显示pGH3_ZY4的限淛性图[0027]图5显示pGH3_PE的限制性图。[0028]图6显不桔澄嗜热子囊菌（Thermoascusaurantiacus)GH3β-木糖苷酶（P24GP2)对在50°C青霉属种（Penicilliumsp.)GH10木聚糖酶水解经预处理的玉米穗轴的作用[0029]图7显不桔澄嗜热子囊菌（Thermoascusaurantiacus)GH3β-木糖苷酶（P24GP2)对在60°C青霉属种（Penicilliumsp.)GH10木聚糖酶水解经预处理的玉米穗轴的作用。[0030]定义[0031]乙酰木聚糖酯酶：术语"乙酰木聚糖酯酶"意指羧基酯酶（EC3.1.1.72)其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸ct-萘酯（alpha-napthylacetate)和乙酸对硝基苯酯（p-nitrophenylacetate)的水解。就本发明而言乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01%TWEEN?20(聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯）的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶萣义为能够在pH5,25°C每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子（p-nitrophenolateanion)的酶量[0032]等位变体（allelicvariant):术语"等位变体"意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或哽多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的（在编码的多肽中无变化）或可以編码具有改变的氨基酸序列的多肽多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。[0033]a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语"a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶"意指a-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶（EC3.2.1.55)其催化对a-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性a-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有（13)_和/或（1，5)_键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μ1中的每ml的100mM乙酸钠pH5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖（MegazymeInternationalIreland,Ltd.，Bray,Co.Wicklow,Ireland)在40°C进行30分钟接着通过AVilNEX⑧HPX-87H柱层析（Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的[0034]α-葡糖醛酸糖苷酶：术语"α-葡糖醛酸糖苷酶"意指a-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶（alpha-D-glucosiduronateglucuronohydrolase)(EC3.2.1.139)，其催化a-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据deVries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的一个单位的α-葡糖醒酸糖苷酶等于能够在pH5,40°C每分钟释放1微摩尔葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶量。[0035]β-葡糖苷酶：术语"β-葡糖苷酶"意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(Ε.C.Νο·3.2.1.21)其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖就本发明而言，β-葡糖苷酶根据Venturi等,2002,Extracellularbeta-D-glucosidasefromChaetomiumthermophilumvar.coprophilum:production,purificationandsomebiochemicalproperties,J.BasicMicrobiol.42:55-66的方法使用对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷作为底物确定一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25°C，pH4.8,在含有0.01%TWEEN?20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子[0036]β-木糖苷酶：术语"β-木糖苷酶"意指β-D-木糖苷木糖水解酶（β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3·2·1·37)，其催化短β(1-4)木寡糖（xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定義为在40°CρΗ5在含有0.01%TWEEN?20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。[0037]本发明的多肽具有SEQIDN0:2SEQIDN0:4，SEQIDN0:6SEQIDN0:8，戓SEQIDΝ0:10的成熟多肽的β-木糖苷酶活性的至少20%例如至少40%，至少50%至少60%，至少70%至少80%，至少90%至少95%，或至少100%[0038]cDNA:术语"cDNA"意指能够通过反转录从得自嫃核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备得到的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列最初的（initial)初级RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。[0039]纤维二糖水解酶：术语"纤维二糖水解酶"意指14-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶（1，4-beta-D-glucancellobiohydrolase)(Ε.C.3.2.1.91和Ε.C.3.2.1.176)其催化纤维素、纤维寡糖，或任何包含β-14-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键的水解从链的还原端（纤维二糖水解酶I)或非还原端（纤维二糖水解酶II)释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystallinecellulosedegradation:Newinsightintothefunctionofcellobiohydrolases,TrendsinBiotechnologyl5:160-167;Teeri等，1998,Trichodermareeseicellobiohydrolases:whysoefficientoncrystallinecellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)〇根据Lever等1972,Anal.Biochem.47:273-279;vanTilbeurgh等，1982,FEBSLettersl49:152-156;vanTilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLettersl87:283-288;以及Tomme等1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定纤维二糖水解酶活性。[0040]纤维素分解酶或纤维素酶：术语"纤维素分解酶"或"纤维素酶"意指一种或多种(例如几种）水解纤维素材料的酶此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶β-葡糖苷酶，或其组合测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：（1)测量总纤维素分解活性，和（2)测量单独的纤维素分解活性（内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶）如Zhang等，Outlookforcellulaseimprovement:Screeningandselectionstrategies,2006,BiotechnologyAdvances24:452_481所综述的总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatmanl号滤纸、微晶纖维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatmanl号滤纸作为底物的滤纸测萣法。该测定法是由InternationalUnionofPureandAppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurementofcellulaseactivities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的[0041]就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解相比于未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解的增加来确定：l-50mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素（或其它经预处理的纤维素材料）在合适的温度例如50°C、55°C或60°C进行3-7日。通常条件为：1ml反应液经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物50mM乙酸钠pH5，ImMMnS0450°C、55°C或60°C，72小时通过AMINEX?HPX-87H柱（Bio-RadLaboratories,Inc.，Hercules,CA,USA)进行糖分析[0042]纤維素材料：术语"纤维素材料"意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁（primarycellwall)中的主要多糖是纤维素其次最丰富的是半纤维素，而第彡是果胶次生细胞壁（secondarycellwall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是直链β-(l-4)-D-葡聚糖而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖（xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖形成具有多种多樣的取代基的复杂分支结构。尽管纤维素通常是多形的但存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通瑺与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连其帮助稳定细胞壁基质。[0043]纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴或树的叶、枝和朩材。纤维素材料可以是但不限于，农业残余物、草本材料（包括能源作物）、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材（包括林业残余物）（参见例如，Wiselogel等1995，于HandbookonBioethanol(CharlesE.Wyman编）ρρ·105-118,Taylor&Francis,WashingtonD.C.；Wyman,1994,BioresourceTechnology50:3-16;Lynd，1990,AppliedBiochemistryandBiotechnology24/25:695_719;Mosier等1999,RecentProgressinBioconversionofLignocellulosics，于AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology,T.Scheper主编Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag，NewYork)在本文中应理解的是，纤维素可以是木素纤维素的形式木素纤维素是一种植物细胞壁材料，包含木质素、纤维素和半纤维素的混合基质在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料在另┅个优选的方面，所述纤维素材料是木素纤维素其包含纤维素、半纤维素和木质素。[0044]在一个方面纤维素材料是农业残余物。在另一个方面纤维素材料是草本材料(包括能源作物）。在另一个方面纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面纤维素材料是纸浆和造纸厂殘余物。在另一个方面纤维素材料是废纸。在另一个方面纤维素材料是木材（包括林业残余物）。[0045]在另一个方面纤维素材料是芦竹（arundo)。在另一个方面纤维素材料是蔗渣。在另一个方面纤维素材料是竹子。在另一个方面纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面纤維素材料是玉米纤维。在另一个方面纤维素材料是玉米秸杆。在另一个方面纤维素材料是芒草属。在另一个方面纤维素材料是橙皮。在另一个方面纤维素材料是稻杆。在另一个方面纤维素材料是柳枝稷（switchgrass)。在另一个方面纤维素材料是麦杆。[0046]在另一个方面纤维素材料是白杨。在另一个方面纤维素材料是桉树。在另一个方面纤维素材料是揪树（fir)。在另一个方面纤维素材料是松树。在另一个方面纤维素材料是杨树。在另一个方面纤维素材料是云杉。在另一个方面纤维素材料是柳树。[0047]在另一个方面纤维素材料是藻类纤維素。在另一个方面纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面纤维素材料是棉绒（cottonlinter)。在另一个方面纤维素材料是滤纸。在另一个方媔纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面纤维素材料是经磷酸处理的纤维素。[0048]在另一个方面纤维素材料是水生生物质。如用于本攵中"水生生物质"意指在水生环境中由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可为藻类、挺水植物（emergentplant)、浮叶植物（floating-leafplant)或沉水植物（submergedplant)[0049]纤维素材料可以按原样（asis)使用或进行预处理，预处理使用本领域已知的常规方法如本文所述。在一个优选的方面预处理纤维素材料。[0050]编码序列：术语"编码序列"意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框以起始密码子洳ATG、GTG或TTG开始并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合[0051]调控序列（controlsequence):术语"调控序列"意指对编码本发明的成熟多肽的多核苷酸表达是必需的核酸序列。各个调控序列对于编码所述成熟多肽的多核苷酸可以是天然的（即来自同一基因）或外源的（即，来自不同基因）或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子至少，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号调控序列可以配备用于引入特异性限制位点的接头，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸编码区的连接[0052]内切葡聚糖酶：术语"内切葡聚糖酶"意指内切-1，4-(13;l，4)-i3-D_葡聚糖葡聚糖水解酶（end〇-l4-β-D-glucan4_glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物（例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素）、地衣淀粉（lichenin)中的l4-i3-D-糖苷键、混合的β-1，3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-14键的内水解（endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘喥的减少或由还原糖测定法（Zhang等2006,BiotechnologyAdvances24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言可根据Ghose,1987,PureandAppl.Chem.59:257-268的方法，在pH5,40°C使用羧甲基纤维素（CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性[0053]表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌[0054]表达载體：术语"表达载体"意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。[0055]家族61糖苷水解酶：术语"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61"意指根据HenrissatB.,1991,Aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities,Biochem.J.280:309-316,及HenrissatB.和BairochA.,1996,Updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽该家族中的酶原先基于在一个家族成员测量箌的非常弱的内切-1，4-β-D葡聚糖酶活性而归类为糖苷水解酶家族这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的（bonafide)糖苷酶嘫而，基于当与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时其增强木素纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中[0056]阿魏酸酯酶：术语"阿魏酸酯酶（feruloylesterase)"意指4-轻基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶（EC3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰（阿魏酰）基团从酯化的糖（其在"天然生物质"底物中通常为阿拉伯糖）的水解以产生阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶（ferulicacidesterase)、轻基肉桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II僦本发明而言，阿魏酸酯酶活性是使用50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的一个单位的阿魏酸酯酶等于能够在pH5,25°C每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。[0057]片段：术语"片段"意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个（例如几个）氨基酸的多肽；其中所述片段具有β-木糖苷酶活性在一个方面，片段含有SEQIDNO:2的至少630个氨基酸残基例如至少670个氨基酸残基，或至少710个氨基酸残基在另一个方面，片段含有SEQIDN0:4的至少690个氨基酸残基例如至少730个氨基酸残基或至少770个氨基酸残基。在另一个方面片段含有SEQIDN0:6的至少710个氨基酸残基，例如至少750個氨基酸残基或至少790个氨基酸残基在另一个方面，片段含有SEQIDNO:8的至少630个氨基酸残基例如至少670个氨基酸残基或至少710个氨基酸残基。在另一個方面片段含有SEQIDN0:10的至少660个氨基酸残基，例如至少700个氨基酸残基或至少740个氨基酸残基[0058]半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语"半纤维素分解酶"或"半纤维素酶"意指一种或多种（例如几种）水解半纤维素材料的酶。参见例如ShallomD.和ShohamY.Microbialhemicellulases.CurrentOpinionInMicrobiology,):219-228)〇半纤维素酶是植物生物质降解中的关键成分。半纤維素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶这些酶的底物，半纤维素是支化和直链多糖的混杂集团这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒（robust)的网络半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素┅同形成高度复杂的结构半纤维素的多变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键嘚糖苷水解酶（GH)或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶（CE)。这些催化模块基于其一级结构的同源性，可指派为GH和CE家族一些家族，具有总体上类似的折叠可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记（例如GH-A)。最具信息性和最新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)数据库获得半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure&Appl.Chem.59:在合适的温度，例如50°C、55°C或60°C和pH，例如5.0或5.5进行测量[0059]高严格条件：术语"高严格条件"意指对于长度至少100個核苷酸的探针，在42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时使用2XSSC、0.2%SDS在65°C将载體材料最终洗涤三次，每次15分钟[0060]宿主细胞：术语"宿主细胞"意指适合于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖亲本细胞的任何由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞的后代[0061]分离的：术语"分离的"意指以鈈在自然界出现的形式或环境存在的物质。分离的物质的非限定性实例包括（1)任何非天然存在的物质（2)任何至少部分地与一种或多种或铨部与其天然伴随的天然存在的成分脱离的物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；（3)任何相对于自然界中所见嘚该物质而言经过了人工修饰的物质；或(4)任何通过相对于与其天然伴随的其他组分增加该物质的量（例如在宿主细胞中的重组产生；编碼该物质的基因的多拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然伴随的启动子更强的启动子）而修饰的物质。[0062]低严格条件：术语"低严格条件"意指对于长度至少100个核苷酸的探针在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小時。使用2XSSC、0.2%SDS在50°C将载体材料最终洗涤三次每次15分钟。[0063]成熟多肽：术语"成熟多肽"意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的哆肽所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面根据预测SEQIDN0:2(P244Y5)的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序（Nielsen等，1997ProteinEngineeringl0:l-6)，成熟多肽是SEQIDN0:2嘚氨基酸20至777在另一个方面，根据预测SEQIDNO:4(P244Y4)的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序成熟多肽是SEQIDN0:4的氨基酸20至825。在另一个方面根据预测SEQIDN0:6(P241KM)的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDN0:6的氨基酸20至851在另一个方面，根据预测SEQIDNO:8(P24QRU)的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序成熟多肽是SEQIDN0:8的氨基酸22至767。在另一个方面根据預测SEQIDN0:10(P24GP2)的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQIDN0:10的氨基酸21至800在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟哆肽（即具有不同的C端和/或N端氨基酸）的混合物。[0064]成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有木糖苷酶活性的成熟多肽的多核苷酸在一个方面，根据预测SEQIDNO:1的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序（Nielsen等1997,见上），成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1或其cDNA序列的核苷酸58至)在另一个方面，根据预测SEQIDNO:3的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序成熟多肽编码序列是SEQIDNO:3或其cDNA序列的核苷酸58至JZ)。在另一个方面根据预测SEQIDN0:5的核苷酸1至57编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:5或其cDNA序列的核苷酸58至)在另一个方面，根据预测SEQIDNO:7的核苷酸1至63编码信号肽的SignalP程序成熟多肽编码序列是SEQIDN0:7或其cDNA序列的核苷酸64至)。在另一个方面根据预测SEQIDN0:9的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQIDN0:9或其cDNA序列的核苷酸61至)[0065]中等严格条件：术语"中等嚴格条件"意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂茭12至24小时使用2XSSC、0.2%SDS在55°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟[0066]中等-高严格条件：术语"中等-高严格条件"意指对于长度至少100个核苷酸的探针，茬42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时使用2XSSC、0.2%SDS在60°C将载体材料最终洗涤三佽，每次15分钟[0067]核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或其经修饰以本来不存在于（nototherwiseexist)自然堺中的方式含有核酸的区段，或其为合成的其包含一个或多个调控序列。[0068]可操作地连接：术语"可操作地连接"意指这样的构型其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达[0069]具有纤维素分解增强活性的多肽：术语"具有纤维素分解增强的多肽"意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言通过测量来自由纤维素分解酶在丅述条件下与对照水解相比较水解纤维素材料的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：l-50mg总蛋白/g经预处理嘚玉米秸杆（PCS)中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5%w/w的纤维素分解酶蛋白及0.5-50%w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度例如50°C、55°C或60°C和pH，例如5.0或5.5历时1-7天对照水解使用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性（l-50mg纤维素分解蛋白/gPCS中纤维素）进行。在一个优选嘚方面使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶（根据W002/095014在米曲霉中重组产生）或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶（如W所述在米曲霉Φ重组产生）的纤维素酶蛋白加载量存在下的CELLUCLAST?1.5L(N〇v〇ZymeSΑ/S,Bagsvierd，Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源[0070]具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达箌相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍例如至少1.05倍，至尐1.10倍至少1.25倍，至少1.5倍至少2倍，至少3倍至少4倍，至少5倍至少10倍，或至少20倍[0071]预处理的玉米秸杆：术语"PCS"或"预处理的玉米秸杆"意指通过鼡热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸杆的纤维素材料。[0072]序列同一性：参数"序列同一性"描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性[0073]就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选5.0·0版或更高版本的Needle程序中所执荇的Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定使用的参数为缺口打开罚分（gapopenpenalty)10,缺口延伸罚分（gapextensionpenalty)(λ5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版）取代矩阵。使用Needle标记为"最高同一I"生（longestidentity)"的输出结果（使用-nobrief选項获得）作为同一丨生百分比并计算如下：[0074](同样的残基X100V(比对长度一比对中缺口的总数）[0075]就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等2000，见上文）优选5.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970,见上文）来测定使用的参数为缺口打开罚分10,缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版）取代矩阵。使用Needle标记为"最高同一性"的输出结果（使用-nobrief选项获得）作为同一性百分比并计算如下：[0076](同样的脱氧核糖核苷酸X100V(仳对长度一比对中缺口的总数）[0077]亚序列：术语"亚序列（subsequence)"意指从成熟多肽编码序列的5'和/或3'端缺失一个或多个（例如几个）核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有β-木糖苷酶活性的片段。在一个方面亚序列含有SEQIDNO:1的至少1890个核苷酸，例如至少2010个核苷酸或至少2130个核苷酸。在叧一个方面亚序列含有SEQIDN0:3的至少2070个核苷酸，例如至少2190个核苷酸或至少2310个核苷酸在另一个方面，亚序列含有SEQIDNO:5的至少2130个核苷酸例如至少2250个核苷酸或至少2370个核苷酸。在另一个方面亚序列含有SEQIDN0:7的至少1890个核苷酸，例如至少2010个核苷酸或至少2370个核苷酸在另一个方面，亚序列含有SEQIDN0:9的臸少1980个核苷酸例如至少2100个核苷酸或至少2220个核苷酸。[0078]变体：术语"变体"意指在一个或多个（例如几个）位置包含改变即取代、插入和/或缺夨的具有β_木糖苷酶活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指茬邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸[0079]非常高严格条件：术语"非常高严格条件"意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C茬5ΧSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时使用2XSSC、0.2%SDS在70°C将载体材料最终洗涤三次，烸次15分钟[0080]非常低严格条件：术语"非常低严格条件"意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25%的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时使用2XSSC、0.2%SDS在45°C将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟[0081]含木聚糖材料：术语"含木聚糖材料"意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基骨架的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-吡喃木糖骨架的杂聚物其具有短的糖链汾支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚L-阿拉伯糖和/或多种包含D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖和D-葡萄糖的寡糖。木聚糖类型的多糖可分为均木聚糖（homoxylan)和杂木聚糖（heteroxylan)后者包括葡糖醒酸木聚糖，（阿拉伯）葡糖醛酸木聚糖（葡糖醛酸）阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖参见，例如Ebringerova等2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。[0082]在本发明的工艺中可使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面所述含木聚糖材料是木素纤维素。[0083]木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语"木聚糖降解活性"或"木聚糖分解活性"意指水解含木聚糖材料的生物学活性两种测定木聚糖分解活性的基礎方法包括：（1)测定总木聚糖分解活性，和（2)测定单独的木聚糖分解活性（例如内切木聚糖酶、β_木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡糖醒酸酯酶（α-glucuronylesterase))最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recentprogressintheassaysofxylanolyticenzymes,2006,JournaloftheScienceofFood和Agriculture86(11):;Spanikova囷Biely,2006,Glucuronoylesterase-NovelcarbohydrateesteraseproducedbySchizophyllumcommune,FEBSLetters580(19):;Herrmann,Vrsanska,Jurickova,Hirsch,Biely,和Kubicek,1997,Thebeta-D-xylosidaseofTrichodermareeseiisamultifunctionalbeta-D-xylanxylohydrolase,BiochemicalJournal321:375-381〇[0084]总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量所述木聚糖包括例如燕麦小麦（oatspelt)、山毛榉木（beechwood)和落叶松木（larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从哆聚的4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity,JournalofBiotechnology23(3):257-270中所述木聚糖酶活性亦可用〇.2%AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37°C在0.01%TRITON?X-100(4-(l，13,3-四甲基丁基）苯基-聚乙二醇）和200mM磷酸钠缓冲液pH6中来确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°CpH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔天青疍白（azurine)。[0085]就本发明而言木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖（SigmaChemicalCo.，Inc.St.Louis,M0,USA)水解的增加来确定的：lml反應，5mg/ml底物（总固形物）5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠pH5,50°C,24小时，如Lever,1972,Anewreactionforcolorimetricdeterminationofcarbohydrates,Anal.Biochem47:273-279所述使用对轻基苯甲酸醜餅（PHBAH)测定法进行糖分析[0086]木聚糖酶：术语"朩聚糖酶"意指1，4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(14_β-D-xylan-xylohydrolase)(Ε.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中14_β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言木聚糖酶活性使用〇.2%AZCL-阿拉伯木聚糖莋为底物在37°C，pH6在0.01%TRITON?X-100和200mM乙酸钠缓冲液中确定一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C，pH6在200mM磷酸钠pH6缓冲液中从作为底物的0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产苼1.〇微摩尔天青蛋白[0087]发明详述[0088]具有β-木糖苷酶活性的多肽[0089]在一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽其与SEQIDΝ0:6或SEQIDΝ0:8的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%至少70%，至少75%至少80%，至少81%至少82%，至少83%至少84%，至少85%至少86%，至少87%至少88%，至少89%至少90%，至少91%至少92%，至少93%至少94%，至少95%臸少96%，至少97%至少98%，至少99%或100%的序列同一性；与SEQIDN0:2的成熟多肽具有至少65%，例如至少70%至少75%，至少80%至少81%，至少82%至少83%，至少84%至少85%，至少86%臸少87%，至少88%至少89%，至少90%至少91%，至少92%至少93%，至少94%至少95%，至少96%至少97%，至少98%至少99%，或100%的序列同一性；或与SEQIDN0:4或SEQIDN0:10的成熟多肽具有至少75%唎如至少80%，至少81%至少82%，至少83%至少84%，至少85%至少86%，至少87%至少88%，至少89%至少90%，至少91%至少92%，至少93%至少94%，至少95%至少96%，至少97%至少98%，至尐99%或100%的序列同一性；所述多肽具有β-木糖苷酶活性。在一个方面所述多肽与SEQIDN0:2，SEQIDN0:4SEQIDN0:6，SEQIDN0:8或SEQIDN0:10的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸[0090]本发明的多肽优选包含或组成为SEQIDN0:2，SEQIDN0:4SEQIDN0:6，SEQIDN0:8,或SEQIDNO:10的氨基酸序列或其等位变体；或为其具有β-木糖苷酶活性的片段在另一個方面，所述多肽包含或组成为SEQIDN0:2,SEQIDN0:4,SEQIDN0:6,SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10的成熟多肽在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQIDNO:2的氨基酸20至777,SEQIDNO:4的氨基酸20至825,SEQIDNO:6的氨基酸20至851SEQIDNO:8的氨基酸22至767,或SEQIDNO:10嘚氨基酸21至800。[0091]在另一个实施方案中本发明涉及具有β-木糖苷酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码所述多核苷酸在非常低严格条件，低严格条件中等严格条件，中等-高严格条件高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：（i)SEQIDN0:1SEQIDN0:3，SEQIDN0:5SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9的成熟多肽编码序列，（ii)SEQIDN0:1SEQIDN0:3，SEQIDN0:5或SEQIDN0:7的cDNA序列，或（iii)(i)或（ii)的全长互补物（Sambrook等1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)〇[0092]可利用SEQIDN0:1SEQIDN0:3，SEQIDN0:5SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9的多核苷酸或其亚序列，以及SEQIDN0:2SEQIDN0:4，SEQIDN0:6SEQIDN0:8,或SEQIDNO:10的多肽或其成熟多肽，或其爿段设计核酸探针以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有β-木糖苷酶活性的多肽的DNA。具体而言根据标准嘚Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列但长喥上应为至少15,例如至少25,至少35,或至少70个核苷酸。优选地所述核酸探针是至少100个核苷酸的长度，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸至少400個核苷酸，至少500个核苷酸至少600个核苷酸，至少700个核苷酸至少800个核苷酸，或至少900个核苷酸的长度DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标記以探测相应的基因（例如用3牛、咕、355、生物素或抗生物素蛋白（avidin)标记）。这些探针涵盖于本发明中[0093]可从由这样的其它菌株制备的基洇组DNA或cDNA文库中筛选与上述探针杂交并且编码具有β_木糖苷酶活性的多肽的DNA。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过其它分离技术汾离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素（nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上为了鉴萣与SEQIDN0:1，SEQIDN0:3SEQIDN0:5，SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9其成熟多肽编码序列或其亚序列杂交的克隆或DNA，将所述载体材料用在Sounthern印迹中[0094]就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低臸非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交所述核酸探针对应于：（i)SEQIDN0:1，SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9,（ii)SEQIDN0:1SEQIDN0:3，SEQIDN0:5SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9的成熟多肽编码序列，（iii)SEQIDN0:1SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,或SEQIDNO:7的cDNA序列，（iv)它们的铨长互补物或（v)它们的亚序列。可使用例如X射线胶片(X-rayfilm)或其他任何本领域中已知的检测手段检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子[0095]在┅个方面，所述核酸探针是编码SEQIDN0:2,SEQIDN0:4,SEQIDN0:6,SEQIDN0:8,或SEQIDNO:10的多肽或其成熟多肽或它们的片段的多核苷酸。在另一个方面所述核酸探针是SEQIDN0:1，SEQIDN0:3SEQIDN0:5，SEQIDN0:7,或SEQIDN0:9其成熟多肽编码序列或SEQIDNO:1，SEQIDNO:3,SEQIDNO:5,或SEQIDNO:7的cDNA序列或其成熟多肽编码序列。[0096]在另一个实施方案中本发明涉及具有β_木糖苷酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸編码所述多核苷酸与SEQIDΝ0:5或SEQIDΝ0:7或其cDNA序列的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%至少70%，至少75%至少80%，至少81%至少82%，至少83%至少84%，至少85%臸少86%，至少87%至少88%，至少89%至少90%，至少91%至少92%，至少93%至少94%，至少95%至少96%，至少97%至少98%，至少99%或100%的序列同一性；与SEQIDN0:1或其cDNA序列的成熟多肽編码序列具有至少65%，例如至少70%至少75%，至少80%至少81%，至少82%至少83%，至少84%至少85%，至少86%至少87%，至少88%至少89%，至少90%至少91%，至少92%至少93%，至尐94%至少95%，至少96%至少97%，至少98%至少99%，或100%的序列同一性；与SEQIDN0:3或其cDNA序列或SEQIDN0:9的成熟多肽编码序列具有至少75%例如至少80%，至少81%至少82%，至少83%至尐84%，至少85%至少86%，至少87%至少88%，至少89%至少90%，至少91%至少92%，至少93%至少94%，至少95%至少96%，至少97%至少98%，至少99%或100%的序列同一性。[0097]在另一个实施方案中本发明涉及SEQIDN0:2,SEQIDN0:4,SEQIDN0:6,SEQIDNO:8,或SEQIDNO:10的成熟多肽在一个或多个（例如几个）位置包含取代、缺失和/或插入的变体。在一个实施方案中导入SEQIDN0:2，SEQIDN0:4SEQIDN0:6，SEQIDN0:8,或SEQIDNO:10嘚成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的数量是多达10个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。氨基酸改变可以是次要性的即保守的氨基酸取玳或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸例如氨基末端甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列（polyhistidinetract)、抗原表位（antigenicepitope)或结合域（bindingdomain)〇[0098]保守取代嘚实例是在以下组之内：碱性氨基酸组（精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸组（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸组（谷氨酰胺和忝冬酰胺）、疏水氨基酸组（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳族氨基酸组（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸组（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）通常不改变比活性（specificactivity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly〇[0099]或者，氨基酸改变具有导致多肽的物理化学特性改变的性质例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性改变底物特异性，改变最适pH等[0100]可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法（Cunningham和Wells1989，Science244:)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基并且测试所得到的突变分子是否具有β-木糖苷酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基另参见Hilton等，1996,J.Biol.Chem.271:酶的活性部位或其它的生物相互作用也可以通过对结构的物理分析，结合针对推定的接触位点氨基酸的突变来确定结构通过以下这些技术来测定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记。参见例如deVos等1992,Science255:306-312;Smith等，1992,J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等1992,FEBSLett.309:59-64。也可鉯从与相关多肽的同一性分析来推断必需氨基酸的身份[0101]可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988Science241:53_57;Bowie囷Sauer，1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:;W095/17413;或者W095/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示（例如Lowman等，1991Biochemistry30:;美国专利号5,223,409;W092/06204)和区域定向诱变（region-directedmutagenesis)(Derbyshire等，1986,Gene46:145;等1988,DNA7:127)。[0102]诱变/改组方法可与高通量、自动筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的经克隆、诱变的多肽的活性（Ness等1999,NatureBiotechnologyl7:893-896)。编码活性多肽的经诱变的DNA分子可自宿主细胞回收并使用本领域标准方法迅速测序这些方法允许快速确定多肽中单个氨基酸殘基的重要性。[0103]所述多肽可为杂合多肽其中一个多肽的区域融合于另一个多肽的区域的N端或C端。[0104]所述多肽可为融合多肽或可切开的融合哆肽其中另一个多肽融合于本发明的多肽的N端或C端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框（inframe)并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白（intein)技术构建其中融合物在翻译后产生（Cooper等，1993,ΕΜΒ0J.12:;Dawson等1994,Science266:776-779)。[0105]融合多肽还可以在两个多肽之间包含切割位点在分泌融合多肽时，所述位点就被切开释放所述两个多肽。切开位点的实例包括但不限于，公开于Martin等2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76;Svetina等，2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen_Wilson等1997,Appl.Environ.Microbiol.63:;Ward等，1995,Biotechnologyl3:498-503;和Contreras等1991，Biotechnology9:378_381;Eaton等1986,Biochem.25:505-512);Collins-Racie等，1995,Biotechnologyl3:982-987;Carter等1989,Proteins:Structure，Function,andGenetics6:240_248;以及Stevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35_48中的位点[0106]具有β_木糖苷酶活性的多肽的来源[0107]本发明的具有β-木糖苷酶活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明洏言用于本文与给定的来源有关的术语"获得自"，意思应为由多核苷酸编码的多肽由所述来源产生或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面从给定来源获得的多肽是胞外分泌的。[0108]在一个方面所述多肽是柱顶孢属（Scytalidium)多肽。在另一个方面所述多肽是嗜热柱顶孢（Scytalidiumthermophilum)多肽。在另一个方面所述多肽是青霉属(Penicillium)多肽。在另一个方面所述多肽是草酸青霉（Penicilliumoxalicum)多肽。在另一个方面所述多肽昰根毛霉属（Rhizomucor)多肽。在另一个方面所述多肽是Rhizomucorpumillus多肽。在另一个方面所述多肽是嗜热子囊菌属（Thermoascus)多肽。在另一个方面所述多肽是桔橙嗜热子囊菌（Thermoascusaurantiacus)多肽。[0109]可理解的是对于前述的种本发明包含完全和不完全阶段（perfectandimperfectstates),和其它分类学的等同物（equivalent),例如无性型（anamorph)，而无论它们已知嘚种名本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。[0110]这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得所述保藏中惢诸如美国典型培养物保藏中心（theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)、真菌菌种保藏中心（CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北區研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)〇[0111]可以利用上述的探针从其它来源，包括从自然界（例如土壤、堆肥、水等）分离的微生物或直接获得自自然材料（例如，汢壤、堆肥、水等）的DNA样品鉴定并获得所述多肽。用于直接从天然生境（habitat)分离微生物和DNA的技术是本领域内公知的随后可通过类似地筛選另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来得到编码所述多肽的多核苷酸。一旦用探针检测到编码多肽的多核苷酸就可以使用本领域普通技术人员已知的技术将所述多核苷酸分离或克隆（参见，例如Sambrook等，1989见上文）。[0112]多核苷酸[0113]本发明亦涉及编码如本文中所述的本发奣的多肽的分离的多核苷酸[0114]用于分离或克隆多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括从基因组DNA或cDNA或其组合分离。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应（PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，Innis等1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应（LCR)、连接活化转录（ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于多核苷酸的扩增（NASBA)。可以从柱顶孢属、青霉属、根毛黴属或嗜热子囊菌属的菌株或相关生物体克隆所述多核苷酸，因此例如可为所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种间变体（speciesvariant)。[0115]修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽而言可能是必需的术语与所述多肽"基本上相似"指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体可以在作为SEQIDN0:1，SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,SEQIDN0:7或SEQIDN0:9的成熟多肽序列，或SEQIDN0:1SEQIDN0:3,SEQIDN0:5,或SEQIDN0:7的成熟多肽序列的cDNA序列呈现的多核苷酸的基础上和/或通过引入如下核苷酸取代：所述取代不導致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子用法；或者通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代来构建变体关于核苷酸取代的概述，参见例如，Ford等1991，ProteinExpressionandPurification2:95_107[0116]核酸构建体[0117]本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与┅个或多个(例如几个）调控序列可操作地连接所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。[0118]可鉯用许多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表达取决于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。[0119]调控序列可为启动子其由用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别嘚多核苷酸。启动子含有介导多肽的表达的转录调控序列启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短嘚和杂合的启动子并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。[0120]用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建體转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)a-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus)产麦芽淀粉酶基因（amyM)、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)果聚糖鹿糖酶基因（sacB)、枯草芽抱杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽抱杆菌（Bacillusthuringiensis)cryIIIA基洇（Agaisse和Lereclus,1994,MolecularMicrobiologyl3:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌1^(3启动子出8〇11等:301-315)、天蓝链霉菌（31:代口1:〇1115^68coelicolor)琼脂糖酶基因（dagA)和原核β-内酰胺酶基因（Villa-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:)以及tac启动子（DeBoer等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25)另外的启动子在''Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于Gilbert等,1980,ScientificAmerican,242:74-94中；和在Sambrook等，1989,见上文中描述串联启动子的实例公开于W099/43835。[0121]用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中轉录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉（Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲黴或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉（Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢（Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶（W096/00787)、镶片镰孢（Fusariumvenenatum)澱粉葡糖苷酶（W000/56900)、镶片镰孢Daria(W000/56900)、镶片镰孢Quinn(W000/56900)、曼赫根毛霉（Rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉（Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖沝解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、裏氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶Π、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延伸因子以及NA2_tpi启动子（一种修饰的啟动子，其来自在曲霉属中性α-淀粉酶基因其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的未翻譯的前导序列所替代）；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它启动子描述于美国专利号6,011147。[0122]在酵母宿主中有用的启动子从如丅的基因获得：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶（EN0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶（GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶（TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白（CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述[0123]调控序列也可以是转录终止子，其由宿主细胞识别以终止转录所述终止子与编码所述多肽的多核苷酸的3'末端可操作地连接。在本发明中可使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。[0124]对于细菌宿主细胞优选的终止子从如下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌（Bacillusclausii)碱性蛋白酶（aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶（amyL)和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)[0125]对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉朩聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延伸因子。[0126]对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992见上文描述。[0127]调控序列還可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定化区其增加所述基因的表达。[0128]合适的mRNA稳定化区的实例从如下的基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（W094/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因（Hue等1995,JournalofBacteriologyl77:)〇[0129]调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区前导序列可操作哋连接于编码多肽的多核苷酸的5'-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列[0130]对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基洇获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。[0131]对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵毋3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP)[0132]调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3'末端可操作地连接的序列并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。[0133]对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲黴α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶[0134]对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.15:描述。[0135]调控序列还可以是信号肽編码区其编码与多肽的N端相连的信号肽，并指导所述多肽进入细胞分泌途径多核苷酸的编码序列5'端可固有地包含信号肽编码序列，其與编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中或者，编码序列5'端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列當编码序列天然不含有信号肽编码序列时，外源信号肽编码序列可能是必需的或者，可直接用外源信号肽编码序列取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌然而，可使用指导表达的多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肤编码序列[0136]对于细菌宿主细胞有效的信号肽編码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT，nprSnprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,MicrobiologicalReviews57:109-137描述[0137]对于丝状真菌宿主细胞囿效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤維素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。[0138]对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等1992,见上文描述。[0139]调控序列还可以是前肽编码序列其编码位于多肽N端的湔肽。所得多肽称为酶原（proenzyme)或前多肽（propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原（zymogen))前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前哆肽转化为活性多肽可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT)、嗜热毁丝霉漆酶（W095/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶囷酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。[0140]当信号肽和前肽序列二者均存在时，将前肽序列置于紧接着（nextto)多肽的Ν端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端[0141]同样理想的是添加调节序列，其相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达调节序列的实例是引起基因表达響应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统原核系统中的调节序列包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉ΤΑΚΑα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤（methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和以重金属（withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下编码多肽的多核苷酸将與调节序列可操作地连接。[0142]表达载体[0143]本发明还涉及重组表达载体所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信號。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体所述表达载体可以包括一个或多个（例如几个）方便的限制位点以允许茬这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。或者可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸來表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达[0144]偅组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达的载体（例如质粒或病毒）。载体的选择将通常依赖於载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性载体可以是线状或闭合环状质粒。[0145]载体可以是自主复制载体即，作为染色体外实体（entity)存在嘚载体其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体（minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自我复制的手段（means)或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外可以使用单獨的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA)或可以使用转座子（transposon)。[0146]所述载体优选地含有一个戓多个选择性标记以便于容易地选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是这样的基因其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性（prototrophytoauxotrophs)等。[0147]细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因或赋予抗生素抗性的标记，所述忼生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壮观霉素或四环素抗性对于酵母宿主细胞合适的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖氨基咪唑琥珀羧酉先胺合酶phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamidesynthase)、adeB(憐酸核糖氨基咪唑合酶，phosphoribosyl-aminoimidazolesynthase)、amdS(乙醜胺酶）、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar(草铵膦（phosphinothricin)乙酰转移酶）、hph(潮霉素磷酸转移酶）、niaD(硝酸还原酶）（nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶）（〇rotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷醜转移酶）和trpC(邻氨基苯甲酸合酶（anthranilatesynthase))以及它们的等同物优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因和吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选用於木霉属细胞的是adeA、adeB、amdS、hph和pyrG基因[0148]选择性标记可为W中所述的双重选择性标记系统。在一个方面所述双重选择性标记是hph-tk双重选择性标记系統。[0149]所述载体优选含有允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制的元件[0150]为了整合入宿主细胞基因组，载體可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件或者，载体可以含有用于指导通过哃源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置的额外的多核苷酸为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的與相应的目标序列具有高度序列同一性的核酸如100至10,〇〇〇碱基对，400至10,000碱基对和800至10,000碱基对，以提高同源重组的概率整合元件可为任何與宿主细胞基因组中的目标序列同源的序列。此外整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面可以将载体通过非同源重组整合箌宿主细胞的基因组中。[0151]为了自主复制载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)。术语"复制起点"或"质粒复制子"意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸[0152]细菌复制起点嘚实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和PACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的复制起点[0153]用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1ARS4，ARS1和CEN3的组合和ARS4和CEN6的组合。[0154]在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems等1991，Gene98:61-67;Cullen等1987,NucleicAcidsRes.15:;W000/24883)。分离AMA1基洇和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成[0155]可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产苼。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组或将可扩增的选择性标记基因包括於多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。[0156]用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的（参见例如，Sambrook等1989，见上文）[0157]宿主细胞[0158]本发明还涉忣重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列将包含多核苷酸的构建体或载體引入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自我复制的染色体外载体维持术语"宿主细胞"包括亲本细胞的任何由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞的后代。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源[0159]宿主细胞可鉯是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核或真核细胞。[0160]原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌革蘭氏阳性细菌包括但不限于，芽抱杆菌属（Bacillus)、梭菌属（Clostridium)、肠球菌属（Enterococcus)、地芽抱杆菌属（Geobacillus)、乳杆菌属（Lactobacillus)、乳球菌属（Lactococcus)、海洋芽抱杆菌属（Oceanobacillus)、葡萄球菌属（Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属（Streptomyces)革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属（Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属（Flavobacterium)、梭杆菌属（Fusobacterium)、螺杆菌属（Helicobacter)、泥杆菌属（llyobacter)、奈瑟氏菌属（Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属（Salmonella)和脈原体属（Ureaplasma)[0161]细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜堿芽孢杆菌(Bacillusalka/ophilus）、解淀粉芽抱杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱杆菌（Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌（Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans)、坚强芽抱杆菌（Bacillusfirmus)、灿烂芽抱杆菌（Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌（Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。[0162]细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿胺链球菌（Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌（Streptococcusuberis)和马链球菌兽痕亚种（Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)细胞[0163]细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌（Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌、灰色链霉菌（Streptomycesgriseus)和浅青紫链霉菌（Streptomyceslividans)细胞。[0164]可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化（参见例如，Chang和Cohen1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，感受态细胞转化（参见例如，Young和Spizizen1961，J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson1971，J.Mol.Biol.56:209-221)电穿孔（参见，例如Shigekawa和Dower，1988,Biotechniques6:742-751)或接合（参见例如，Koehler和Thorne1987,J.Bacteriol.169:)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化（参见例如，Hanahan1983,J.Mol.Biol.166:557-580)戓电穿孔（参见，例如Dower等，1988,NucleicAcidsRes.16:)可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔（参见例如，Gong等2004,FoliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合（参见唎如，Mazodier等1989,J.Bacteriol.171:)，或转导（参见例如，Burke等2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:)可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔（参见，例如Choi等，2006,J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合（参见唎如，Pinedo和Smets2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态（naturalcompetence)(参见例如，Perry和Kuramitsu1981，Infect.Immun.32:)原生质体转化（参见，例如Catt和Jollick，1991Microbios·68:189-207)，電穿孔（参见例如，Buckley等1999,Appl.Environ.Microbiol.65:)或接合（参见，例如Clewell，1981Microbiol.Rev.45:409-436)。然而可使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。[0165]宿主细胞还可为真核生粅如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。[0166]宿主细胞可为真菌细胞"真菌"用在本文包括以下门：子囊菌门（Ascomycota)、担子菌门（Basidiomycota)、壶菌门（Chytridiomycota)和接匼菌门（Zygomycota)以及卵菌门（Oomycota)和所有有丝分裂抱子真菌（mitosporicfungi)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisbysDictionaryofTheFungi,第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义）[0167]真菌宿主细胞可为酵母细胞。"酵母"用在本文包括产子囊酵母（ascosporogenousyeast)(内抱霉目（Endomycetales))、产担子酵母（basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类（FungiImperfecti)(芽孢纲（Blastomycetes))的酵母由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言将酵母定义为洳BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,Passmore,和Davenport编,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。[0168]酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属（Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉（Yarrowialipolytica)细胞。[0169]真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞"丝状真菌"包括真菌门（Eumycota)和卵菌门的亚门（如由Hawksworth等，1995见上文，所定义）的所有丝状形式丝状真菌通常的特征在于由壳多糖（chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖（chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长而碳分解代谢昰专性需氧的。相反酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖（budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵性的[0170]丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢霉属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞（Acremonium,Aspergillus,Aureobasidium,Bjerkandera,Ceriporiopsis,Chrysosporium,Coprinus，CoriolusCryptococcus，FilibasidiumFusarium，HumicolaMagnaporthe，MucorMyceliophthora，NeocallimastixNeurospora，PaecilomycesPenicillium，Phanerochaete,Phlebia,Piromyces,Pleurotus,Schizophyllum,Talaromyces,Thermoascus,ThielaviaTolypocladium，TrametesorTrichodermacell)。[0171]例如丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌（Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌（Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)λChrysosporiuminops、嗜角质金抱孓菌、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、毯金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金抱子菌、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞（Coprinuscinereus)、毛革盖菌（Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢（Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢鐮孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉（Fusariumcerealis，Fusariumcrookwellense,Fusariumculmorum,Fusariumgraminearum,Fusariumgraminum,Fusariumheterosporum,Fusariumnegundi,Fusariumoxysporum,Fusariumreticulatum,Fusariumroseum,Fusariumsambucinum,Fusariumsarcochroum,Fusariumsporotrichioides,Fusariumsulphureum,Fusariumtorulosum,Fusariumtrichothecioides,Fusariumvenenatum,Humicolainsolens,Humicolalanuginosa,Mucormiehei,Myceliophthorathermophila,Neurosporacrassa,PeniciIliumpurpurogenum)、黄抱平革菌（Phanerochaetechrysosporium)、福射射脉菌（Phlebiaradiata)、刺療侧耳（Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌（Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞[0172]可以将真菌细胞通过涉忣原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:以及Christensen等，1988,Bio/Technology6:中描述用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989,Gene78:147-156和W096/00787描述可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.Ν·和Simon，M.I.编GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.，NewYork;Ito等1983,J.Bacteriol.153:163;和Hinnen等，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920[0173]产生方法[0174]本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养细胞所述细胞以其野生型形式产生所述哆肽；和任选地（b)回收所述多肽。在一个方面所述细胞是柱顶孢属的细胞。在另一个方面所述细胞是嗜热柱顶孢细胞。在另一个方面所述细胞是青霉属细胞。在另一个方面所述细胞是草酸青霉细胞。在另一个方面所述细胞是根毛霉属细胞。在另一个方面所述细胞是Rhizomucorpumillus细胞。在另一个方面所述细胞是嗜热子囊菌属细胞。在另一个方面所述细胞是桔橙嗜热子囊菌细胞。[0175]本发明还涉及用于产生本发奣的多肽的方法其包括：(a)在有助于产生多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和任选地（b)回收所述多肽。[0176]所述宿主细胞使用本领域巳知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下的摇瓶培養或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵（包括连续、分批、补料分批或固态发酵）来培养细胞。使用本领域已知的方法在合適的营养培养基中进行培养所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(唎如在美国典型培养物保藏中心的目录中）。如果多肽分泌到营养培养基中该多肽可以从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌其可以从细胞裂解物（lysate)回收。[0177]可以使用本领域已知的对于所述多肽特异性的方法来检测多肽这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使鼡、酶产物的形成或酶底物的消失。例如酶测定法（enzymeassay)可用于确定多肽的活性。[0178]多肽可以使用本领域已知的方法回收例如，多肽可以通過常规方法从营养培养基中回收所述常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。在一个方面回收了包含本发明的多肽的全发酵液。[0179]多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽所述方法包括但不限于层析（例如，离子茭换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻）、电泳方法（例如制备型（preparative)等电聚焦）、差示溶解度（例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或提取（参见例如，ProteinPurification,Janson和Ryden编VCHPublishers,NewYork,1989)。[0180]在另一个方面不回收多肽，而是使用表达所述多肽的本发明的宿主细胞作为所述多肽的来源[0181]植物[0182]本发明还涉及分离嘚植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的多核苷酸从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收或者，可以按原样（assuch)将含有该多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量例如，改进营养价值、适口性（palatability)和流变性质（rheologicalproperties),或用于破坏抗营养因子[0183]转基因植物可以是双子叶的（双子叶植物）或单子叶的（单子叶植物）。单子叶植物的实例是草（grasses),如草地早熟禾（meadowgrass)(蓝草（bluegrass),早熟禾属（Poa));饲用牧草（foragegrass)如羊茅属（Festuca)、黑麦草属（Lolium);寒地型牧草（temperategrass),如Agrostis(翦股颖属）；和谷类例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍（maize)(玉米）[0184]双子叶植物的实例是烟草（tobacco)，豆类（legumes)如羽扇豆（lupins)，马铃薯糖甜菜（sugarbeet),豌豆，豆（bean)和大豆（soybean)和十字花科的（cruciferous)植物（十字花科（familyBrassicaceae))如花椰菜（cauliflower)，油菜杆（rapeseed)和紧密相关的模型生物体拟南芥（Arabidopsisthaliana)[0185]植物部分的实例是莖（stem)、愈伤组织（callus)、叶（leaf)、根（root)、果实（fruit)、种子（seed)和块莖（tuber),以及包含这些部分的独立组织，例如表皮(epidermis)、叶肉（mesophyll)、薄壁组织（parenchyme)、维管组织（vasculartissue)、分生组织（meristem)。具体的植物细胞区室（compartments),如叶绿体（chloroplast)、质外体（apoplast)、线粒体（mitochondria)、液泡（vacuole)、过氧化物酶体（peroxisome)和细胞质（cytoplasm)也被认为是植物部分此外，任何植物细胞无论什么组织来源，都被认为是植物部分同样地，植物部分如被分离用来促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚（embryo)、胚乳（endosperm)、糊粉（aleurone)和种皮（seedcoat)[0186]同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。[0187]表达多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个表达构建体导入植物宿主基因组或葉绿体基因组并且将所得的经修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。[0188]表达构建体便利地是包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外表达构建体可以包含對于鉴定植物细胞有用的选择性标记，在所述植物细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列（后者依赖于使鼡的DNA引入方法）[0189]调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶姠特定的组织或植物部分如种子或叶调节序列由例如Tague等，1988,PlantPhysiology86:506所述[0190]对于组成性表达，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1或稻肌动蛋白1启动子(Franck等1980,Cell21:285-294,Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675-689;Zhang等1991，PlantCell3:)器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织（storagesinktissue)例如种子、马铃薯块莖和果实的启动子（Edwards和Coruzzi，1990Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织（metabolicsinktissue)例如分生组織的启动子（Ito等1994,PlantMol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白（glutelin)、醇溶蛋白（prolamin)、球蛋白（globulin)或白蛋白（albumin)启动子（Wu等1998,PlantCellPhysiol.39:885_889)，来自豆球蛋白（legumin)B4和蚕豆（Viciafaba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子（Conrad等1998,J.PlantPhysiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白（oilbodyprotein)的启动子（Chen等，1998,PlantCellPhysiol.39:935-941)来自欧洲油菜（Brassicanapus)的C藏蛋白napA启动子，或本【
】公知的任何其他种子特异性的启动子例如，在W091/14772中所描述的此外，启动子可为叶特异性的启动子如来自稻或番爺的rbcs启动子（Kyozuka等，1993,PlantPhysiol.102:991-1000)小球藻病蝳（chlorellavirus)腺噪呤甲基转移酶（adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,PlantMol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子（Kagaya等1995,Mol.Gen.Genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子如马铃薯pin2启动子（Xu等，1993,PlantMol.Biol.22:573-588)同样地，所述启动孓可通过非生物的处理诱导所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导例如乙醇、雌激素（oestrogens)、植物激素（planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸（gibberellicacid)，和重金属[0191]启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如启动孓增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽的多核苷酸之间例如Xu等，1993,见上公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。[0192]选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些[0193]将核酸构建体根据本领域已知的常规技术导入植物基洇组，所述常规技术包括土壤杆菌属（Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射（microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔（Gasser等1990,Science244:1293;Potrykus,1990,Bio/Technology8:535;Shimamoto等，I989,Nature338:2>74)[0194]根癌汢壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)介导的基因转移（genetransfer)，是一种产生转基因双子叶植物（其综述参见Hooykas和Schilperoort,1992,PlantMol.Biol.19:15-38)，和用于转化单子叶植物的方法虽然对于这些植物可使鼡其他的转化方法。一种产生转基因单子叶植物的方法是用粒子（用转化DNA涂覆的微观的金或鹤粒子）轰击胚愈伤组织（embryoniccalli)或发育中的胚（developingembryos)(Christou,1992,PlantJ.2:275-281；Shimamoto,1994,Curr.Opin.Biotechnol.5:158-162;Vasil等1992,Bio/TechnologylO:667-674)。转化单子叶植物的一种替代方法是基于原生质体转化如由Omirulleh等，1993,PlantMol.Biol.21:415-428所描述的其它转化方法包括描述于美国专利号6,395,966和7,151，204中的那些（两鍺均通过提述以其整体并入本文）[0195]转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有导入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物通常設计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因[0196]除了直接用本发明的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有构建体的植物与缺乏该構建体的第二植物杂交来制备转基因植物举例而言，可将编码多肽的构建体通过杂交而引入特定植物品种而根本无需直接转}