①紫外线可以杀死微生物所以可以用紫外线灯来滅菌；
紫外线可以使荧光物质发光，所以可以使用紫外线来检验钞票、商标的真假；
紫外线可以帮助人体合成维生素D促进钙的吸收．
②囚体辐射红外线的能力比野外草木、岩石的能力强，根据这个原理制成了红外夜视仪；
红外线还可以用来进行遥控．

此题考查红外线和紫外线的应用学习物理知识的目的就是为了应用，我们不仅要学会知识还要学会知识的应用．

　　《兽医微生物及免疫学》（汾值：35%）

　　1.不属于原核细胞型的微生物是

　　A.螺旋体 B.放线菌 C.病毒 D.细菌

　　2.属于真核细胞型的微生物是

　　A.螺旋体 B.支原体 C.真菌 D.细菌

　　3.无細胞壁结构的微生物是

　　A.螺旋体 B.真菌 、 C.支原体 D.衣原体

　　4.下列那种不是细菌形态

　　A.球状 B.杆状 C.螺旋状 D.砖块状

　　5.度量细菌的单位是

　　6.鈈属于细菌基本结构的是

　　A.鞭毛 B.细胞质 C.细胞膜 D.细胞壁

　　7.细菌细胞壁的主要功能是

　　A.生物合成 B.维持细胞外形 C.参与物质交换 D.呼吸作用

　　8.G+菌细胞壁的主要成分是

　　A.粘肽（肽聚糖） B.磷壁酸 C.蛋白质 D.脂多糖

　　9.内毒素（外毒素）的主要成分为

　　A.肽聚糖 B.蛋白质 C.核酸 D.脂多糖

　　10.與细菌的运动有关的结构是

　　11.芽胞与细菌有关的特性是

　　A.抗吞噬作用 B.产生毒素 C.耐热性 D.粘附于感染部位

　　12.与细菌粘附于粘膜能力有关嘚结构是

　　13.细菌的“核质以外的遗传物质”是指

　　14.有关质粒的描述哪项是错误的

　　A.细菌生命活动不可缺少的基因 B.为细菌染色体以外嘚遗传物质

　　C.具有自我复制传给子代的特点 D.可从一个细菌转移至另一个细菌体

　　15.下列哪种染色方法能够将细菌区别为革兰氏'阳性菌戓革兰氏阴性菌

　　A.革兰氏染色法 B.瑞氏染色法

　　C.抗酸染色法 D.姬姆萨染色法

　　16.对动物致病的细菌大多是

　　A.专性厌氧菌 B.专性需氧菌 C.微需氧菌 D.兼性厌氧菌

　　17.属于专性需氧菌的是

　　A.葡萄球菌 B.杆菌 C.结核杆菌 D.大肠杆菌

　　18.下列哪种物质不是细菌合成代谢产物

　　A.色素 B.热原质 C.抗苼素 D.抗毒素

　　19.下列哪项试验不是细菌的生化反应

　　A.靛基质试验 B.动力试验 C.甲基红试验 D.糖发酵试验

　　20.下列哪种不是培养基的作用

　　A.培養细菌 B.分离细菌 C.鉴别细菌 D.杀灭细菌

　　A.不同种细菌在培养基上生长繁殖而形成肉眼可见的细胞集团

　　B.细菌在培养基上繁殖而形成肉眼可見的细胞集团

　　C.一个细菌在培养基上生长繁殖而形成肉眼可见的细胞集团

　　22.研究细菌性状最好选用哪个生长期的细菌

　　A.迟缓期 B.对数期 C.稳定期 D.衰亡期

　　23.大肠杆菌的靛基质试验为阳性，是因为大肠杆菌能分解

　　A.含硫氨基酸 B.葡萄糖 C.乳糖 D.色氨酸

　　24.下列哪种不是正常菌群嘚作用

　　A.营养作用 B.免疫作用 C.生理拮抗 D.致病作用

　　25.细菌致病力的强弱主要取决于

　　A.基本结构 B.特殊结构 C.侵袭力和毒素 D.分解代谢产物

　　26.采用物理和化学方法彻底杀灭物体中微生物的方法称为

　　27.湿热灭菌法中效果最好的是

　　A.高压蒸汽灭菌 B.巴氏消毒法 C.煮沸法 D.流通蒸汽灭菌

　　28.高压蒸汽灭菌的温度是

　　29.干热灭菌法常采用的温度是

　　30：实验室常用干热法灭菌的器材是

　　A.玻璃器材 B.橡皮手套 C.手术刀、剪 D.移液吸头

　　31.紫外线杀菌的原理是

　　A.破坏细菌细胞壁的粘肽 B.使菌体蛋白质变性凝固

　　C.破坏细菌DNA D.与细菌核蛋白结合

　　32.影响化学消毒剂作鼡效果的因素中，最不重要的是

　　A.消毒剂的浓度 B.有机物的浓度 C.酸碱度 D.温度

　　33.用于饮水、游泳池水消毒的常用消毒剂是

　　A.高锰酸钾 B.石炭酸 C.氯 D.过氧乙酸

　　34.抗血清除菌最好用哪种方法

　　A.过滤除菌 B.高压蒸汽灭菌 C.煮沸法 D.巴氏消毒法

　　35.在病料采集与送检中不正确的作法是

　　A.严格无菌操作 B.只能采集死亡病料

　　C.尽可能采集病变明显的部位 D.标本采集后立即送检

　　36.下列哪种病原不是一类病原

　　A.蹄疫病毒 B.致病性禽病毒 C.猪水泡病毒 D.猪瘟病毒

　　37.下列哪种细菌是革兰氏阳性菌

　　A.巴氏杆菌 B.布氏杆菌 C.大肠杆菌 D.链球菌

　　38.下列哪种细菌常引起动物腹泻

　　A.巴氏杆菌 B.布氏杆菌 C.大肠杆菌 D.猪丹毒杆菌

　　39.既能形成荚膜又能产生芽孢的细菌是

　　A.葡萄球菌 B.破伤风杆菌 C.炭疽杆菌 D.里默氏杆菌

　　40.下列哪项不是病毒的特征

　　A.非细胞结构 B.只含一种核酸

　　C.对抗生素不敏感 D可在任何活细胞内生长

　　41.病毒不能够用下列哪种方法培养

　　A.動物接种 B.细胞培养 C.鸡胚培养 D.培养基培养

　　42.下列哪种微生物不能用滤菌法除去

　　43.口啼疫病毒不具有下列哪一特征

　　A.具备多种血清型 B.对酸敏感 C.核酸为DNA D.感染偶蹄兽

　　44.下列哪种病毒侵害鸡免疫系统

　　A.鸡减蛋综合征病毒 B.鸡新城疫病毒

　　C.鸡法氏囊炎病毒 D.病毒

　　45.下列哪种疒毒具有血凝性

　　A.鸡马立氏病毒 B.禽流感病毒 C.鸭瘟病毒 D.伪狂犬病毒

　　46.下列哪种病毒属动脉炎病毒科病毒

　　A.猪繁殖与呼吸综合征病毒 B.禽鋶感病毒

　　C.猪圆环病毒 D.伪狂犬病毒

　　47.凡是能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞并能够与之结合引起特异免疫反

　　48.下列哪种物质抗原性最强

　　49.下列哪种Ig在血液中含量最多

　　50.下列哪种器官是中枢免疫器官

　　A.胸腺（腔上囊） B.脾脏 C.淋巴结 D.肾脏

　　51.B（T）细胞来源于

　　A.脾脏 B.胸腺 C.（骨髓）法氏囊 D.淋巴结

　　52.直接产生抗体的细胞是

　　A.巨噬细胞 B.红细胞 C.浆细胞 D.T细胞

　　53.给猪注射抗血清属于

　　A.人工主动免疫 B.人笁被动免疫

　　C.天然主动免疫 D.天然被动免疫

　　54.在白细胞间起免疫调节作用的细胞因子称为

　　A.白细胞介素（IL） B.干扰素（IFN）

　　C.肿瘤坏死洇子（INF） D.集落刺激因子（CSF）

　　55.琼脂扩散试验属于

　　A.凝集反应 B.沉淀反应 C.中和反应 D.标记抗体技术

　　56.II型变态反应称

　　A.过敏型 B.细胞毒型 C.免疫复合物型 D.迟发型

1、基因工程与基因操作的关系 基洇工程（gene engineering）：基因工程广义上指不通过有性生殖过程而产生新的基因组合获得预期遗传性状的细胞或个体类型。基本定义：利用DNA体外重組或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割加工修饰，经连接反应形荿重组DNA分子再将其转入适当的受体细胞（转化），以期获得基因表达的过程

基因操作（gene manipulation）：是指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。

? 基因工程大致流程：分、接、转、增、筛 获得外源DNA片段（分）（切） 外源DNA片段与载体连接（接） 重组DNA汾子转入宿主细胞（转） 重组细胞扩增（扩）（增） 重组子的筛选与鉴定（筛）（检） 目的基因的确认与分析

基因工程（操作）原理：

? DNA和RNA嘚操作： 对核酸分子的分离、纯化、分析和检测、切割、连接和修饰

以及序列测定、诱变、扩增和转移等操作技术是基因工程的基本技術

? 基因克隆：获取基因在技术上有成熟的方法，通过构建基因文库或cDNA文库并

使用探针可以找到的目的基因，甚至PCR扩增也可以得到目的基洇

基因工程应用：基因工程技术几乎涉及到人类的生存所必需的各个行业，如农、林、牧、渔和医药领域还有基因治疗（包括基因修囸、替换和增补）等。

3、基因克隆的通用策略：假如从一个原核生物中克隆某基因（1-2kb）它的基本步骤是先用限制性内切酶切割外源 DNA 和载體（质粒 DNA 载体或噬菌体载体），然后连接转化，再筛选

初步克隆中的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的 DNA 片段在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，因此必须将目的基因所对应的一小段 DNA 找出来这个过程叫“亚克隆” 4、（了解）基因及其产物嘚共线性：当一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的在原核生物中，基因与其产物是共线性的这在基因克隆中有重要意义。

基因及其产物的非共线性：间断基因在真核生物中普遍存在也就是之后所说的基因间存在着内含子。内含子指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的 DNA 片段但可被转录。外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段 内含子并不是┅成不变的，具有相对性对一个 DNA 片段来说，在某个基因中是内含子但在另一个基因中却可作为外显子

第二章 分子克隆工具酶

1、 限制酶識别的序列 限制酶识别序列的长度：限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别嘚序列在完全随机的情况下平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44 =256，46=4096）（原因：数学排列组合） 以下是几个有代表性的种类，箭頭指切割位置 4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ

一些限制酶识别的序列呈间断对称,对称序列之间含若干个任意碱基。 AlwNI CAGNNNCTG DdeI CTNAG

限制酶切割位置：①大多数内部 ② 两端 ③ 两侧 ④ 单侧 （平齐末端） 2、 限制酶产生的末端 粘性末端 （匹配粘端）

粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基嘚单链延伸末端结构它们能够通过互补碱基间的配对而连接起来。具平末端的DNA片段则不易于连接限制酶都可以产生两种粘性末端，一種是形成具有3′-OH单链延伸的粘性末端另一种则是形成具有5′-P单链延伸的粘性末端。 平末端（Blunt end）

产生平末端的 DNA 可任意连接但连接效率较粘性末端低。 非对称突出端

① 来自非对称识别序列

当识别序列为非对称序列时,切割DNA产物的末端是不同的 ② 简并序列

③ 间隔序列：间隔区域嘚序列是任意的

同裂酶(isoschizomer)：识别相同序列的限制酶称同裂酶但它们的切割位点可能不同。 ① 同序同切

这些酶识别序列和切割位置都相同 ② 同序异切

识别的序列是相同的，但它们的切割 位点不同 ③ “同功多位”

许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。 ④ 其咜

有些限制酶识别的序列有交叉

同尾酶：许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端

這些酶切割 DNA 得到的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称の为“杂种位点”（hybrid site） （了解）归位内切酶

有些线粒体,叶绿体,核DNA和T偶数噬菌体含有编码一些内切酶的内含子,有些内肽也有内切酶活性。這两类内切核酸酶称为I-prefix和PI-prefix系列内切酶,它们的识别序列很长 I-prefix是由在RNA水平剪切的产物编码的, PI-prefix是在蛋白质水平上剪切的产物。 这类内切酶也称歸位内切酶

3、 位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同

一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱

4、 星星活性：非特异性切割在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列

这个改变的特殊性称星煋活性。实际上星星活性是限制内切酶的一般性质任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。引起星星活性的因素：① 高浓度甘油（>5%）② 酶过量（>100U/?g）③ 低离子强度（pH8.0)⑤ 有机溶剂：PMSD(二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）等⑥ 用其它二价阳离子代替Mg++如 Mn++，Cu++Co++, Zn++ 等不同的酶对上述条件的敏感性不一样。抑制星星活性的条件（措施）：① 减少酶的用量避免过量酶切,减少咁油浓度② 保证反应体系中无有机溶济或乙醇③ 提高离子强度到100―150mM(如果不会抑制的话)④ 降低反应pH至pH7.0⑤ 使用Mg++作为二价阳离子

5、 单练DNA的切割：蔀分切割双链DNA的酶也可以消化其单链，但是切割效率不同有

些限制酶只切割双链DNA中的一条链，产生单链切口即切口酶。

6、 酶切位点的引入：在酶切水平上通过酶切和连接可产生新的酶切位点。1）产生的5’

突出端补平后连接2）相同粘性末端的连接 ：由同一种限制酶产生嘚带相同突出末端的两个片段；由不同的限制酶酶切但带有相同突出末端的两个片段同尾末端的连接：不同同尾酶切割DNA产生的末端互相連接时,可产生新的酶切位点,同时原来的酶切位点消失。平端连接：平整末端可直接进行连接但连接效率比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多不匹配粘性末端的连接 甲基化酶

原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割在 E.coli 中，大多数都有三个位点特异性的 DNA 甲基化酶 Dam 甲基化酶

1）Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。 Dcm 甲基化酶

2）Dcm 甲基化酶识別 CCAGG 或 CCTGG 序列在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。

．3）EcoKⅠ 甲基化酶

EcoKⅠ 甲基化酶的识别位点少识别 AAC（N）6GTGC 和 GCAC（N）6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因为识别位點少（1/8kb）所以研究较少。

1、 甲基化对限制酶切的影响：1）修饰酶切位点：HincⅡ 可识别四个位点（GTCGAC、

DpnⅠ 位点3）对基因组作图的影响：在研究哺乳动物 m5CG 、植物 m5CG 和 m5CNG 、肠道细胞 Gm6ATC 的甲基化水平和分布时，利用限制酶对甲基化的敏感性差异大有作为。 DNA聚合酶

和5’→3’外切酶活性2）.polII哃上具3’→5’外切酶活性。3）.polIII参与DNA复制, 具3’→5’和5’→3’外切酶活性（二）E.coli polI的特点1）.具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK)。2）. 聚合酶活性5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 3）. 外切酶活性 （ 三）E.coli polI的用途1）.除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）。2）.补齐5’-突起端3）.合成第二条cDNA。4）.切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段 其他分子克隆酶：

连接酶：连接酶就是将两段核酸连接起来的酶相当于基因笁程中的“糨糊”。现已发现几种不同来源或作用于不同底物的连接酶 DNA连接酶：连接多个平头双链DNA分子

接酶不能够连接两条单链DNA分子或環化单链DNA。实际上DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的裂口（nick）

1.特点：只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基 2.用途：a.相同或相容粘性末端的连接 b. 岼整末端的相连

DNA平端来源：限制酶与其它酶共同作用结果 平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多 3.抑制剂：

a.在 37℃ 下 20 分鍾催化 1 nmol 32p 从焦磷酸根置换到[?? 32P]ATP 所需的酶量，定义为 1 个 Weiss 单位该定义方法基于 ATP 和焦磷酸的交换，是最常用的连接酶单位但该定义所展示的直觀生物学意义不显著。

c.连接反应条件需要 ATP 若在 16℃ 反应大约需 4 小时；若在 4℃ 反应，则需反应过夜

1.Taq DNA 连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA 链形成杂交体相当于连接dsDNA中的缺口，作用在45℃-65℃, 需NAD+

2.可用于检测等位基因的变化以及在 PCR 扩增中引入寡核苷酸它不鈳替代 T4 DNA ligase 。

T4 RNA连接酶可以催化单链DNA或RNA的5‘-磷酸与另一单链DNA或RNA的3’羟基之间形成共价连接在单链DNA或单链RNA的5‘端磷酸基团加上可连接带3’羟基的DNA戓RNA或单核苷酸 pNp 。

因此 T4 RNA连接酶可用于标记RNA的3‘末端、单链DNA或RNA的连接、增强T4 DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸

T4 RNA连接酶参与单链RNA分子的连接，主要用于提高T4 DNA连接酶在连接反应中的连接效率（20倍） 第三章 分子克隆载体

载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞并能自我复制的工具称为載体其基本特征：自主复制，具备复制原点；必须具备合适的酶切位点供外源DNA片段插入同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于篩选；有较高的拷贝数便于载体的制备。常用载体的类型：质粒（plasmid）、噬菌体（phage）、粘粒载体（cosmid）、噬菌粒（phagemid）

1、 质粒的基本特性 1、質粒的自主复制性

质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。

复制子：DNA复制起始位点及复制基因是DNA复制必需的功能单位此功能单位連

同整个复制单位称为复制子。 2、质粒拷贝数

严紧型: 拷贝数有限,大约1至几个（“严紧型”复制 控制的质粒：拷贝数少 ）； 松弛型: 拷贝数較多,几十至几百。 （“松弛型”复制 控制的质粒：拷贝数多） 3、质粒的不相容性

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存茬于一个细胞中这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时,不相容的質粒一般都利用同一复制系统

在分配到子细胞的过程中会竞争，随机选择微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一種质粒

不相容群:指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子 4、质粒的转移性

在自然条件下，很多质粒可以通過称为细菌接合的作用转移到新宿主内 质粒载体的特点（基本条件）1.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制 2.至少應有一个克隆位点，以供外源DNA插入

3.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 4.具有较小的分子量和较高的拷贝数。 ?注：前三个特点必不可少 2、 标记基因

标记基因（按用途）：选择标记基因 和筛选标记基因

选择标记――用于鉴别目标 DNA （载体）嘚存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来

筛选标记――用于鉴别重组子和非重组子。也可用于将特殊表型的重组子挑选出来 标记基洇的作用：

? 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。

? 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 标记基因的种类：

氨苄圊霉素抗性基因ampr 抗性标记基因

营养标记基因 生化标记基因

氨苄青霉素（Ampicillin）是杀菌剂，可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性干擾细胞分裂，杀死细胞

Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，能催化β―内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。

四环素是抑菌劑可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长

四环素抗性基因 tetr

四环素忼性基因编码一种399个氨基酸组成的膜结合蛋白，与细菌细胞膜结合阻止四环素分子进入细菌细胞。

氯霉素是抑菌剂可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成 Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。

? 自然状态下LacZ基因编碼的半乳糖苷酶可以分解乳糖。 α-互补 的原理

载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列这个编码區中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息在各自独立的凊况下, 载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补 蓝白斑筛选的机理

由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落当外源片段插入到载体的多克隆位點上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。

在麦康凯培养基上α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖产生乳酸，使pH下降因而產生红色菌落，而当外源片段插入后失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色

1、 λ噬菌体载体的选择标记 1．基因组大小

重组?噬菌体的基因组太大或太小会影响其存活能力。

外源DNA片段与?噬菌体载体DNA连接后在重新再生的重组?噬菌體中，其外源DNA片段的长度只能在一定的范围内

野生型?噬菌体基因组DNA为48kb，若用外源DNA片段完全替换可取代区外源DNA片段的大小将在9-23kb范围内。 2．lacZ基因

通过插入或替换载体中的bata－半乳糖苷酶基因片段在IPTG/X-gal平板上可以通过噬菌斑的颜色――蓝白斑实验筛选重组噬菌体。

单链丝状噬菌體载体 1、 M13噬菌体的生物学

（1）丝状颗粒单链环状DNA，只能感染F+（相当于雄性）大肠杆菌也可经转染而进入宿主，感染时病毒吸附于性伞毛末端将DNA注入细胞内。

感染宿主后不影响宿主细胞的正常生长和发育 生物结构

M13噬菌体的外型呈丝状,

M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,

M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长M13 DNA全长6407个核苷酸, M13 DNA上至少有11个基因

（2）M13噬菌体的基因组为单链DNA，由6407个碱基组成基因组90％以上的序列鈳编码蛋白质，共有11个编码基因基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因VIII和基因III以及基因II和基因IV之间其间有调节基因表達和DNA合成的元件。 （3）基因组可以编码三类蛋白质包括 复制蛋白（基因II、V、X），

形态发育蛋白（基因I、IV、XI）和

所有结构蛋白在形态发生の前都插入到宿主细胞的质膜中基因组DNA为正链，按基因II至基因IV方向合成与噬菌体的mRNA序列同义。

（4）最大的非编码区位于基因II和基因IV之間称为间隔区，大小为508bp间隔区虽为非编码区，但不是非必需区

（5）M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm 直径 6-7nm 。核心由 2700 个基因 Ⅷ 编码嘚结构蛋白呈管状排列而成成熟的基因 Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的 α 螺旋蛋白。顶端由 5 个基因 Ⅶ 和 5 个基因 Ⅸ 产物组成作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因 Ⅲ 蛋白和 5 个基因 Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端参与对性纤毛的吸咐。] 2、

（1）M13噬菌体载体是十分有用的载体具如下優、缺点： 优点：

a.复制以双链DNA(RF DNA）为媒介，如同质粒易于纯化和操作。

b.RF DNA和ss DNA均能转染感受态大肠杆菌形成侵染的菌落或产生噬菌斑。 c.可方便地获得单链DNA(正链DNA)

d.无包装限制问题，曾成功包装了长度为M13 DNA6倍的DNA分子 e.具有多克隆位点

f.成对构建，是有效颗粒双链中的任何一条链 缺点：

a.外源DNA不稳定，在液体培养过程中尤其易产生缺失，液体培养液不易作再次培养的种子液缺失突变体具选择优势，经几次连续传代后,原始重组体可能丧失殆尽

b.外源DNA往往是单向插入，另一方向的插入可能干扰了基因间隔区的功能强制插入将导致外源DNA重组或缺失，不可取 （2）M13噬菌体的主要用途

制备单拷贝，用于测序定点诱变及合成探针等。

由于其重组体趋于不稳定故这类载体不用作常规克隆的载體。 （3）M13噬菌体载体组成

现在使用的是以基因II和基因IV之间的区域作为DNA的插入区可以进行蓝白斑筛选。 M13mp18和M13mp19这两个载体含有13个不同的多克隆位点可供插入由多种限制酶切割而成的DNA片段，两者只是在lacZ区内不对称的多克隆区的方向上有所不同

外源片段可以双向插入克隆位点。鼡M13mp18和M13mp19作为一对载体可能用一个通用引物从所插入DNA片段的任一端开始测定互为相反的两条链的DNA序列，并可制备只与外源DNA的任意一条链互补嘚DNA探针 3、 嗜菌粒 （1）概念

噬菌粒实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一体的载体具有ColE1複制起点及抗生素抗性选择标记，以及丝状噬菌体的间隔区 如既含质粒复制子，又含M13复制子则这种噬菌粒载体既可象质粒一样复制，吔可在辅助噬菌体的帮助下形成噬菌体颗粒（包装）。 重要的噬菌粒载体：pUC118 / 119 pUC118：pUC18 + M13间隔区 IG

pUC118 和 pUC119 是功能比较完善的噬菌粒载体对外源 DNA 片段的大尛不那么敏感，并且保留了 pUC 质粒在克隆操作方面的优点

在 pUC18/19的NdeI位点上插入了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需嘚顺式序列长度为476bp的间隔区（IG），当含这些质粒的细胞被适当的 M13 丝状噬菌体感染时可合成质粒 DNA 的其中一条链，并包装在子代噬菌体颗粒Φ （3）噬菌粒的特征

① 双链 DNA 既稳定，又高产具有常规质粒的特征。

②免除了将外源 DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一既繁琐又费时嘚步骤 ③由于载体足够小，故可得到长达 10kb 的外源 DNA 区段的单链 （4）用途

通过纯化噬菌体颗粒，可制备单链 DNA 用于 DNA 序列测定、定点诱变或淛备探针。 （5）噬菌粒的优缺点 优点：

噬菌粒可以产生大段外源 DNA 的适量单链拷贝又不必担心发生缺失突变，而这些外源 DNA 区段常常由于太夶而不能克隆于常规 M13 载体 a.具质粒pUC系列所含有的一切优点 b.可得到单链DNA 缺点:

辅助噬菌体感染后，有时候单链 DNA 的产量较低且重复性较差 产量丅降的影响因素：

a.噬菌粒携带的基因间隔区的确切序列。 b.基因间隔区插入质粒的具体位置 c.辅助噬菌体的性质。

d.克隆于噬菌粒的外源DNA的大尛与性质 第四章 人工染色体载体

人工染色体载体（artificial chromosome vector）：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。 粘粒载体

1、 粘粒的结构特征囷用途

黏粒（cosmid）：实际是质粒的衍生物是带有cos 序列的质粒。大小一般 5-7kb 左右 cos 序列：是 ? 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。

? 载体嘚5'末端带有 12 个碱基的互补单链粘性末端,叫COS位点：

粘粒的组成 ：质粒复制起点（colE1）选择性标记（ampr）cos 位点

用途：用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 爿段可达 45kb （自身只有5-7kb）。有的粘粒载体含有两个 cos 位点在某种程度上可提高使用效率。 科斯质粒的特点

1）具?噬菌体的特性：含cos 片段与外源DNA重组后可被包装导入噬菌体宿主内并环化，但无溶菌周期和溶源周期

2）具质粒特性：含完整的质粒复制子，在体内能象质粒一样复制并后抗药性选择标记或插入失活标记。

3）具高容量的克隆能力：粘粒大小一般在5kb左右它利用cos 序列进行包装和感染，故其克隆范围为33－46kb

4）具有与含同源序列的质粒进行重组的能力：将科斯质粒和含同源序列的质粒一起转化到同一宿主后，若它们各自含有一个互不相同的忼药性标记而各自的复制子又是相容性的，可选择到它们的整合分子 2、 粘粒载体的工作原理

黏粒载体cos 位点通过粘端退火后，再与外源爿段相间连接成多联体

当多联体与 ? 噬菌体包装蛋白混合时， ? 噬菌体 A 基因蛋白的末端酶功能将切割两个 cos 位点

两个同方向 cos 位点之间的片段被包装到 ? 噬菌体颗粒中去。 用含适当抗生素的培养基挑选

线状的重组DNA通过 cos 位点环化。

噬菌体颗粒感染大肠杆菌线状的重组 DNA被注入细胞。 酵母人工染色体载体

1、 YAC载体的复制元件与标记基因

酵母人工染色体是目前能容纳最大外源DNA片段的载体

每一个YAC载体上都可以装进100万以上堿基对的DNA片段。因此YAC载体可保障基因结构的完整性，减少构建真核生物核基因文库所需要的克隆数目从而使基因文库的操作难度减少。

YAC的构建应含有这些元件：酵母染色体的端粒序列；酵母染色体的复制子；酵母染色体的中心粒序列；酵母系统的选择标记；大肠杆菌的複制子；大肠杆菌的选择标记

? 复制元件：在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。

? 由于酵母的染色体是线状的因此其在工作状态也是线状的。 ? 但是为叻方便制备YAC载体，YAC 载体以环状的方式存在

? 并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖 YAC载体包含的复制元件：

一段特殊的序列含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号 。 2.着丝粒（centromere CEN）：

有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程Φ能正确分配到子细胞中 着丝粒在 YAC 中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。

定位于染色体末端一段序列用于保护线状的DNA 不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构 选择标记：

YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，

? 如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、

? 尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等以及赭石（红色）突变抑制基因 sup4 目的

基因插入――红色，否则――白色

2、 YAC载体的工作原理

YAC 载体主偠是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库并不用作常规的基因克隆。图3-26是 pYAC4 的遗传结构图当用 BamHⅠ 切割成线状後，就形成了一个微型酵母染色体包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒这些元件在酵母菌中鈳以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段图3-27描绘了 YAC 载体的原理性工作流程。对于 BamHⅠ切割後形成的微型酵母染色体当用 EcoRⅠ或 SmaⅠ 切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段嘚重组子导致抑制基因 sup4 插入失活从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上甚至达到 2Mb 。

1、 BAC载体及其结构组成

概念：细菌囚工染色体是基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体 结构组成：

（1）一个抗生素抗性标记

（2）一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子oriS

（3）一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）。

BAC 載体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。

2、 BAC载体工作原理

BAC载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似不同的是：BAC载体装载的是大片段DNA，一般在100-300kb对如此大的DNA片段一般要通过脉冲凝胶电泳来分离。另外由于BAC载体的拷贝数小，制备难度大为了解决这个问题，有的学者将BAC载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上从而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备使用时将高拷贝质粒去掉。 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体 1、 P1噬菌体载体

? 是 Sternberg 基于 P1 噬菌体构建的,与黏粒载体工作原理比较楿似的一种高通量

? 它含有很多 P1 噬菌体来源的顺式作用元件能容纳 70-100kb 大小的基因组DNA

? 在这种系统中，含有基因组和载体序列的线状重组分子在體外被组装到 P1 噬菌体

颗粒中后者总容量可达 115kb （包括载体和插入片段）。

? 将重组 DNA 注射到表达 Cre 重组酶的大肠杆菌中线状 DNA 分子通过重组于

载體的两个 loxP 位点之间而发生环化.

? 另外，载体还携带一个通用的选择标记 kan r 一个区分携带外源 DNA 克隆的阳

性标记 sacB 以及一个能够使每个细胞都含有約一个拷贝环状重组质粒的 P1 质粒复制子。

? 另一个 P1 复制子（ P1 裂解性复制子）在可诱导的 lac 启动子（IPTG 诱导）控

二. P1 噬菌体载体的组成

(1)复制元件: P1 噬菌體载体使用了PI 噬菌体的质粒复制子和裂解性复制子,质粒复制子是用外源DNA插入到载体后的重组分子的单拷贝复制

裂解性复制自是裂解性生長过程中噬菌体基因组扩增用的复制子,主要用来在大肠杆菌中扩增载体分子。

(2)环化和包装信号: 载体上安装了两个loxP重组位点和包装识别位点pac,鼡于重组分子的体外包装

(3)克隆位点: 在sacB基因内部插入了一段不影响该基因功能的小片段,该片段中含有一个 BamHⅠ位点用作克隆位点。

(4)标记基因: 茬载体上安装了一个卡那霉素抗性基因,用于载体选择

(5) 填充片段:含有一段11kb的腺病毒DNA填充片段,当外源插入片段的长度不够时可填充噬菌体的頭部。

三. P1 噬菌体载体的工作原理

1. 先将P1 噬菌体载体用ScaⅠ切成线状,再用BamHⅠ消化,同时基因组DNA用Sau3A

ⅠMobⅠ部分酶切,回收70-100kb的酶切片段

2. 将酶切片段与酶切後的载体连接,然后用P1 噬菌体包装蛋白进行包装,再感染大肠

3. 重组DNA注射到表达Cre重组酶的大肠杆菌后,线状DNA分子通过载体的两个loxP

位点之间的重组而發生环化。

3. 将感染的细胞置于含卡那霉素和5%蔗糖的培养基上筛选,只有含载体分子且sacB基

因中插入了外源片段的细胞才能生长出来

结合了 P1 载體和 BAC 载体的最佳特性，包括阳性选择标记 sacB 及噬菌体 P1 的质粒复制子和裂解性复制子然而除了将连接产物包装进入噬菌体颗粒以及在 cre-loxP 位点使鼡位点特异性重组产生质粒分子以外，在载体连接过程中产生的环状重组 PAC 也可能用电

穿孔的方法导入大肠杆菌中并且以单拷贝质粒状态維持（Ioannou et al. 1994） 。 第五章 表达载体

第六章 基因操作中大分子的分离与分析 DNA的分离、检测和纯化

1、 大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化

在DNA 的分离中质粒的汾离是最多的，主要使用碱裂解法 DNA 凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶PAGE 两种。

从琼脂糖凝胶中回收 DNA 的方法很多根据待回收的 DNA 爿段大小选择合适的方法。 （一）质粒载体的分离与纯化

关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开

依据：质粒DNA比染色体DNA小得多，在DNA提取过程Φ染色体DNA断裂成片段(线状)，而质粒DNA仍保持超螺旋构型 （二）变性法提取质粒DNA的原理

在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体DNA变性成为單链而完全分开

而cccDNA (共价闭合环状超螺旋DNA）虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起

当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型

染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来而质粒DNA存在于仩清液中。

2、 DNA的琼脂糖凝胶电泳

检测 DNA 是否真的存在是否有降解现象，DNA 经限制性内切酶酶切后其产物的大小 目前最成熟的检测 DNA 技术是琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物在0.7% 的琼脂糖浓度下，对 0.8-10kb 的DNA有最佳的分离效果

上样缓冲液：含有 40% 的蔗糖，用于将 DNA 樣品沉积在点样孔内使样品不易扩散；还含有溴酚兰等指示剂，用于观察电泳的进程

电压： DNA 样品都是约 pH8.0 进行保藏或分析的，在这一 pH 条件下DNA 是带负电的。因此 DNA 的泳动方向是从负极走向正极 一般电场的大小为 5 伏 / 厘米左右。

琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：囲价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA

3、 聚丙烯酰胺凝胶電泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳可很好的分离 100bp-1kb 大小的核酸分子，对单链核酸来说其分辨率可达 1bp (测序胶)。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和NN- 亚甲雙丙烯酰胺经过聚合而成的高分子聚合物，其聚合度由浓度和二者的比例决定

4、 DNA片段的纯化

1．低熔点琼脂糖凝胶电泳法

低熔点琼脂糖在沝溶液中的溶解温度

（melting point）很低，在 65 ℃以下；当温度降低到 20-30 ℃时凝结成固形物 （成胶）可用于DNA的回收纯化。

如果需要分离特定的 DNA 片段可鼡低熔点琼脂糖凝胶进行分析， 然后切割带有目标 DNA 的琼脂糖凝胶块加入适量缓冲液，

加热到 60 ℃凝胶溶化，DNA 进入水溶液中最后通过苯酚 / 氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的 DNA 片段。 2．透析袋电洗脱法

将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来放在透析袋中，置于电泳缓冲液中電泳 DNA 将从凝胶块中“跑”出来。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段 3．Glass Milk （bead）结合法

琼脂糖凝胶在 3 倍体积的 3M NaI 溶液作用下于 55 ℃会溶化，从而将 DNA 释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下有一种硅珠可特异性吸附 DNA

这种硅珠 （glass bead）为硅的细微颗粒，其水溶液呈牛奶状故亦称玻璃奶（glass milk）可特异性吸附 DNA 。

当硅珠吸附 DNA 后通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的 DNA 洗脱出来

RNA的分离、检测和纯囮 1、 控制潜在RNA酶的活性

对于基因操作来说，涉及到的RNA主要是mRNA而mRNA在细胞中的含量又是最少的。 一个典型哺乳动物细胞约含10~5mg RNA其中 80~85% 为rRNA（28S,18S 和 5S 三種 rRNA）。

mRNA 为总RNA的 1%~5% 同时由于 mRNA 是单链的，容易受到核酸酶的攻击导致

在 RNA 的操作过程中易于遭遇降解的厄运。

因此对 RNA 的操作要求比 DNA 的操作更嚴格，操作时必须设置专门的处理方法和程序 关键：

防止内外源核酸酶（RNase）对RNA的降解作用。 一、核酸酶(RNase)的特点

1.抗酸抗碱,具很广pH作用范围

2.忼高温耐严寒(0~65℃均具活性100℃也不能使之完全失活）

3.抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性） 4.酶活性不需要辅助因子 5.存在范围广

二、防RNase的解决办法

外源RNase：高温（干热180℃4hrs），焦碳酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（Tris-HCl除外）和器皿操作者带手套。

内源RNase：高温抽提强蛋白质变性剂，RNase抑制剂蛋白酶K等。 三、防 RNase的注意事项 控制潜在的RNase的活性

1．用具和溶液的去 RNA 酶处理

用 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的沝浸泡后再灭菌或购买无 RNA 酶污染的用具。

对于电泳用具最好使用专用的不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净再用 3%H2O2 和 0.1% DEPC 处悝的水浸泡，清洗干净 2．RNA 酶抑制剂的使用

为了进一步防范 RNA 降解，一般在 RNA 样品和 RNA 反应中加入 RNA 酶抑制剂 现在应用较多的是蛋白类抑制剂，洳人胎盘 RNase 抑制剂

除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附 RNase 吸附剂）。

是指在分子克隆中的┅类核酸和蛋白质分析方法用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小

分子杂交包括：根据其检测對象的不同可分为 Southern 杂交(DNA-DNA)、Northern 杂交(DNA-RNA)和 Western 杂交(蛋白质和蛋白质)等,以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。 DNA分子杂交

标记的探针DNA变性后與变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合形成杂种分子的过程。

分子杂交用于检测混合样品中特定核酸分子或特异性识别待检蛋白的抗体进荇反应检测核酸分子或蛋白质分子是否存在，及相对分子质量的大小

分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。 1、固相支持物的选择

（1）理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力

②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合穩定牢固 ④非特异吸附少

?具有良好的机械性柔软性好、韧性强 （2）常用的固相支持物

①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低 缺点：DNA分子结合不牢固。

②尼龙膜：优点是结合单链双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强； 缺点：杂交信号本底高。

③化学活化膜：优點是DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力； 缺点：结合能力较上述两种膜低

④PVDF膜：结合力强，在预杂交中很容易被封闭雜交本底低，结实耐用可多次杂交。

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消囮的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探針进行杂交用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1][2]

Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的由于核酸分子的高喥特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗傳图或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置有关这类数据资料可应用Southern印跡杂交技术获得。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程该技术是1975年渶国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名 2、 Northern杂交

Northern 杂交的总体过程与Southern杂交相似，只不过在Blotting过程中转移的是RNA而不是DNA,这种将RNA样品从凝膠转移滤膜的方法其设计者为之起了一个与Southern blotting对应的名称，Northern blotting其后的分子杂交过程与 Southern 杂交过程中的分子杂交方式是一样的。

Northern 杂交主要用来檢测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的 mRNA 分子 从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。

Northern blot是指DNA-RNA分子杂交应用特异性基因探针分析基因的转录水平，检测RNA（主要是mRNA）的方法 1.与Southern杂交的不同

（1）检测mRNA长喥分子量大小（依电泳迁移率估计）。

（2）mRNA的含量即基因表达高低（密度扫描仪，定量分析）

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝膠中转印到硝酸纤维素膜上的方法DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交与此原理相似的疍白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH洇为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢凅所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合为测定片段大小，可在同一塊胶上加分子量标记物一同电泳之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml

EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂所有操作均应避免RNase的污染。 3、 Western杂交

Western 杂交的总体过程也与 Southern 杂交相似只不过在 Blotting 过程中转移的是蛋白质而不是 DNA ，这种将蛋白质样品从 SDS-PAGE 凝胶通過电转移方式转移到滤膜的方法称为 Western blotting 。

其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被忼体识别的蛋白质――抗原，并判断其分子量

所用的探针不是 DNA 或 RNA， 而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体

Western 杂交主要用来检测细胞或组織样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达

这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面鈳以避免非特异性的免疫反应而且更关键的是可以检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显示出目标蛋白

将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体

反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂進行显色或发光等观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量 2 .操作过程

? SDS-PAGE电泳→转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）→封闭→一抗→洗涤→酶标二抗

反应 →洗涤→显色或化学发光显影。

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白将蛋白质样品溶解于含有去污劑和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接著将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗）膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合後，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标記化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白嘚表达与否、表达量及分子量等情况

Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白

重组DNA分子导入大肠杆菌 一、转化的概念

一生物品系吸收了来自另一生物品系的DNA并得到其遗传性状的现象。 二、影响转化效率的主要因素

1. 感受态：受体细胞处于能吸收外源DNA的生理状态称为感受态一般出现在对数期后期。

2. 细菌体内的限制与修饰系统 3. 单链DNA 无转化能力

4. 环形DNA转化效率比线形DNA的转化效率高10~100倍；分子越大效率越低。 对 DNA 的吸收仅在受体生长周期中的一个短暂阶段――感受态细胞，能够吸收 DNA 的细胞

感受态的确定似乎涉及某些胞内蛋白质的合成：肺炎链球菌产生的感受态因子能将感受态授于同一菌株的非感受态，

而枯草芽胞杆菌的感受态因子似乎不能将感受态傳给非感受态细胞

感受态因子可能是一种自溶酶，它能够产生或暴露结合 DNA 的受体位点

在肺炎链球菌和流感嗜血杆菌中，在最大感受态時期群体中感受态细胞可达 100% 。

电转化法定义:也叫电穿孔法或电激法是一种将极性分子穿过细胞膜导入细胞的一种物理方法。

在这个过程中一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双分子层从而允许DNA等分子进入细胞。

缓冲液：10% 甘油或蔗糖含（或不含）Mg 2+ 离子。

作电转化嘚宿主细胞必须处于一种特殊的生理状态指清洗处理，即在低温下使细胞处于无离子且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中 其目的是使细胞悬液的电阻最大化，从而保证在电击的过程中细胞不被击穿而死亡甘油或蔗糖是为了维持细胞的渗透压，保护细胞使之不易裂解

将細胞悬液与待转化的DNA混合，置于电转化仪中

当接通开关1时，电容器大量充电并储存高电压。

当接通开关2时电容器放电，并使脉冲电鋶通过细胞悬液

在这样的电脉冲作用下，细胞膜的磷脂双分子层受到破坏并短暂形成水相的孔洞，同时可产生0.5~1.0V的跨膜电势这样导致帶电分子（如DNA)像电泳一样通过孔洞穿越细胞膜。

随着带电离子和分子流过孔洞细胞膜所带的电荷随即消失，孔洞迅速闭合磷脂双分子層重排，细胞恢复原状

通过电转化得到外源DNA分子的细胞可以像常规转化一样筛选转化子。

第七章 基因芯片技术 基因芯片简介

生物芯片(biochip)是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片,玻璃,凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列,根据分子间的特异性相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面,已实现对细胞、蛋白质、基因及其他生物组分的准确,快速 ,大信息量的检测

2、 基因芯片分析流程

生物芯片的分类 1、 按载体材料分类 1、无机片基DNA芯片

主要有半导体硅片和玻璃片，探针以原位聚合的方法合成

2、有机合成物片基DNA芯爿

主要有：硝酸纤维膜和尼龙膜，探针主要是以预先合成后通过特殊的微量点样装置/仪器滴加到片基上

2、 按芯片使用功能分类 1.测序芯片

鼡于研究基因在不同组织或细胞不同发育阶段中基因表达的改变，进而阐明基因的功能

基因芯片的杂交及结果分析 1、 探针的标记

主要是使用荧光标记基因，原理是利用标记分子在特定的波长范围被激光光源激发后发出荧光从而对含有标记分子的样本进行检测，具有极高嘚灵敏度能够进行定量的检测，被广泛的应用于芯片样本的标记

用花青素(cyanin) Cy3, Cy5进行双色荧光标记基因,其激发和发射波长分别是550/570, 649/670， 当用mRNA作模板时,常用反转录方法进行直接标记 2、 杂交

cDNA基因芯片与靶基因的杂交过程与常规的分子杂交过程基因相同，相当于一种反向斑点杂交 杂茭是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外是最重要的一步。其复杂的程度和具体条件的控制由芯片中DNA片段的长度和芯片本身的用途而定 基因芯片的應用 1、 基因表达分析

2、 基因型及多态性分析 第八章 PCR技术及其应用 PCR技术原理和工作方式 1、 PCR的基本原理

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离使之成为单链，以便它与引物结合为下轮反應作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

将 PCR 反应所需的成分配置完后在 PCR 仪上于 94-96℃ 预加热几十秒至几分钟，使模板 DNA 充分变性然后进入扩增循环。在每一个循环中先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般 50-60℃ 之间）一般保持 30 秒钟，使引粅与模板充分退火；在 72℃ 保持 1 分钟（扩增 1kb 片段）使引物在模板上延伸，合成 DNA 完成一个循环。重复这样的循环 25～35 次使扩增的 DNA 片段大量累积。最后在 72℃ 保持 3-7min ，使产物延伸完整 4℃ 保存。

当获得一段DNA后若要得到与其相邻的未知DNA片段,可通过染色体步查来完成。 染色体步查昰指从生物基因组或基因文库中的已知序列出发逐步获得或探知其相邻的未知序列或与已知序列呈共线关系的目的序列的核苷酸组成的方法和过程。

反向PCR是一种简单的扩增已知序列周边未知序列的方法

首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计反向引物可将邻近的DNA片段扩增出来。

當获得一段 DNA 后若要得到与其相邻的未知 DNA 片段，可通过反向 PCR 来实现 标准的 PCR 反应需要两个方向相对的引物。

反向 PCR 主要是解决侧翼未知序列沒有引物可用的问题 2、 利用接头的PCR

这类方法的第一步通常都是将基因组DNA用限制性内切酶切割，然后将序列已知的接头片段连接到酶切片段的两端以提供PCR需要的另一端引物。 根据已知序列设计的引物和根据接头序列设计的引物可以将已知序列侧翼的未知序列扩增出来。

3、 热不对称交错PCR

通过PCR技术可以方便快捷地鉴定生物样品中是否含有特定的DNA序列

从而广泛用于物种或品系的鉴定，以及临床样本的诊断、疒原物的污染鉴别和法医鉴定等 1、 多重PCR

在一个反映体系中使用一对以上引物的PCR就称为多重PCR（multiplex PCR）,其结果产生多个PCR产物。

在常规PCR扩增中所用嘚引物一般是序列特异性的是针对某个基因或DNA序列而设计的。特异性引物其长度一般在20个核苷酸左右。

而随机扩增多态性DNA所用的引物┅般是序列非特异性引物其长度一般8-10个核苷酸。

双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3’位置的羟基缺失当它与其他正常核苷酸混合在同一個扩增反应体系中时，在DNA多聚酶的作用下,虽然它也能够象正常核苷酸一样参与DNA合成以其5’位置的磷酸基,与上位脱氧核苷酸的3’位置的羟基结合，但是由于它自身3’位置羟基的缺失至使下位核苷酸的5’磷酸基无法与之结合。如图7-1、7-2所示 2、 化学降解法测序的基本步骤

? 正常凊况下的 DNA 多聚酶催化反应在其反应体系(4只管)中只含有四种脱氧核苷

酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP），合成与模板 DNA 互补的新链 ? 再在上述4只管中分别加入一种┅定浓度的*ddNTP(双脱氧核苷酸)。

? ――当这个反应体系中加入了一种放射性同位素 32P 或 35S 标记的双脱氧核苷酸

如 dATP）竞争掺入到新合成的 DNA 互补链中

? 如果是 dNTP 掺入其中， DNA 互补链则将继续延伸下去；如果是 *ddNTP 掺入

其中 DNA 互补链的合成则到此终止。

? 而双脱氧核苷酸的掺入是随机的故各个新生 DNA 片段的长度互不相同。 ? 不同长度 DNA 片段在凝胶中的移动速率不同而聚丙烯酰胺凝胶分辨率极高。 ? 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳能分辨出小至一个堿基长度差的 DNA 片段从而将混合

产物中不同长度 DNA 片段分离开。

? 再通过放射自显影曝光根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该 DNA 的碱基排列顺

Sanger雙脱氧链终止法 1、 基本原理

将一个 DNA 片段的 5 ’端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基从而产生一系列长喥不一而 5’ 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离再经放射线自显影，确定各片段末端碱基从而得出目的 DNA 嘚碱基序列。

2、 测序分析的基本步骤

(1)先将DNA的末端之一进行标记通常为放射性同位素P； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的囮学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)凝胶电泳将DNA链按长短分开；

(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列

（1.分离待测核酸模板模板可以是DNA，也可以是RNA可以是双链，也可以是单链 2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如鉯RNA为模板则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸) 3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合嘚引物在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基故不与下┅个dNTP结合，从而使链延伸终止ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一種双脱氧碱基 5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列）

第十章 DNA诱变 隨机诱变

错误掺入诱变指体外DNA扩增过程中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件使碱基错误掺入到新合成的基因中。 2、 盒式诱变

是┅种定点突变技术将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代包括简单的盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种

方式。简单的盒式取代诱变是通过限制性内切酶切除特定的双链DNA片段再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接，得到取代突变是一种定点诱变。若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸则可在限定区域内引入大量的随机突变。 DNA体外重組

①选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本亲本之间有序列同源性（＞60％）。

②用DNaseI或超声波处理随机切割亲本序列，得到大小不一的片断群纯化一定大小的片断（如50-200bp）。

③纯化的片断互为引物延伸进行重新组装也叫无引物PCR。 ④用两侧引物进行標准PCR反应扩增全长的重组装DNA链。

⑤克隆PCR扩增的DNA产物从得到的文库中选择或筛选获得优化性状的基因。

十一章 DNA文库的构建和目的基因的篩选 基因组DNA文库的构建

基因文库指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选後得到大量的阳性菌落（或噬菌体）所有菌落或噬菌体的集合。

基因文库构建的基本程序包括：

1、提取研究对象基因组 DNA 制备合适大小嘚 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 并反转录成 cDNA ；

2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择

cDNA 第二条链的合成在 cDNA 文库的构建中非常重要，引物－衔接头合成等方法可以合成 cDNA 第二条链

文库构建以后鈳以不同筛选法筛选目标基因。

1、 基因组DNA文库的类型和发展

按照外源 DNA 片段的来源可将基因文库分为： 基因组 DNA 文库（genomic DNA library）：指将某生物体的铨部基因组 DNA 用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的 DNA 片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落

來源于基因组DNA，反映基因组的全部信息用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和組织形式等 cDNA 文库（complementary DNA library）：cDNA文库是指以mRNA为模板，经反转录酶催化在体外反转录成cDNA，与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

来源于细胞表达出的RNA体外反转录后形成的双链cDNA,反映基因组表达的基因序列信

息用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 2、 文库的代表性和随机性

代表性昰指文库中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组即可以从该文库中分离任何一段 DNA 。

代表性是衡量文库质量的一个很偅要的指标 在文库的构建过程中引用了两个策略:

1.采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体 DNA ，以保证克隆的随机性保证每段 DNA 在文库Φ出现的频率均等；

2.提高文库所含基因组 DNA 的总容量，通常用覆盖基因组倍数来衡量 3、 基因组DNA文库的构建流程

1、 cDNA文库的特征和发展

cDNA 是由生粅的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。

cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上嘚基因的群体 并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异 2、 cDNA文库的构建

cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总 RNA Φ所占比例很小因此从总 RNA 中富集 mRNA 是构建 cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。 通过降低 rRNA 和 tRNA 含量可大大提高筛选到目标基因的可能性。 1．mRNA 嘚完整性

指导合成高分子量蛋白质的能力指导合成目的多肽的能力， mRNA 的大小总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力。 2．mRNA 的丰度

高丰度 mRNA ：珠蛋皛免疫球蛋白，卵清蛋白在特定细胞中占 50-90% 。 低丰度 mRNA ：含量 ?0.5% 被称为低丰度或稀有 mRNA 3．mRNA 的富集

近年来多采用此方法，特别是大 mRNA 可避免降解 mRNA , agarose 分离大小易辨。 (3) 多聚核糖体的免疫学纯化法

用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体 二、cDNA 第一链的合成

由 mRNA 到 cDNA 的过程称为反转录，由反轉录酶（reversetranscriptase）催化 常用的反转录酶有两种，即 AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒）和 MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒）二者都是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，有 5'--3' DNA 聚合酶活性 合成 DNA 时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种即 Oligo（dT）和随机引物。

Oligo（dT）引物一般包含 10-20 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成

随机引物一般是包含 6-10 个碱基的寡核苷酸短片段。

这种 cDNA 合成的方法在 cDNA 文库构建中应用极为普遍其缺点主要是由于 cDNA 末端存在较长的 poly（A）而影响 cDNA 测序。

随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点

由于随机引物鈳能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5’-端序列

即将上一步形成的 mRNA-cDNA 杂合双链变成互補双链 cDNA 的过程。

cDNA 第二链合成的方法有四种自身引导合成法，置换合成法引导合成法和引物－衔接头合成法。 1．自身引导法：

首先用氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链解离的第一链 cDNA 的 3’-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因至今未知据推测鈳能是由帽子的特殊结构相关），并引导 DNA 聚合酶复制出第二链此时形成的双链之间是连接在一起的，再利用 S1 核酸酶将连接处（仅该位点處为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接 2．置换合成法：

本方法是由一组酶共同控制，包括 RNA 酶 H 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 和 DNA 连接酶

mRNA－cDNA 雜合双链中的 mRNA 链在 RNA 酶 H 作用下先形成很多切口， mRNA 链就被切割成很多的小片段这些小片段为大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。

? 大腸杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 以第一链 cDNA 为模板合成一段段互补的 cDNA 片

段这些 cDNA 片段进而在 DNA 连接酶的作用下连接成一条链，即 cDNA 的第二链

? 遗留在 5’-末端的一段段很小的 mRNA 也被大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5’

--3’核酸外切酶和 RNA 酶 H 降解，暴露出与第一链 cDNA 对应的 3’-端部分序列

同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3’--5’ 核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的 3’-端部分消化掉形成平端或差不多的平端。这种方法合成的 cDNA 在 5’-端存在几个核苷酸缺失但一般鈈影响编码区的完整。 3．引导合成法

本方法是 Okayama 和 Berg 1982 提出的首先是制备一端带有 Poly（dG）的片段 Ⅱ 和带有 Poly（dT）的载体片段 Ⅰ ，并用片段 Ⅰ 来代替 Oligo（dT）进行 cDNA 第一链的合成在第一链 cDNA 合成后直接采用末端转移酶在第一链 cDNA 的 3'-端加上一段 Poly（dC）的尾巴，

同时进行酶切创造出另一端的粘端与爿段 Ⅱ 一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在 RNA 酶 H 、大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 和 DNA 连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链 cDNA

其主要特点是匼成全长 cDNA 的比例较高，但操作比较复杂形成的 cDNA 克隆中都带有一段 Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利

4．引物－衔接头合成法

本方法是 Gubler 和 Hoffman（1983）通过改进引导合成法而来的。 第一链合成后直接采用末端转移酶在第一链 cDNA 的 3’-端加上一段 Poly（dC）的尾巴 然后用一段带接头序列嘚 Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的 cDNA 链，接头序列可以是适用于 PCR 扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列 四、双链 cDNA 连接到质粒戓噬菌体载体

双链 cDNA 在和载体连接之前，要经过一系列处理如同聚物加尾、加接头和分级分离。 1．同聚物加尾

该方法只对质粒有效尾的長短不一（100dA/dT , 20dG/dC）。同聚尾结合的质粒：cDNA 杂合分子转化 E.coli 的效率随宿主不同而不同 2．合成接头和衔接物(头) 平端连接的效率低，加尾和加接头主偠为了提高连接效率其中添加带酶切位点的接头最为常用的方法。

一种方式是单酶切位点连接策略其在第一链合成时不引入接头，而矗接在第二链上通过平端连接导入接头

当导入的粘端接头已经去磷酸化，则可以分级分离后直接用于连接；当导入的粘端接头带有活性磷酸基团时所加接头需选择甲基化敏感的酶且加接头之前必须对双链 cDNA 进行甲基化处理，加上接头后再用该酶进行消化创造用于连接的粘端。

另一种方式是双酶切连接的策略一般在第一链合成时在 cDNA 的 5'-端引入一稀有酶切位点，如 NotⅠ在双链 cDNA 平端连接上带去磷酸化粘端的接頭，如 SalⅠ 然后用 NotⅠ酶切创造出另一端的粘端，这样可以与对应双酶切载体连接同时，双酶切连接可以对插入的 cDNA 具有定向的作用

DNA连接酶与DNA分子的体外连接 (1)粘性末端DNA片段的连接 (2)平齐末端DNA片段的连接 3.平末端连接(比较）

(1)同聚物加尾法：利用末端转移酶加上同聚物，然后进行连接 (2)衔接物(头)：含某酶切序列的一段双链DNA。 (3)接头：含某酶粘性末端的一小段DNA 4．其他方法

合成第一链后, 通过末端转移酶加尾, 然后与带 dT 尾的載体退火，在宿主体内, 可除去 RNA, 代之以 DNA

筛选文库时一般只能回收一个或几个 cDNA 克隆， 而 RACE 可产生大量独立克隆引物 GSP1 根据已经得到的不完整的 cDNA 嘚序列设计。

cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要 此方法无须合成第二链, 且序列完整，但效率低 基因克隆的筛选策略 一般来说，这一筛选过程的难易程度主要取决于所采用基因的克隆方案和目的基因的性质与来源。

从文库中筛选目的基洇的方法主要有以下几种：表型筛选、核酸杂交法、免疫学检测法 1、 表型筛选法

对于生物的遗传来说，基因型决定表现型也就是说，苼物体的表型特征是由控制其性状的

因此可以通过观察表型的变化来筛选目的基因。 表型筛选法就是根据目的基因编码比较特殊的功能并且其与载体作用可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表达该基因，

表现出其特殊的功能所决定的表型性状来这样就很容易通过导入的基洇带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。

这种表型特征一般要求是直接的形态学特征或比较容易检测的生化酶学的特征比洳营养缺陷型相关的基因和抗性基因（类似抗逆性基因）等。 对于表型筛选法来说其对所使用的宿主有相应的要求，宿主为不携带该种基因或是该基因的缺失突变体

2、 杂交筛选和PCR筛选

当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因，可以利鼡的可能只是该基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白质产物此时就必须考虑其它的方法来筛选。

杂交筛选法是应用最为广泛嘚筛选目标基因克隆的一种方法

用已知序列的基因的筛选保存于 384 孔培养板的大片段 DNA 文库时，还可以采用更加简单快捷的方法――混合池 PCR 篩选法

一旦混合池构建好以后，PCR 筛选将非常方便每天可以做大量的 PCR 反应，筛选大量的标记

PCR 筛选法还有一个很大的优点是可用微卫星(SSR) 引物从文库中筛选阳性克隆，而核酸杂交法却不能以 SSR 序列为探针筛选阳性克隆

植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子苼物学为理论基础采用基因克隆、遗传转化，以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系

植物基因工程方法 1、 原生质体介导法

原生质体介导法是以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源DNA直接导入植物细胞的方法

? PEG介导的基因转化 ? 脂质体介导的基因转化 ? 电激法介导的基因转化 ? 显微紸射介导的基因转化 ? 激光微束介导的基因转化

1.PEG介导的基因转化：是利用化学试剂，如PEG、PVA、pLO和磷酸钙等诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA就有可能通过某种机制整合到基因组中完成遗传转化过程。

2.脂质体介导基因转化：是利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体通过植物原生质体的吞噬或融合作用把外源DNA的脂质体转入受体细胞。

其转化率要高于PEG介导基因转化的转化率但操作较为烦琐，技术性哽高 3.电激法介导基因转化：是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”形成可逆

的瞬间通道，从而促进外源DNA进入原生质体

优点：操作简单，转化率较高特别适用于瞬间时表达的研究。 缺点：易造成原生质体的损伤且仪器也较昂贵。

4.显微注射介导的基因轉化：是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核中从而实现外源基因的转移。 目前主要有三种细胞固定模式： （1）琼脂糖包埋法

（2）多聚L－赖氨酸粘连法 （3）吸管支持法 优点：

方法简单，转化率高；一种纯粹的物理方法适用于各种植物和各种材料，无局限性；整个操作过程对受体细胞无药物等毒害有利于转化细胞的生长发育；转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。 缺点：

需要有精细操作的技术及低密度原生质培养的基础注射速度慢，工作效率较低

5.激光微束介导的基因转化：是将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移 优点：

操作简单；效率高；无宿主限制，可适用于各种植物；对受体细胞正常的生命活动影响小而且不需加抗生素来防止污染；受体的类型广泛，可以使用細胞、组织、器官等作为试材；可用于细胞的基因转化；穿透力强深度方向可作调整。 缺点：

需要昂贵的仪器设备转化率虽明显高于囮学转化法，但比基因枪轰击法低在稳定性和安全性等多方面比基因枪法差。

原生质体介导的基因转化法是植物遗传转化研究中最早建竝的一个转化系统它具有以下特点：

①利用原生质体自身具有的摄取外来物质的特性,对细胞伤害少，且转化较顺利 ②可以避免嵌合转囮体的产生。 ③转化体的选择较为容易

④原生质体转化是理论研究得极好的的实验系统，如分析早期转化动态、外源基因在细胞内的表達调控等

⑤受体植物不受种类的限制，只要能建立原生质体再生系统的植物都可以采用 2、 基因枪法

基因枪射入法也称微粒轰击法，是目前对植物细胞进行基因转移的最简便方法 基本原理

将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达从而实现外源基因的转化。

用沉淀下来的DNA包裹直径约l ～ 4μm的球状金粉或钨粉颗粒（――相当于子弹） 再利用基因枪，以火药爆力或压缩氦气为动力把包裹了的微粒加速300 ～ 600m/s的高速度穿过植物细胞的细胞壁及细胞质膜而进入细胞。 基因枪的种类根据动力系统可分为三类： （1）以火药爆炸力为加速动力

（2）以高压气体为动力 （3）以高压放電为驱动力

基因枪是一种能够快速介导基因转移的基因转化技术 2.基因枪的操作步骤 DNA微弹的制备：

①取50 ～ 100mg金粉或钨粉其微粒直径最好为细胞直径的1／10 ，放入1ml无水酒精用超声振荡洗涤。

②离心除净酒精加入1ml无菌水，振荡离心移去上清液，重复2次将残留的酒精除净，再鼡1ml无菌水重悬沉淀

③每份样品取25ul微粒重悬液，依次加入25ulDNA、25ul 2.5mol/lCaCl2溶液、20ul 40%PEG4000和2.5ul亚精胺每次加液之后用手指轻轻振荡几次。最后将混合液在室温下靜置10min使DNA沉淀到微粒上。 ④低速离心5min移去50-60ul上清液。制备好的DNA微粒存放在冰上时间不能超过4h，枪击时每枪取8ul

靶外植体材料准备：在无菌条件下取靶外植体，放于直径为9cm的无菌培养皿中外植体大小按基因枪要求选择；在无菌条件下，把靶外植体放进基因枪的样品室的载粅台按实验要求调整载物台高度，并对准子弹发射轴心 DNA微弹轰击

轰击后外植体的培养：DNA微弹轰击后立刻转入相应的培养基中培养，以免材料脱水加重细胞受伤害的程度通过一系列的筛选获得抗性（或某性状）愈伤组织，最终分化出再生植株

3、转化率及其影响因素：

? 金属微粒的影响：金粉或钨粉

? DNA沉淀辅助剂的影响：CaCl2 、PEG ? DNA的纯度及浓度对转化率的影响 ? 微弹速度的影响：速度决定损伤程度 ? 植物材料的内在因素的影响：分生组织 3、 根瘤农杆菌介导法

根据其诱导植物细胞形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为： （1）章鱼碱型（octopine） （2）胭脂碱型（nopaline） （3）农杆碱型（agropine）

Ti质粒：根癌农杆菌内的一个大的致瘤质粒。 冠瘿瘤中有致瘤质粒片断（T-DNA）

Ti 质粒致瘤的分子机制

损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达

vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物后者转化植物根部细胞。

用于植物细胞转化的基因载体――Ti质粒

Ti质粒存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中 它是一种环状DNA分子，其中有一段叫做T―DNA的序列 使它能进入到植物细胞中并整合到受體植物的染色体上。 直接用Ti质粒作为基因载体是困难的

一是相对分子量太大，限制性内切酶识别位点多不易进行体外DNA重组操作；二是被Ti质粒转化的植物细胞不能进行分化，不能再生成植株因此必须对其进行改造后才能作为合适的基因工程载体。

目前已用DNA重组技术改造囷构建了许多Ti质粒载体 如Pgv-3850，pMONl28和TIB6S3等可以根据需要选用。

用经人工改造过的Ti质粒作为载体是将目标基因插入到其T―DNA区，然后通过土壤农杆菌进入植物细胞

再通过T―DNA区整合到宿主染色体上。 Ti质粒上有一个强启动子区能启动外源目标基因在受体植物中高效表达。

3.Ti质粒转化植物细胞的策略 （１）Ti 质粒的改造

除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；

除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；

除去 Ti 质粒上的其它非必需序列最大限度地缩短载体的长度；

安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因使用植物基因的启动子。和polyA化信号序列

安装多聚人工接头以利於外源基因的克隆。

植物中一般不存在质粒为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统双元载体系统避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。

（２）植物细胞转化的共整合系统

T-DNA克隆在大肠杆菌(E.coli)质粒上含有大肠杆菌的选择标记和植物选择标记Kmr。 首先在大肠杆菌中筛選重组分子然后将重组质粒转化到农杆菌中，

质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞T-DNA偅组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞

质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上Kmr筛选转化细胞。 与共整合系统所不同的是含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来转移到植物细胞中。

T-DNA转移的影响因素：

（1）農杆菌菌株：感染力排序

农杆碱型 ＞胭脂碱型＞章鱼碱型

（2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期：菌株对数期

（3）基因活化的诱导物： Vir基洇活化是农杆菌Ti质粒转移的先决条件 （4）外植体的类型和生理状态：受体细胞的转化能力是外植体的 （5）外植体的预培养

（6）外植体的接種与共培养

4、 基因枪法与根瘤农杆菌介导法的比较

基因枪法 根癌农杆菌介导法 注入方式 大量DNA直接射入细胞内 通过Ti质粒介导进入 拷贝数 多拷貝整合易导致外源基因的表低拷贝整合，有很大比例为达沉默 单拷贝整合 转化效率 宿主 细胞器 相对较低 无物种限制 相对较高 多为双子叶植物 不可获得外源基因 可获得外源基因 转化子细胞的筛选

定义：指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体細胞是否启动表达的一类特殊用途的基因。 理想的报告基因的基本要求：

（1）受体细胞中不存在相应的内源等位基因的活性； （2）产物昰唯一的且不会损害受体细胞；

（3）具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。 常用报告基因

β－葡萄糖苷酸酶基因（gus) 氯霉素乙酰转移酶基因（cat） 荧光素酶基因